響應面法優(yōu)化鮮黃酒瓶內(nèi)發(fā)酵工藝

葛松濤，壽泉洪，韓文鳳，王 蘭，沙如意 ，王珍珍，胡普信，毛建衛(wèi)

（1.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院黃酒學院，浙江紹興 312000；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江杭州 310023；3.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興 312000；4.浙江科技學院，浙江杭州 310023）

黃酒是世界三大發(fā)酵酒之一，是我國所獨有的，以稻米、黍米、小米等為主要原料，經(jīng)加麥曲等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒[1]。由于黃酒的原輔料和采用獨特多菌種協(xié)同的雙邊發(fā)酵工藝，因此黃酒含有豐富的功能性成分，如多酚、多糖、多肽、γ-氨基丁酸等，使黃酒具有一定的調(diào)節(jié)腸道菌群、降血壓等保健功效[2]。黃酒獨特的原料和生產(chǎn)工藝，通過發(fā)酵過程中的微生物代謝、陳化儲存過程的生化反應[3]，賦予黃酒酸、甜、苦、鮮、澀的口感[4]，豐富且復雜的風味[5-6]?？诟信c風味對黃酒的質(zhì)量和風格起到重要的作用，也是影響消費者偏好的重要因素[1]。復雜的風味導致黃酒地域消費特征顯著，主要市場向江浙滬集中，年齡向中老年集中[7]。

通過引導消費的方式實現(xiàn)消費區(qū)域與年齡突破不現(xiàn)實[7]，因此，開發(fā)適合現(xiàn)代青年生活習慣及口感的黃酒成為首選方案。目前，黃酒的研究主要集中在原料的選擇、酒曲微生物種類、功能性成分及黃酒風味等[8-10]。而傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵結(jié)束后需經(jīng)過澄清、滅菌等工序使其達到穩(wěn)定，目前主流的滅菌工藝采用加熱滅菌[11]，加熱滅菌則會造成黃酒風味的損失，尤其使?jié)兜母泄賹傩酝怀鯷1]。鮮黃酒發(fā)酵后不經(jīng)高溫滅菌[12]，因此鮮酒較熱法殺菌酒口感更新鮮[13]。朱一松等[14]通過超濾膜截留黃酒中的大分子物質(zhì)，得到純生黃酒，顏色變淺香味淡爽。胡普信[12]采用先糖化后發(fā)酵，再經(jīng)無菌過濾的工藝，生產(chǎn)得到較為爽口的純生黃酒。但膜過濾法生產(chǎn)純生黃酒，導致黃酒中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量下降，且對膜的要求較高，導致黃酒生產(chǎn)成本的上升。

瓶內(nèi)發(fā)酵鮮黃酒是通過原料滅菌裝瓶后，接入酵母發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后不經(jīng)滅菌直接進入消費終端，既能減少滅菌能耗又能保證產(chǎn)品的質(zhì)量。由于發(fā)酵后的成品未被加熱，成品呈多種復合香味且較為爽口[12]；同時發(fā)酵是在完全密閉的環(huán)境中進行，因此產(chǎn)生的二氧化碳會被溶解到黃酒中，賦予低度黃酒獨特的風味[15]。本研究通過調(diào)整配方、發(fā)酵時間和溫度，在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman試驗，最陡爬坡試驗，中心組合試驗（Central Composite Design，CCD）的方法優(yōu)化低度鮮黃酒發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糯米 市售；黃酒高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司；α-淀粉酶（酶活2000 U） 無錫杰能科酶制劑公司；糖化酶（酶活50000 U） 張家港金源生物化工有限公司；礦泉水 華潤怡寶飲料有限公司。

電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇榮華儀器制造公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖液制備與滅菌 按照吳殿輝[16]的方法制備初始發(fā)酵糖液，稀釋至試驗所需糖度裝瓶后95 ℃水浴滅菌[12,16]，備用。

1.2.2 鮮黃酒發(fā)酵與耐壓計算

1.2.2.1 鮮黃酒發(fā)酵工藝 稱取0.2%安琪干酵母按

參考文獻[17]方法35 ℃下活化，產(chǎn)生大量氣泡后備用。按方法1.2.1制備的初始發(fā)酵糖液中接入已活化安琪酵母液，置于生化培養(yǎng)箱中按一定溫度恒溫培養(yǎng)，達到一定發(fā)酵時間后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 鮮黃酒耐壓計算 按照參考文獻[12]的方法測量初始糖度和發(fā)酵終了結(jié)束糖度。按照參考文獻[18]的方法計算瓶內(nèi)壓力，釀造中CO2計算可簡化為：

式中：G：發(fā)酵液中CO2產(chǎn)生總量，%。

1.2.3 發(fā)酵工藝響應面試驗

1.2.3.1 Plackett-Burman設計篩選 采用 Plackett-Burman設計法和Design-expert軟件創(chuàng)建試驗次數(shù)N=12的試驗，對初始糖度（A，g/L）、裝液量（C，mL）、水浴滅菌的時間（D，h）、接種量（F，mL）、發(fā)酵溫度（G，℃）、發(fā)酵時間（J，h），6個因素進行考察，另設5個虛擬因素（B、E、H、I、K）以考察試驗誤差[19]，如表1所示，以感官評價分為響應值考察各因素對口感影響的顯著性[20]。

表1 Plackett-Burman 設計因子水平及編碼值Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.3.2 最陡爬坡試驗 析因?qū)嶒灥某醪焦烙嫵３＿h離實際最優(yōu)點，需要以響應值變化的梯度方向為爬坡方向設計爬坡試驗，根據(jù)各顯著因素效應值的大小確定變化步長，以期快速、經(jīng)濟地逼近最大響應區(qū)域。根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，設計最陡爬坡試驗[21]。

1.2.3.3 響應面試驗 利用Design-expert軟件在最陡爬坡試驗的基礎(chǔ)上進行3因素3水平的中心組合設計試驗[22-24]，如表2所示，以得到最佳的發(fā)酵條件，提高感官評價分數(shù)。

表2 中心組合試驗中變量及其水平Table 2 Factors and levels of central composite design

1.2.4 鮮黃酒感官評價

1.2.4.1 感官品評人員 品評人員分為兩組選拔后統(tǒng)一培訓[25-26]。一組由國家級黃酒評酒委員組成，作為專家品評小組，共4 人，其中男性3人，女性1人；另一組由19～22歲的浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院黃酒分院的青年學生組成，作為鮮黃酒潛在的消費者，共9人，其中男性3人，女性6人。

1.2.4.2 評價方法 品評共3輪重復，樣品隨機組合；分別將樣品分輪次提供給品評員進行味覺和嗅覺的感官描述分析；每輪品評之間間隔時間15 min，提供純凈水給品評員漱口；品評員記錄樣品的味道和氣味感官性質(zhì)，并根據(jù)表3進行評分[26-28]。去掉一個最高分，去掉一個最低分后取算術(shù)平均值作為最終得分。

表3 成品黃酒評分標準（分）Table 3 Sensory evaluation (scores)

1.3 數(shù)據(jù)處理

每位品評人員每組數(shù)據(jù)重復測定2次，去掉每組評分最高分和最低分后取平均值；采用Design-Expert.V 8.0.6統(tǒng)計軟件進行實驗設計和數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計，響應面圖采用Design-Expert.V 8.0.6導出。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓶內(nèi)發(fā)酵耐壓安全性計算

將根據(jù)Plackett-Burman試驗設計和爬坡試驗設計發(fā)酵得到的低度鮮酒按照方法1.2.2.2檢測糖度。

如表4、表5所示，本試驗中所采取的初始糖度最高為160 g/L，在實際操作中檢測得到發(fā)酵結(jié)束糖度不低于40 g/L，根據(jù)實驗方法1.2.2.2計算可得CO2含量＜0.58%，而成品啤酒按國家標準CO2含量在0.40%～0.65%之間，因此本項目所產(chǎn)生的CO2含量符合耐壓安全標準。

表4 Plackett-Burman試驗鮮酒糖度Table 4 The brix of Plackett-Burman design

表5 最陡爬坡試驗鮮酒糖度Table 5 The brix of the steepest ascent method

2.2 Plackett-Burman設計篩選結(jié)果

根據(jù)前期單因素實驗基礎(chǔ)，選用試驗次數(shù)N=12的試驗設計，以感官評價為響應值。實驗設計及結(jié)果如表6所示。

表6 Plackett-Burman 試驗設計與結(jié)果Table 6 Design and results of Plackett-Burman test

對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，Plackett-Burman試驗結(jié)果采用Lenth法識別顯著效應[22]，得到了因素標準化效應的半正態(tài)概率效應圖（圖1）以及因素標準化效應的帕累托圖（圖2）。由圖1可看出，因素G、J、A的標準化效應點離擬合線較遠，位于圖右側(cè)，故其為顯著影響因素（P＜0.05），即影響感官評價的顯著因素是發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、初始糖度、接種量，各因素對感官評價影響程度的大小順序為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞初始糖度＞接種量。裝液量和滅菌時間標準化效應點均較小，說明影響不顯著。標準化效應的帕累托圖（圖2）進一步確定了效應的量值和重要性，因素G、J、A、F均超過了t值，為顯著因子。

圖1 鮮黃酒感官評價半正態(tài)概率效應圖（α=0.05）Fig.1 Half-Normal plot of estimated main effects on sensory scores (α=0.05）

圖2 鮮黃酒感官評價的標準效應帕累托圖（α=0.05）Fig.2 Pareto chart of estimated main effects on sensory scores(α=0.05)

由表7可知，模型的P值為0.0122＜0.05表明顯著，故該模型可靠，即該模型在被研究的整個回歸區(qū)域擬合很好；決定系數(shù)R2=0.9214，說明相關(guān)性較好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.8270表明，82.7%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋；通常情況下變異系數(shù)（CV）越低，實驗的可信度和精確度越高，CV值等于8.67%，表示PB實驗的可信度和精確度較好；精密度是有效信號與噪聲的比值（Adeq Precisior），大于4.0視為合理[22]，本試驗精密度達9.807。

表7 Plackett-Burman試驗因素、水平及顯著性分析Table 7 Factors, levels and significance analysis of Plackett-Burman test

通過對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=65.61+5.39A+4.01C-3.17D-4.36F-6.69G-6.24J。

2.3 最陡爬坡實驗

由回歸方程可知，因素A偏回歸系數(shù)為5.39，表明因素A對感官評價分數(shù)的影響為正效應，即隨著A因素的增加，感官評分呈上升趨勢，應增加。同時由回歸方程1可見，F(xiàn)、G、J因素為負效應，即對響應值的影響為負效應，應減小。但響應面試驗時考察因素超過3個會使試驗次數(shù)顯著增加（3個因素為20次處理，4個因素為31次處理）。同時，因素F即接種量的效應在這4個因素中最小，因此舍棄對該因素的進一步優(yōu)化[29]。由于最顯著的因素是G，因此以G為爬坡單位。

爬坡實驗從中心點開始出發(fā)[30]，一般而言減少接種量可降低成本，因此取低水平接種量10 mL。綜合考慮成品酒的氣泡含量、滅菌效果與成本等因素，裝液量固定取195 mL，滅菌時間固定取2.5 h。設計及結(jié)果如表8所示。

表8 最陡爬坡實驗設計及其結(jié)果Table 8 The steepest ascent method results

由表8可知，處理2的感官分數(shù)最高，因此以處理2為響應面試驗的中心點。

2.4 CCD結(jié)果與響應面分析

根據(jù)最陡爬坡試驗，以處理2為中心點實行CCD試驗[31]，以感官分數(shù)為響應值。因為有3個自變量，為使擬合響應方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性, 選擇中心點實驗數(shù)為6，星號臂長γ=1.682。實驗方案及結(jié)果見表9。

表9 中心組合試驗設計結(jié)果Table 9 Results of central composite design

通過對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到二次多項式方程：Y=95.67-2.25A+2.06B-2.62C-1.62AB-2.62AC-0.12BC-3.62A2-6.80B2-7.33C2。

響應面分析中對試驗結(jié)果進行擬合的二次模型方差分析見表10。F值為768.85，R2=0.9986，R2Adj=0.9973，說明模型對實際情況擬合較好；P值為＜0.0001，表明該模型高度顯著，可用來進行響應值預測。

表10 中心組合試驗模型顯著性分析Table 10 The variance of central composite design

利用回歸模型對各發(fā)酵條件下鮮黃酒感官評價進行預測[32]，為便于觀察模型預測結(jié)果，將模型預測值與實驗值相關(guān)圖繪于圖3，圖中可以發(fā)現(xiàn)樣本點都處于45°對角線附近，說明模型對各發(fā)酵條件下低度鮮黃酒預測值與實驗值高度相關(guān)，兩者差別較小。模型預測誤差分布圖見圖4，通常對于一個優(yōu)良的模型要求大部分樣本的預測誤差不得超過±2SD。圖4中可以看到全部樣本點都落在模型的±2SD范圍內(nèi)，沒有異常點，說明模型預測準確性高，可以用于對低度鮮酒的發(fā)酵工藝進行分析[33]。

圖3 模型預測值與實驗值相關(guān)圖Fig.3 Normal plot of residuals on sensory score

圖4 殘差對模型預測散布圖Fig.4 Residuals versus predicted values on sensory score

依據(jù)回歸方程，利用Design-expert繪出響應面分析圖，結(jié)果見圖5、圖6、圖7。通過響應面3D圖可以明顯看到所做試驗的范圍包括最大值所在區(qū)域。

圖5 糖度和發(fā)酵溫度交互作用對感官評價的影響Fig.5 Effects of interactions between brix and fermentation temperature on sensory score

圖6 糖度和發(fā)酵時間交互作用對感官評價的影響Fig.6 Effects of interactions between brix and fermentation time on sensory score

圖7 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度交互作用對感官評價的影響Fig.7 Effects of interactions between fermentation time and temperature on sensory score

利用Design-expert對模型進行分析預測[22]，得到糖度為126 g/L，發(fā)酵溫度為20.5 ℃，發(fā)酵時間為69.2 h，此時的響應值最大且值為96.7分。

2.5 驗證性試驗

在優(yōu)化條件下進行驗證試驗，感官分析的數(shù)據(jù)為96.6分，試驗值與理論預測值非常接近，可見該模型可以較好的預測實際的發(fā)酵情況，從而也證明響應面優(yōu)化低度鮮黃酒發(fā)酵工藝的可行性。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，利用Design-expert軟件進行Plackett-Burman設計、最陡爬坡法與響應面相結(jié)合的試驗設計方法能快速、有效地從眾多影響低度鮮黃酒因素中篩選關(guān)鍵因素，并優(yōu)化發(fā)酵工藝。經(jīng)上述方法優(yōu)化后，低度鮮黃酒的最佳發(fā)酵工藝為：糖度為126 g/L，發(fā)酵溫度為20.5 ℃，發(fā)酵時間為69.2 h，裝液量為195 mL，滅菌時間為2.5 h，接種量為10 mL，此時低度鮮黃酒的感官評價分數(shù)最高。鮮酒與發(fā)酵后滅菌得到的樣品相比較，具有復合果香、無苦澀味且明顯更為爽口，因此響應面法能較好地對低度鮮黃酒的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，試驗可為行業(yè)低度鮮黃酒的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。