云南栘依黃酮提取及其抗氧化、降血糖活性研究

王安娜，彭小偉，闞 歡，王大瑋 ，胡 祥，劉 云,

（1.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明 650224；2.西南林業(yè)大學林學院，云南昆明 650224；3.云南省農業(yè)科學院熱區(qū)生態(tài)農業(yè)研究所，云南元謀 651300）

云南栘依（Docynia delavayi）是一種薔薇科（Rosaceae）栘依屬（Docynia）植物，又稱多依[1]，主產于云南、四川、貴州[2]。云南栘依富含黃酮、多酚、多糖等活性物質[3]，具有抗氧化[4]、降血糖[5]、降血脂[6]、抗腫瘤[7]、抗炎[8]等功效，是一種很好的藥食同源性植物。目前對云南栘依的研究主要集中于果實[9]、根莖[10]、葉[11]等，而果實味偏酸澀，一般都被當地人加工制成粗產品。

天然的黃酮類化合物具有抗氧化[12]、降血糖[13]等多種藥理作用，已成為國內外開發(fā)利用研究的熱點，所以云南栘依的研究開發(fā)具有較大的發(fā)展空間。對于黃酮類化合物來說，不同的提取技術對其得率及品質帶來差異[14]?，F今，云南栘依黃酮提取方法有李維莉等[15]的超聲波輔助、索氏提取法，彭珍華等[16]、李學玲等[17]的超聲波輔助乙醇法，而超聲波輔助酶法尚未報道，同時對云南栘依黃酮抗氧化、降血糖活性的研究也較少。

為了提高云南栘依的食用及藥用價值，對云南栘依進行深入研究是有必要的。本研究采用超聲波輔助酶法，通過單因素、響應面試驗對云南栘依黃酮提取工藝進行優(yōu)化，并對云南栘依黃酮進行體外抗氧化、降血糖活性研究，以期為云南栘依黃酮的進一步開發(fā)利用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

栘依果 產自云南省臨滄市，于2020年11月采收；蘆丁、纖維素酶（50 U/mg）、果膠酶（20 U/mg）、1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、α-淀粉酶（10000 U/g），α-葡萄糖苷酶（700000 U/g） 上海源葉生物科技公司；Na2CO3、NaNO2、Al（NO3）3、Na2HPO4、KH2PO4天津市風船化學試劑科技有限公司；以上試劑均為分析純。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；BJ-800A粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；ST-3100電子pH計 奧豪斯儀器（常州）有限公司；B25-12DTDS超聲波清洗機 寧波新藝超聲設備有限公司；DK-98-2恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計 日本島津公司；SpectraMax-190酶標儀 美谷分子儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 云南栘依預處理 先將云南栘依洗凈、切片、去籽，經熱風60 ℃干燥，后粉碎過60目篩，密封置4 ℃冰箱，備用。

1.2.2 云南栘依黃酮提取工藝 稱取適量樣品和復合酶（纖維素酶和果膠酶，用量1%）于離心管中，按料液比加入相應濃度的乙醇溶液，并調整其pH，超聲提取一定時間后將樣品進行沸水浴5 min（滅酶），真空抽濾，移入100 mL容量瓶，定容。取1 mL樣液于25 mL具塞試管中按標準曲線方法在波長510 nm處測定吸光度，并按公式（1）計算云南栘依黃酮得率。

1.2.3 蘆丁標準曲線的繪制及云南栘依黃酮含量測定 本實驗黃酮測定的方法為亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[18]，于波長510 nm處測定吸光值，得到方程：y=11.9720x+0.0093（R2=0.9996）。按照制作標準曲線的方法處理樣品，得到云南栘依中黃酮得率計算公式，公式（1）如下。

式中：V，云南栘依提取液體積，mL；C，樣液黃酮濃度，mg/mL；m，云南栘依質量，g；n，稀釋倍數。

1.2.4 單因素實驗 稱取1.00 g云南栘依粉于50 mL離心管中，固定超聲功率300 W、提取時間50 min、復合酶（纖維素酶:果膠酶）比例為1:1、液料比30 :1 mL/g、乙醇濃度60%、pH5，改變提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、復合酶比例（5:2、4:2、3:2、2:2、2:3、2:4）、提取時間（30、40、50、60、70、80 min）、液料比（15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1 mL/g）、乙醇濃度（45%、50%、55%、60%、65%、70%）、pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）六個因素水平，考察六個因素對超聲波輔助酶法提取云南栘依黃酮得率的影響。

1.2.5 響應面試驗 在單因素實驗基礎上，以云南栘依黃酮得率為參考，根據Central Composite Design設計原理。通過單因素實驗，從實驗方便性及實際成本問題等方面考慮，選取乙醇濃度、酶比例、pH、提取溫度作為響應面優(yōu)化條件進行實驗，如表1所示。

表1 響應面試驗設計Table 1 Design of response surface test

1.2.6 抗氧化能力的測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率測定 根據章燁雯等[19]的方法，設置樣品組、空白組和控制組，均置于37 ℃避光水浴30 min，在波長517 nm測定吸光值；取2.0 mL樣品液、DPPH溶液，測得樣品組吸光值A；乙醇代替樣品液，測得空白組吸光值A0；乙醇代替DPPH溶液，測得控制組吸光值Ax。DPPH自由基清除率計算公式（2）如下：

1.2.6.2 ABTS+自由基清除率測定 根據Petra等[20]的方法，設置樣品組、空白組，室溫下避光反應6 min，于波長734 nm處測定吸光值；加0.1 mL樣品溶液和3.9 mL ABTS貯備液，測定樣品組吸光值A2；用乙醇替代樣品液作空白，測定空白組吸光值A1。ABTS+自由基清除率公式（3）如下:

1.2.6.3 羥基自由基清除率測定 根據Bulu等[21]，設置樣品組、空白組和控制組，黑暗條件下反應1 h，于510 nm處測定吸光度值；依次加入1.0 mL樣品液、1.0 mL H2O2溶液、1.0 mL FeSO4溶液和1.00 mL水楊酸乙醇溶液于不同試管中，測定樣品組吸光值As，用乙醇替代樣品溶液，測定空白組吸光值Ab；以蒸餾水替代H2O2溶液作為樣品控制組，測定吸光度值Ac。羥基自由基清除率公式（4）如下：

1.2.6.4 鐵離子還原能力測定 根據沙玉歡等[22]的方法略作修改。依次在試管中分別加入1.0 mL不同濃度樣品液、磷酸鹽緩沖液和鐵氰化鉀溶液，搖勻后將試管置于50 ℃水浴鍋中反應20 min，取出后加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液并搖勻，然后于4000 r·min-1離心10 min，取1.0 mL上清液，分別加入1.0 mL蒸餾水和三氯化鐵溶液，于700 nm波長測其吸光值。

1.2.7 云南栘依黃酮降血糖能力的測定

1.2.7.1 黃酮對α-葡萄糖苷酶活性的影響 根據湯陳鵬[23]和Qin[24]的方法，取100.0 μL樣品溶液、α-葡萄糖苷酶（溶解于PBS pH 6.5），在避光條件下反應10 min（37 ℃水?。缓蠹尤?00 μL PGNG，在相同條件下反應20 min，最后加入2.0 mL Na2CO3溶液終止反應，于405 nm處測定樣品吸光值AS。同時設空白組和樣品控制組，用乙醇代替樣品作為空白組AB，用PBS代替α-葡萄糖苷酶溶液作為控制組AC。α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式（5）如下：

1.2.7.2 黃酮對α-淀粉酶活性的影響 根據Zeng[25]的方法，取50.0 μL樣品溶液，加入50.0 μLα-淀粉酶溶液溶解于（PBS pH 6.8），在避光條件下反應10 min（37 ℃水浴），加50.0 μL可溶性淀粉在相同條件下反應10 min，加入100.0 μL DNS終止反應，進行沸水浴5 min，后加入1 mL蒸餾水，在540 nm 波長處測定樣品吸光值Ai。同時設空白組和樣品控制組，用乙醇代替樣品作為空白組Am、用等量的PBS代替α-淀粉酶溶液作為控制組Az。α-淀粉酶抑制率計算公式（6）為：

1.3 數據處理

利用軟件Design-Expert. 8.0進行實驗設計，軟件IBM SPASS Statistics 26.0對單因素實驗進行顯著性分析，軟件Graphpad prism 9.0進行IC50值計算，軟件Origin 8.0對實驗數據（3次平行實驗）進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溫度對黃酮得率的影響 由圖1可知，黃酮得率在提取溫度為50 ℃時達到峰值，為10.34%，黃酮得率先上升后逐漸下降，與陳永平等[26]實驗結果一致；50 ℃前，隨著溫度升高，酶活性增強以及分子運動加快，提取得率隨之上升，到50 ℃時黃酮大部分已被提取出；而隨著溫度繼續(xù)升高，酶活性降低以及高溫可能破壞了其結構[27]，導致黃酮得率下降。因此，選提取溫度40、50、60 ℃作為響應面試驗優(yōu)化條件。

圖1 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

2.1.2 復合酶比例對黃酮得率的影響 由圖2可知，隨著果膠酶的增加，黃酮得率在復合酶比例3:2達到最高值，為12.49%，黃酮得率為先上升后下降，與劉媛潔等[28]的實驗結果相近；黃酮得率變化的原因可能是細胞壁的破壞是以果膠酶和纖維素酶共同作用，在達到適宜的比例時才能夠更好地釋放出黃酮[29]。因此，本實驗選取復合酶比例為4:2、3:2、2:2響應面優(yōu)化試驗條件。

圖2 復合酶比例對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of complex enzyme ratio on the yield of flavonoids

2.1.3 提取時間對黃酮得率的影響 由圖3可知，得率在時間為50 min達到峰值，為10.41%，黃酮得率隨時間增加先上升后下降，與楊宗玲等[30]實驗結果一致；其變化的原因大概是隨著時間的增加，黃酮逐漸溶出，得率逐漸上升，在50 min時大部分黃酮已溶出，而隨著時間延長，溶劑破壞了其結構或是其他醇溶性物質溶出而影響了黃酮得率，導致提取得率下降[31]。為保證實驗的可操作性及實驗效率，設定提取時間50 min為優(yōu)化試驗的固定參數條件。

圖3 提取時間對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

2.1.4 液料比對黃酮得率的影響 由圖4可知，黃酮得率在液料比30:1 mL/g時達到最大值，為10.41%，提取得率先升高后下降，與張小梅等[32]實驗結果相一致；提取得率的變化可能是源于溶劑的增加，增大了提取液乙醇與提取物長云南栘依黃酮的接觸面積，使溶出的黃酮得率增大[33]，在液料比30:1 mL/g時大部分黃酮已溶出，而隨之增加進而也逐漸溶出其他物質，使提取得率下降。從實際操作成本及節(jié)約資源等方面考慮，選取液料比30:1 mL/g為優(yōu)化試驗的固定參數條件。

圖4 液料比對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on the yield of flavonoids

2.1.5 乙醇濃度對黃酮得率的影響 由圖5可知，黃酮得率在乙醇濃度為55%時達到峰值，為11.66%。隨乙醇濃度增加提取得率先上升而后逐漸下降，可能是由于隨著乙醇濃度增加，云南栘依內外極性差異的增加，提取得率漸漸升高，在乙醇濃度為55%時極性相近提取得率達到最大，而濃度繼續(xù)增加，極性差異太大不利于溶出[34]，使黃酮得率逐漸變低。因此，選取乙醇濃度水平為50%、55%、60%作響應面試驗優(yōu)化條件。

圖5 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.1.6 不同pH對黃酮得率的影響 由圖6可知，黃酮得率在pH4.5時達到峰值，此時提取得率為11.17%，黃酮得率先向上后緩慢向下，與劉媛潔等[28]的研究結果相似；提取得率下降大概是因為復合酶最適的環(huán)境為pH4.5，而當pH逐漸升高，酶的活性受到影響而減弱，從而降低了黃酮得率[35]。因此，選取pH4.0、4.5、5.0作為響應面優(yōu)化試驗條件。

圖6 pH對黃酮得率的影響Fig.6 Effect of pH on the yield of flavonoids

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面結果與方差分析 通過試驗，得出以乙醇濃度（A）、復合酶比例（B）、pH（C）、提取溫度（D）四個因素間交互作用對云南栘依黃酮得率的影響，并以提取得率為響應值。如表2所示，進行二次多項式回歸分析的方程為：

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface test

黃酮得率（%）=13.01+0.17A+0.23B+0.29C+0.29D+0.26CD-0.82A2-1.02B2-0.91C2-1.06D2

根據響應面設計方案，進行方差分析，見表3。對回歸模型進行了顯著性檢驗，如表3所示，得出回歸模型顯著（P＜0.001），失擬項為不顯著（P=0.1001），說明該模型可用；R2=0.9864（R2Adj=0.9737）則說明該響應面試驗可以運用實際操作。由表3可知：A、CD（P＜0.01）對試驗結果影響較顯著，B、C、D、A2、B2、C2、D2（P＜0.001）則為極顯著水平。由F值知，云南栘依黃酮得率被各因素影響的程度為pH=提取溫度＞復合酶比例＞乙醇濃度。

2.2.2 各因素交互作用 由表3的方差分析表可知，其AB、AC、AD、BC、BD對響應值的影響未見顯著（P＞0.05），CD交互作用對響應值的影響顯著（P＜0.01）。如圖7所示，3D圖的表面斜率越陡，兩個因子之間的相互作用越大；等高線輪廓橢圓度的相互作用的顯著性反映，趨于橢圓形反映出交互作用的顯著性[36]，這就說明pH與溫度間的交互作用對云南栘依黃酮得率的影響程度較大，這與表3顯著性檢驗結果是一致的。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

圖7 pH與溫度交互作用對黃酮得率的影響Fig.7 Interaction of pH and temperature on the yield of flavonoids

2.2.3 模型的驗證實驗 經響應面模型分析得到云南栘依黃酮優(yōu)化提取條件為：乙醇濃度55.55%，復合酶比例3.1:2，提取溫度51.68 ℃，pH4.59，此時預測黃酮得率為13.01%。為了實際操作將參數做出調整：乙醇濃度55%、復合酶比例3:2、提取溫度50 ℃，pH4.5；進行三次平行實驗，得到黃酮得率為13.10%，與模型預測值相差0.09%，說明該模型實驗可重復性好，可信度高，能較好預測云南栘依黃酮得率。

2.3 云南栘依黃酮的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖8可知，云南栘依黃酮和VC隨著濃度增加對DPPH自由基清除率升高后逐步趨于平穩(wěn)；黃酮濃度在一定的范圍內（0.03～0.12 mg/mL），DPPH自由基清除能力對黃酮濃度呈依賴性增長，當超過0.12 mg/mL趨于平衡狀態(tài)，當黃酮濃度到0.14 mg/mL時，對DPPH自由基清除率接近VC，達93.20%，與陳永平等[26]實驗中總黃酮清除DPPH自由基的濃度依賴性趨勢一致；云南栘依黃酮和VC對DPPH自由基清除率IC50值為0.04、0.01 mg/mL，大于黃麗萍等[5]研究得出的栘依皮的乙醇提取物對DPPH自由基清除率的IC50值（0.1475 mg/mL），說明云南栘依黃酮對DPPH自由基有較好的清除能力。

圖8 云南栘依黃酮和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of D. delavayi flavonoids and VC on DPPH free radical

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 由圖9可知，云南栘依黃酮和VC隨著濃度增加對ABTS+自由基清除率逐漸升高后趨于穩(wěn)定，黃酮濃度（0.20～1.40 mg/mL）與ABTS+自由基清除率之間存在著量效關系。云南栘依黃酮和VC兩者對ABTS+自由基清除率IC50值分別為0.29、0.18 mg/mL，與章燁雯等[19]實驗中總黃酮對ABTS+自由基清除率IC50值相接近，并且當黃酮濃度到1.2 mg/mL時，對ABTS+自由基清除率接近VC，達96.4%，說明云南栘依黃酮對ABTS+自由基有較強的清除能力。

圖9 云南栘依黃酮和VC對ABTS+自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of D. delavayi flavonoids and VC on ABTS+ free radical

2.3.3 羥基自由基清除能力 由圖10可知，云南栘依黃酮和VC隨濃度升高對羥基自由基清除率增強后趨于穩(wěn)定，兩者對羥基自由基清除率IC50值分別為0.70、0.15 mg/mL，云南栘依黃酮對其清除能力略低于VC，大于黃麗萍等[5]研究的栘依皮乙醇提取物對羥基自由基清除率IC50值（61.11 mg/mL）。李學玲等[17]通過研究云南大果栘依黃酮對羥基自由基清除能力，發(fā)現當濃度為7.94 mg/L時，清除率最大，達83.20%；而云南栘依黃酮在2.5 mg/mL時，已經與其實驗結果相接近，達83.15%，說明云南栘依黃酮對羥基自由基有較好的清除能力。

圖10 云南栘依黃酮和VC對羥基自由基的清除作用Fig.10 Scavenging effect of D. delavayi flavonoids and VC on hydroxyl free radical

2.3.4 鐵離子還原能力 云南栘依黃酮和VC的鐵離子還原能力，吸光度大小反映了還原能力的強弱[30]，由圖11可知，在濃度0.20～1.00 mg/mL范圍內，云南栘依黃酮和VC的還原能力有良好的線性關系，而當濃度大于1.00 mg/mL，還原能力趨近平衡，呈一定濃度的正相關性，說明云南栘依黃酮具有較好的鐵離子還原能力。

圖11 云南栘依黃酮和VC對鐵離子還原能力Fig.11 Reducing effect of D. delavayi flavonoids and VC on iron ions

2.4 云南栘依黃酮的降血糖能力

2.4.1α-葡萄糖苷酶抑制活性 由圖12可知，在濃度0.03～8.00 mg/mL范圍內，云南栘依黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制率隨濃度升高而上升（23.61%～76.97%），存在著劑量依賴性；當濃度大于8.00 mg/mL后，對α-葡萄糖苷酶的抑制率趨近于平衡狀態(tài)。云南栘依黃酮抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值（0.86 mg/mL）大于阿卡波糖（0.08 mg/mL），但小于黃秋葵黃酮（3.87 mg/mL）[37]，說明云南栘依黃酮對α-葡萄糖苷酶有較好的抑制能力，是可以進一步開發(fā)利用的天然儲備藥物。

圖12 云南栘依黃酮和阿卡波糖對α-葡糖糖苷酶抑制能力Fig.12 Inhibitory effect of D. delavayi flavonoids and acarbose on α-glucosidase

2.4.2α-淀粉酶活性抑制活性 由圖13可知，在濃度0.05～3.00 mg/mL范圍內，云南栘依黃酮對α-淀粉酶活性的抑制能力呈濃度依賴性增長（28.56%～82.72%），當濃度大于3.00 mg/mL后，對α-淀粉酶的抑制率趨近于平衡狀態(tài)。云南栘依黃酮、阿卡波糖抑制α-淀粉酶的IC50值分別為0.37、0.05 mg/mL，云南栘依黃酮對α-淀粉酶的抑制能力低于阿卡波糖，在濃度為1.00 mg/mL時，與牡丹花黃酮對α-淀粉酶的抑制能力相近[32]，說明云南栘依黃酮對α-淀粉酶有較好的抑制率。

圖13 云南栘依黃酮和阿卡波糖對α-淀粉酶抑制能力Fig.13 Inhibitory effect of D. delavayi flavonoids and acarbose on α- amylase

3 討論與結論

栘依為植物性果實，細胞壁由纖維素、果膠質等組成[30]，加入適宜的纖維素酶及果膠酶有助于其黃酮類物質的溶劑提取，本實驗采用超聲波輔助酶法，考察提取溫度、復合酶比例、提取時間、料液比、乙醇濃度、pH六個因素對云南栘依黃酮得率的影響，并通過響應面法優(yōu)化提取工藝參數。結果發(fā)現超聲波輔助酶法有明顯的優(yōu)勢，與彭珍華[16]、李維莉等[15]、李學玲等[17]相比分別提高了8.86倍、1.30倍、3.18倍，說明本方法提取效率相對較高，可為加快云南栘依的開發(fā)與利用提供一種高效、節(jié)能、安全的提取黃酮的工藝參考。許多抗氧化、降血糖研究證明，黃酮類等化合物是主要的抗氧化[26-30]、降血糖[23-25]物質，其濃度與能力呈良好的量效關系；本文與之相符，黃酮濃度與抗氧化、降血糖能力，在一定的范圍內存在著劑量依賴性。黃麗萍等[5]研究發(fā)現栘依皮提取液具有較好的抗氧化、降糖及降脂能力，而本實驗進一步證實了云南栘依黃酮在抗氧化、降血糖能力上有一定的作用。

本文采用超聲波輔助酶法提取云南栘依黃酮的最佳工藝參數為提取溫度50 ℃、復合酶比例3:2、提取時間50 min、液料比30 mL/g、乙醇濃度55%、pH4.5，黃酮得率達到了13.10%，與預測值13.01%接近，模型可靠。體外抗氧化活性研究表明云南栘依黃酮對DPPH自由基、ABTS+自由基、羥基自由基清除能力的IC50分別為0.04、0.29、0.70 mg/mL，同時對鐵離子還原有一定的能力；體外降血糖研究表明云南栘依黃酮抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的IC50分別為0.86、0.37 mg/mL，證明了云南栘依黃酮具有較好的抗氧化、降血糖能力。因此，云南栘依黃酮可作為一種具有很大潛力的抗氧化和降血糖的藥用野生資源，其成本小、資源豐富，值得進一步開發(fā)利用。本研究為云南栘依黃酮的進一步研究提供實驗依據，但本文對云南栘依黃酮提取得到的只是粗黃酮，存在著多種雜質，有待進一步純化分離，進而對其更深一步體內抗氧化、降血糖進行研究。