pH耦合檸檬酸補料策略促進地衣芽孢桿菌產(chǎn)芽孢

丁 躍，何俊峰，龔若飛，戴 航，陳 雄，黃亞男，王 志,

（1.發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北武漢 430068；2.河南省南街村（集團）有限公司，河南漯河 462600）

地衣芽孢桿菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，其生長代謝過程中能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶[1-2]、生物活性物質(zhì)、促生長因子[3]等。由于其豐富的產(chǎn)酶能力和食品安全性，地衣芽孢桿菌長期應(yīng)用于食品工業(yè)和微生態(tài)[4]等領(lǐng)域。如：地衣芽孢桿菌強化大曲酒醅發(fā)酵能效抑制異味酚類物質(zhì)合成、提高芳香類和吡嗪類物質(zhì)含量[5]。地衣芽孢桿菌還被應(yīng)用于治療腸易激綜合征[6]。

豆粕是地衣芽孢桿菌高密度發(fā)酵（細(xì)胞數(shù)1.0×1010～2.0×1010CFU/mL，芽胞率90%左右）常用氮源[7-9]，但一味提高豆粕濃度并不能提高芽胞產(chǎn)量[10]。因為芽孢形成還與Spo0A含量及其磷酸化水平[11]以及調(diào)控蛋白AbrB有關(guān)，余志強[12]和Takeko[13]分別構(gòu)建了B. subtilis的spo0A缺失突變株均不產(chǎn)芽孢。而焦曉陽[14]過表達B.subtilis的abrB則芽孢率降低了73.1%。因而，芽孢的形成是Spo0A-AbrB調(diào)控系統(tǒng)對培養(yǎng)環(huán)境響應(yīng)平衡的結(jié)果。另外，蛋白是芽孢重要組分[15-17]，因而氨基酸透過酶[18]和能量供應(yīng)[19]是芽孢形成的重要條件。第三，芽孢桿菌發(fā)酵過程產(chǎn)生的活性氧（H2O2等）對細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫[20-21]，引起能量供應(yīng)效率下降，細(xì)胞以NADPH作為最終電子受體[22]進行氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。但是，發(fā)酵中后期芽孢桿菌氧化應(yīng)激與芽孢形成（如：能量、氨基酸轉(zhuǎn)運等）的代謝體系是否匹配尚未明確。

高芽孢率是地衣芽孢桿菌應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)和微生態(tài)領(lǐng)域的基礎(chǔ)條件，培養(yǎng)基[7-10]和發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化在一定程度上能提高生長和芽孢率，如：枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程添加檸檬酸可抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性、促進6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活力，并促進細(xì)胞生長[24]。但是工業(yè)生產(chǎn)過程芽孢形成的限制因素尚不明確，特別是氧化應(yīng)激與能量和氨基酸的供應(yīng)效率與芽孢生成體系之間的代謝匹配性。因而，本文研究了檸檬酸對碳中心代謝、能量代謝、氧化應(yīng)激以及氨基酸供應(yīng)和芽孢形成過程關(guān)鍵基因表達的影響，為提高芽孢形成效率提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地衣芽孢桿菌M52（Bacillus licheniformisM52）發(fā)酵工程教育部重點實驗室保藏；2×SYBR Green qPCR Mix、Trizol、First Strand cDNA Synthesis Kit Genenode公 司；DL2000 DNA Marker TIANGEN公司；ddH2O（DNase/RNase Free） Genecopoeia公司；其他實驗試劑 均為國產(chǎn)分析純。

BIOTECH-30JS 發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備有限公司；7900HT實時熒光定量PCR儀 美國羅氏公司；Nano-100微量分光光度計 杭州奧盛儀器有限公司；EDC-810PCR儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；JY300水平電泳儀器、JY02S紫外分析儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 試管、茄子瓶斜面和平板計數(shù)培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏20，NaCl 5，瓊脂粉20，調(diào)pH7.5，123 ℃，滅菌30 min。

30 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基（g/L）：玉米淀粉35，豆粕40，蛋白胨8，葡萄糖5，酵母浸粉3，輕質(zhì)碳酸鈣3，七水硫酸鎂0.5，氯化鈉2，三水磷酸氫二鉀2，一水合硫酸錳0.3。

1.2.2 地衣芽孢桿菌培養(yǎng)方法 從本實驗保存的地衣芽孢桿菌甘油管轉(zhuǎn)接到試管斜面中，37 ℃培養(yǎng)36 h。將活化后的菌種轉(zhuǎn)接至新鮮茄子瓶斜面（60 mL培養(yǎng)基/250 mL茄子瓶），37 ℃培養(yǎng)24 h，再向茄子瓶中加入50 mL無菌水，制備菌懸液80 ℃水浴10 min后接種。

發(fā)酵液體積按罐容積的60%（18 L）計，121℃，蒸汽滅菌30 min。發(fā)酵條件：35 ℃，轉(zhuǎn)速500 r/min，通風(fēng)量1.0 m3/h，發(fā)酵罐壓維持在0.04～0.05 MPa，發(fā)酵周期36 h。

取樣：發(fā)酵24 h開始，每3 h取樣，分別測定活菌數(shù)和芽孢數(shù)。取27 h樣進行qPCR測定。

1.2.3 檸檬酸補料實驗 檸檬酸溶液（質(zhì)量濃度50%）121 ℃滅菌后備用。發(fā)酵pH回升至7.5時，罐上設(shè)置反向耦合（pH大于7.5自動補料啟動）流加檸檬酸，至28 h停止，罐內(nèi)檸檬酸終濃度78 μmol/L。對照為不進行檸檬酸補料的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞數(shù)和芽孢數(shù)的測定 細(xì)胞數(shù)：發(fā)酵液中細(xì)胞數(shù)（CFU/mL）采用稀釋涂布平板法[25]測定。

芽孢數(shù)：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的菌液80 ℃水浴15 min，后進行平板涂布對芽孢進行計數(shù)。

產(chǎn)芽孢率計算公式：產(chǎn)芽孢率（%）=（芽孢數(shù)/活菌數(shù)）×100

1.2.5 實時熒光定量PCR（qPCR）

1.2.5.1 提取RNA 在Trizol試劑中用移液管反復(fù)吹打來裂解細(xì)胞，每1.0×107細(xì)菌加1 mL的Trizol。研磨混勻后樣本在室溫（15～30 ℃）下放置5 min使核蛋白體完全解離，4 ℃，12000 r/min離心10 min，取上清。每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿。蓋緊樣品管蓋，振蕩混勻15 s并將其在4 ℃下靜置2～3 min，4 ℃、12000 r/min離心10～15 min。取上清后，加同體積氯仿蓋緊樣品管蓋，振蕩混勻15 s并將其在室溫下靜置2～3 min。4 ℃、12000 r/min離心10～15 min，吸上層清液，至新1.5 mL EP管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，4 ℃放置10 min。剩余步驟參照說明書。

1.2.5.2 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系1。反應(yīng)條件：42 ℃ 2 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃10 min，反應(yīng)試劑：Total RNA/mRNA（≤2 μg），4 μL的4×gDNA Eraser Mix，加ddH2O（RNase free）至16 μL。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系2。反應(yīng)條件：42 ℃ 20 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，反應(yīng)試劑：16 μL（體系1）加4 μL的5×TRUE RT Master Mix。逆轉(zhuǎn)錄完成的cDNA用于熒光定量PCR。

1.2.5.3 實時熒光定量 PCR 檢測 反應(yīng)體系如表1所示。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40 cycles。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-Δ（ΔCt）進行分析。

表1 實時熒光定量 PCR 反應(yīng)體系Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction system

1.2.5.4 引物設(shè)計 根據(jù)地衣芽孢桿菌生長代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運以及芽孢形成相關(guān)基因序列信息，以icd、zwf、cydA、relA、brnQ、vpr、yvbW、katA、yqjM、ahpF、sodA以及abrB的基因組序列為模板，以rpSE-F、rpSE-R為內(nèi)參基因，按照qPCR的要求設(shè)計特異性引物，引物序列如表2所示。

表2 擴增引物列表Table 2 List of amplified primers

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所有試驗數(shù)據(jù)為3個平行試驗的平均值，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用Origin 9.0進行作圖以及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌在30 L罐發(fā)酵生長和芽孢形成特征

地衣芽孢桿菌在30 L罐發(fā)酵生長和芽孢形成的特征如圖1所示：細(xì)胞24～36 h處于對數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)由24 h的1.8×1010CFU/mL對數(shù)生長至30 h的峰值（3.0×1010CFU/mL），后自溶至33 h的2.4×1010CFU/mL，并維持穩(wěn)定。同時，芽孢數(shù)由24 h的1.3×1010CFU/mL快速下降至27 h的8.9×109CFU/mL后穩(wěn)定維持到8.6×109CFU/mL（33 h），后緩慢下降至36 h的6.6×109CFU/mL。24 h獲得最大芽孢率72.2%，后降至30 h芽孢率27.7%。30 h峰值細(xì)胞數(shù)是付維來等[26]報道的（30 h，1.2×1010CFU/mL）2.5倍，反映了本發(fā)酵條件完全滿足高密度發(fā)酵的要求。

芽孢桿菌高糖濃度生長會發(fā)生溢流代謝，合成如乙酸等溢流分子[27]，使發(fā)酵前期pH下降。發(fā)酵中后期葡萄糖耗盡后，細(xì)胞吸收溢流代謝產(chǎn)物[28]及氨基酸進行二次利用，因而pH開始回升。本批次發(fā)酵19.5 h時pH已經(jīng)回升至7.5（如圖1所示），說明培養(yǎng)基中糖已基本耗盡[29]。

圖1 地衣芽胞桿菌M52在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長情況Fig.1 Growth of Bacillus licheniformis M52 in the basal medium

以上數(shù)據(jù)說明實驗條件下細(xì)胞生長可以達到較高細(xì)胞數(shù)，但發(fā)酵中后期細(xì)胞生長或芽孢仍存在不利因素。如：對數(shù)生長中后期細(xì)胞氧化應(yīng)激效率、碳源不足等。芽孢桿菌中NADPH主要由磷酸戊糖途徑（HMP）和三羧酸循環(huán)（如異檸檬酸脫氫酶ICD催化）生成，而NADPH是氧化應(yīng)激反應(yīng)中最終的電子受體。因而，后期碳不足引起的NADPH供應(yīng)下降不利于菌體應(yīng)對氧化脅迫[26]。檸檬酸作為ICD底物，經(jīng)代謝可產(chǎn)生NADPH，可能在一定程度上緩解氧化脅迫。因此，在30 L罐水平后續(xù)研究了發(fā)酵19.5 h耦合pH流加檸檬酸對M52生長以及芽孢生成的影響。

2.2 pH耦合補加檸檬酸對地衣芽孢桿菌生長和芽孢數(shù)的影響

發(fā)酵19.5 h耦合pH流加檸檬酸溶液對M52生長以及芽孢生成的影響如圖2所示：19.5～28 h耦合pH7.5補入檸檬酸，24～36 h細(xì)胞處于對數(shù)生長期，24 h的細(xì)胞數(shù)2.3×1010CFU/mL（較不流加檸檬酸的對照發(fā)酵提高了27.8%），30 h細(xì)胞數(shù)3.1×1010CFU/mL，與對照（30 h峰值3.0×1010CFU/mL）接近。但是，與對照生長30 h后劇烈自溶不同的是：流加檸檬酸支撐了細(xì)胞生長至36 h的4.2×1010CFU/mL，較對照峰值提高40.0%。同時，24 h芽孢數(shù)2.1×1010CFU/mL，較對照（24 h芽孢 數(shù)1.3×1010CFU/mL）提 高了61.5%；30 h芽孢數(shù)為2.8×1010CFU/mL，較對照（30 h，8.3×109CFU/mL）提高了250.0%；36 h的芽孢數(shù)是4.1×1010CFU/mL，比對照（24 h芽孢數(shù)1.3×1010CFU/mL、芽孢率72.2%）分別提高了215.4%和25.4%，生長期較對照明顯延長。結(jié)果表明在對數(shù)生長期耦合pH7.5補加檸檬酸可能促進了TCA循環(huán)，降低了菌體受到的氧化脅迫，進而有效促進了生物量和芽孢地持續(xù)增長。

圖2 補加檸檬酸對地衣芽胞桿菌M52生長的影響Fig.2 Effects of citric acid supplementation on the growth of Bacillus licheniformis M52

2.3 檸檬酸對地衣芽孢桿菌能量代謝途徑關(guān)鍵基因表達的影響

劉釗遠(yuǎn)[30]過表達icd（編碼異檸檬酸脫氫酶），顯著提升地衣芽胞桿菌ATP和NADPH的供應(yīng)。蔡冬波[31]構(gòu)建地衣芽孢桿菌WX/pHY-zwf使胞內(nèi)NADPH較對照提高了2.4倍，也增強了TCA循環(huán)icd等基因的表達。因而，考慮到NADPH在氧化應(yīng)激中的作用[32]以及胞子衣蛋白質(zhì)合成、氨基酸轉(zhuǎn)運對能量的需求[20]，需要考察檸檬酸流加對icd、zwf、cydA、citZ等能量代謝相關(guān)基因表達的影響，如圖3所示。

圖3 能量代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組表達差異Fig.3 Differences in expression of carbon metabolism-related genes

流加檸檬酸組citZ（編碼檸檬酸合酶）表達量較對照下調(diào)9%，而icd的表達量是對照的2.6倍，說明檸檬酸流加能夠提高TCA循環(huán)和NADPH的生成效率。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（zwf編碼）是HMP途徑限速酶，催化生成5-磷酸核酮糖和NADPH，zwf表達量是對照組的4.1倍，說明補加檸檬酸能夠提高菌體NADPH供應(yīng)。cydA參與編碼電子傳遞鏈中細(xì)胞色素a氧化酶，其表達量較對照提高了1.9倍，表明補加檸檬酸后細(xì)胞有氧呼吸能力加強，能合成更多ATP，提高細(xì)胞的能量供應(yīng)水平。

2.4 檸檬酸補加對地衣芽孢桿菌氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達的影響

芽孢桿菌高密度發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量活性氧（H2O2等），它們會對胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA等物質(zhì)造成氧化損傷以及引起電子傳遞和ATP合成效率下降，誘導(dǎo)了細(xì)胞氧化應(yīng)激。芽孢桿菌細(xì)胞擁有一套氧化脅迫應(yīng)激體系來應(yīng)對發(fā)酵過程中產(chǎn)生的活性氧，如：H2O2與調(diào)控蛋白PerR互作引起PerR失活[33]，使katA（編碼過氧化氫酶）、ahpF（編碼烷基氫過氧化物還原酶）、sodA（編碼超氧化物歧化酶）、yqjM（編碼黃素氧化還原酶）等基因脫阻遏而大量表達[34-36]，而且NADPH是氧化應(yīng)激反應(yīng)的最終電子受體[23]來消除氧化損傷。檸檬酸顯著促進了細(xì)胞的生長和芽孢的形成效率（圖1～圖2），因而需要考察檸檬酸對氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達的影響，如圖4所示。

圖4 氧化應(yīng)激相關(guān)基因以及abrB表達差異Fig.4 Oxidative stress related genes and abrB expression differences

與對照相比，katA、yqjM、ahpF和sodA分別較對照下調(diào)89%、10%、90%和41%。說明檸檬酸補料發(fā)酵過程中，發(fā)酵體系的氧化脅迫效應(yīng)減弱，這可能與icd和zwf比對照表達提高2.6和4.1倍有關(guān)，因為NADPH是氧化應(yīng)激反應(yīng)的最終電子受體，檸檬酸流加引起了icd與zwf的過量表達，NADPH的供應(yīng)得到顯著增強，進而有效地降低了細(xì)胞的氧化損傷、促進了細(xì)胞生長效率（圖1～圖2）。同時，細(xì)胞也下調(diào)自身氧化應(yīng)激的應(yīng)答水平。這與曾昕[22]關(guān)于NADPH供應(yīng)水平升高時，氧化脅迫水平降低、抗氧化酶相關(guān)基因以及DNA修復(fù)基因均下調(diào)的報道一致。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AbrB直接或間接調(diào)控的基因多達上百個，包括細(xì)胞壁（細(xì)胞膜）的合成、氨基酸的合成和運輸?shù)萚37-38]。如：AbrB在對數(shù)期阻遏sigH的表達，使sigH處于一個較低水平，進而影響spo0A基因的表達。當(dāng)芽孢形成條件適宜時，磷酸化的Spo0A又通過阻遏abrB的表達間接促進SigH水平上升，進而增強spo0A自身表達和芽孢的形成效率。因而，芽孢形成是Spo0A-AbrB調(diào)控系統(tǒng)對培養(yǎng)環(huán)境響應(yīng)平衡的結(jié)果。檸檬酸對abrB表達的影響如圖4所示，abrB表達量較對照下調(diào)60%，說明補料組的Spo0A磷酸化水平較高，進而促進了芽胞生成，使得流加組芽孢數(shù)在36 h達到4.1×1010CFU/mL，比對照峰值提高了204.5%。

2.5 氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因表達差異分析

芽孢桿菌的孢子衣是芽孢蛋白質(zhì)的主要組分，其含量占芽孢總蛋白的80%，因而氨基酸的有效轉(zhuǎn)運是提高芽孢形成效率的前提條件，涉及到蛋白質(zhì)的分解（Vpr蛋白酶）、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白BrnQ、通用氨基酸轉(zhuǎn)運酶YvbW等，另外，由于氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運為次級主動運輸方式，因而其轉(zhuǎn)運效率又受到能量供應(yīng)的影響。檸檬酸對brnQ、vpr和yvbW基因表達的影響如圖5所示。

圖5 氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因表達差異Fig.5 Differential expression of amino acid transporter-related genes

補料組brnQ（編碼BCAA轉(zhuǎn)運蛋白）、vpr（編碼絲氨酸蛋白酶）和yvbW（編碼通用氨基酸轉(zhuǎn)運酶）的表達量較對照分別下調(diào)88%、18%和65%。但24～36 h補料組生物量均高于對照組，說明培養(yǎng)條件下，胞外氨基酸的濃度不是細(xì)胞生長的限制因素。這也與解順昌[9]和趙國緯[10]等的報道一致，也說明了芽孢桿菌發(fā)酵中一味地提高豆粕濃度來促進細(xì)胞和芽孢增長的方法是不盡合理的。

3 結(jié)論

為了提高地衣芽孢桿菌芽孢率，研究了反向耦合pH流加檸檬酸對地衣芽孢桿菌生長、代謝以及芽孢形成的影響（發(fā)酵pH回升至7.5時啟動流加檸檬酸至28 h，罐內(nèi)檸檬酸終濃度78 μmol/L）。結(jié)果表明：檸檬酸的流加增強了TCA循環(huán)、HMP途徑以及電子傳遞鏈效率，減弱了氧化脅迫效應(yīng)、abrB表達量較對照下調(diào)60%提高了Spo0A的磷酸化水平。

高豆粕、蛋白胨等氮源濃度芽孢桿菌高密度發(fā)酵一定程度上能提高生物量和芽孢數(shù)，但芽孢桿菌高芽孢率工業(yè)發(fā)酵的瓶頸并不是氮源不足，而是發(fā)酵過程產(chǎn)生的氧化脅迫限制了氮源（如胞外氨基酸）的利用效率，進而影響了細(xì)胞和芽孢的生成效率。