基于高通量測序技術(shù)的不同產(chǎn)地腐乳微生物多樣性分析

付瑞敏，劉春雷，徐 良，張 紅，夏鐵騎，陳五嶺

（1.河南財(cái)政金融學(xué)院體育與健康管理學(xué)院，河南鄭州 450046；2.陜西師范大學(xué)食品學(xué)院，陜西西安 710069）

腐乳，又稱為“東方奶酪”，是我國一種傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，它起源于我國大約兩千年前的魏朝，因其獨(dú)特的營養(yǎng)和功能成分、芳香和風(fēng)味特性而被國人廣泛用作調(diào)味品和開胃菜[1]。經(jīng)過微生物發(fā)酵后的腐乳以其低膽固醇、高蛋白和高鈣等營養(yǎng)特點(diǎn)而被人們認(rèn)為是一種健康食品。根據(jù)參與發(fā)酵的微生物類型不同，可將腐乳分為細(xì)菌發(fā)酵、霉菌發(fā)酵和自然發(fā)酵等三種類型。其中，以放線菌、毛霉和根霉為發(fā)酵劑的霉菌發(fā)酵法最為普遍[2]。

腐乳中的微生物可代謝合成產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，其群落構(gòu)成在調(diào)節(jié)腐乳產(chǎn)品風(fēng)味方面發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為是決定腐乳最終質(zhì)量的關(guān)鍵因素[3-5]。腐乳發(fā)酵前期，葡萄球菌屬、明串珠菌屬和毛霉屬占據(jù)了優(yōu)勢，其酶系分泌活躍，使得產(chǎn)品中谷氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸等含量有較大幅度增長，苯丙氨酸和亮氨酸可進(jìn)一步形成醇類化合物，這些醇類化合物可和霉菌分泌的脂肪酶降解豆腐中粗脂肪所產(chǎn)生的脂肪酸以及細(xì)菌代謝產(chǎn)生的乙酸、乳酸等發(fā)生酯化反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生乳酸乙酯、乙酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)[6]。芽孢桿菌屬和假單胞菌屬也可分解蛋白和脂肪，在腐乳后發(fā)酵階段產(chǎn)生醇類、酯類和吡嗪類等風(fēng)味物質(zhì)；這些微生物通過合成代謝產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)。不同的微生物組成受其產(chǎn)地的環(huán)境群落及氣候特點(diǎn)等多種因素的影響，這導(dǎo)致不同產(chǎn)地的腐乳中微生物群落存在復(fù)雜多樣的差異[7]。因此，闡明腐乳發(fā)酵過程中微生物的組成及其與食品性質(zhì)的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上對腐乳發(fā)酵進(jìn)行合理的菌群設(shè)計(jì)是進(jìn)一步提高腐乳發(fā)酵質(zhì)量的必要條件。當(dāng)前，有許多研究使用純培養(yǎng)技術(shù)來揭示腐乳中的優(yōu)勢菌群，但這種技術(shù)受限于純培養(yǎng)，對于含量較低、沒有菌株分離、培養(yǎng)和鑒定過程的情況無法對腐乳中的整體微生物概況進(jìn)行全面分析[8]。

近年來，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）作為新一代測序技術(shù)以其價(jià)格低廉、可讀量大等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于探索各種豆豉、醋和米酒等生態(tài)系統(tǒng)中微生物的多樣性，徐瓊等[9]采用高通量測序技術(shù)分析不同地區(qū)紅腐乳的細(xì)菌多樣性，然而關(guān)于腐乳細(xì)菌及真菌的微生物群落同其產(chǎn)地和化學(xué)成分之間關(guān)系的研究還鮮見報(bào)道。

基于此，本研究以我國東部、南部和北部等不同地區(qū)所產(chǎn)的16種腐乳為研究對象，采用高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)對腐乳中的細(xì)菌16S rRNA基因和真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）基因進(jìn)行測序，并針對腐乳中微生物多樣性、關(guān)鍵微生物種屬與腐乳化學(xué)性質(zhì)、區(qū)域分布和調(diào)味處理的相關(guān)性展開研究，以期為提高傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品的品質(zhì)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16種腐乳樣品 通過京東、淘寶等線上平臺購自國內(nèi)華東、華南和華北地區(qū)，具體編號、品牌、產(chǎn)地及調(diào)味方式如表1所示；實(shí)驗(yàn)中所用試劑 均購自鄭州優(yōu)吉生物科技有限公司，所有試劑純度均為分析純；磁珠法通用型基因組DNA提取試劑盒（DP705） 天根生化科技有限公司。

表1 腐乳16種樣品的產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of 16 sufu samples

歐萊博9830凱氏定氮儀 濟(jì)南歐萊博科技有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)有限公司；Sub-Cell GT電泳儀 美國伯樂；NanoPhotometer N60分光光度計(jì) 德國implen；Gene Amp 9700PCR儀 成都東勝科創(chuàng)；GelSMART凝膠成像儀 北京海鵬翔；Illumina Miseq高通量測序平臺 上海派森諾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和高通量測序

1.2.1.1 DNA提取 從16種不同的腐乳產(chǎn)品中各取1.0 g腐乳樣品，使用基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取和純化。參考余巨全等[10]的方法，對所得到的基因組DNA進(jìn)行純度和濃度檢測。吸取1.0 μL的DNA將其加至分光光度計(jì)中以檢測所得基因組DNA中A260與A280的比值，以檢測所得DNA的純度；吸取2.5 μL的DNA將其加至1%的瓊脂糖凝膠中，并將所得結(jié)果置于凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行成像以檢測所得DNA的濃度。

1.2.1.2 PCR擴(kuò)增 針對細(xì)菌16S rDNA基因的V3和V4區(qū)域合成帶barcode的引物338F 5'-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3'、806R 5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'，針對真菌rRNA ITS2的保守序列合成帶barcode的引物5'-TCCGTAGGTGGA ACCTGCGG-3'、5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。以所提取的DNA為模板，使用Gene Amp 9700PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系：基因組模板DNA 2 μL，5×PCR Master Mix 5 μL，正反引物各0.5 μL，用雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。細(xì)菌PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)處理3 min；30循環(huán)（94 ℃變性25 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s），72 ℃延伸5 min。真菌PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)處理3 min；32循環(huán)（94 ℃變性30 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s），72 ℃延伸5 min。用0.01 g/mL瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物并使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，而后使用Illumina Miseq進(jìn)行高通量測序。

1.2.2 腐乳樣品的化學(xué)成分測定

1.2.2.1 樣品處理 取腐乳樣品20 g并將其分別置于研缽中，用杵磨成糊狀，然后用80 mL去離子水在60 ℃下溶解。將混合物輕輕攪拌并煮沸，然后轉(zhuǎn)入200 mL的容量瓶中，用水稀釋至總體積200 mL。將制備好的腐乳懸浮液過濾，取濾液進(jìn)行化學(xué)成分的測定。

1.2.2.2 氨基酸態(tài)氮含量的測定 以蒸餾水為空白對照，吸取10 mL的樣品濾液，將其加入盛有90 mL蒸餾水的三角瓶（250 mL）中，將其充分混勻后，再加入10 mL的甲醛溶液（濃度為0.36 g/mL），用濃度為0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定，直至pH為9.2，通過計(jì)算氫氧化鈉溶液的消耗量來計(jì)算腐乳樣品中的氨基氮含量[11]。

1.2.2.3 水溶性蛋白質(zhì)含量的測定 以蒸餾水為空白對照，吸取10 mL的樣品濾液，將其加入盛有50 mL蒸餾水的三角瓶（150 mL）中，充分混勻后100 ℃水浴加熱10 min，待溫度降至室溫后將其轉(zhuǎn)入容量瓶（100 mL）中，參照GB 5009.5-2016中的第一法進(jìn)行水溶性蛋白質(zhì)的測定，其中蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為5.71[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用測序數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件Trimmomatic對原始FASTQ文件進(jìn)行質(zhì)量控制。使用UPARSE7.1軟件（http://drive5.com/uparse/）對操作分類單元（operational taxonomic unit，OTUs）進(jìn)行預(yù)聚類，其序列一致性截?cái)嗦蕿?7%。真菌ITS和細(xì)菌16S rRNA的所有操作分類單元均采用核糖體數(shù)據(jù)庫程序（RDP）分類器（http://rdp.cme.msu.edu/）對Silva（SSU128）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類，置信閾值為70%。

使用美吉生物云平臺的（www.majorbio.com）的免費(fèi)在線平臺對所獲序列進(jìn)行生信統(tǒng)計(jì)分析。使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）的α多樣性模塊對樣品中Shannon、Simpson、Coverage和Chao1指數(shù)進(jìn)行alpha多樣性統(tǒng)計(jì)與分析，其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)代表樣品中的菌落多樣性，coverage代表樣品文庫的覆蓋率、Chao1指數(shù)代表菌落豐度。使用Mann-Whitney檢驗(yàn)對樣本間各操作分類單元（OTU）相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)差異分析，P＜0.05表示差異顯著。使用Majorbio Cloud platform（www.majorbio.com）的免費(fèi)在線平臺進(jìn)行主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA）和層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）。最后使用R語言進(jìn)行微生物群落組成與腐乳化學(xué)成分之間的典范對應(yīng)分析（Canonical correspondence analysis，CCA）和冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐乳樣品的文庫構(gòu)建及測序數(shù)據(jù)分析

使用高通量測序技術(shù)，對來自不同地區(qū)的16份腐乳樣品進(jìn)行微生物多樣性分析。共獲得1032656個(gè)真菌群落的讀數(shù)（OTU范圍從22到239）以及689359個(gè)細(xì)菌群落的讀數(shù)（OTU范圍從68到289），樣品中真菌ITS和細(xì)菌16S rRNA序列的覆蓋度均大于99.90%，具有較好的微生物群落代表性。對所得樣本序列進(jìn)行隨機(jī)取樣，將抽到的樣本序列與其代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，并以此來對測序數(shù)據(jù)量的合理性予以說明。所得結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，16個(gè)腐乳樣本的稀釋曲線均趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理，文庫構(gòu)建合理，測序深度可較好地反映微生物群落的信息[13]。

圖1 16種腐乳樣品的稀釋性曲線Fig.1 Dilution curves in the 16 sofu samples

2.2 腐乳樣品的真菌多樣性分析

α多樣性分析可反映測序樣本中微生物群落的物種豐度和多樣性，本研究采用ACE、Chao1、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)對對腐乳樣本中的真菌α-多樣性進(jìn)行評價(jià)，所得結(jié)果如表2及圖2～圖3所示。

表2 16種腐乳樣品中真菌的α多樣性分析Table 2 α diversity analysis of fungi in 16 sofu samples

其中，表2中的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)代表的是樣本中微生物菌落的豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)代表的是樣本中微生物菌落的多樣性，但具體代表的值有所差別。Shannon指數(shù)值越大，代表微生物群落的多樣性越高；Simpson指數(shù)越大，卻代表微生物群落多樣性越低。Coverage指的是所測樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值的高低反映了所得到的測序結(jié)果是否完全代表樣本的微生物群落[9]。從表2中可看到，所有樣本的覆蓋率均大于99%，說明文庫的覆蓋率基本涵蓋樣本中所有序列，本次測序結(jié)果可以代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

在真菌多樣性方面，16個(gè)樣本中的BJ18以最高的ACE（246.280）、Chao1（242.667）、Shannon指數(shù)（4.231）和最低的Simpson指數(shù)（0.046）而展現(xiàn)出最高的真菌豐度和多樣性。BJ19和SH8分別以較低的ACE（27.057和46.035）和Chao（25.667和45.333）以及較高的Simpson指數(shù)（0.557和0.706）展現(xiàn)出較低的真菌豐度和多樣性。在腐乳樣品中，數(shù)量最多的5個(gè)真菌屬分別為土赤殼屬（Ilyonectriasp.）、剛毛藻屬（Cadophorasp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）、指趾藤屬（Dactylonectriasp.）和瓶霉菌屬（Phialophorasp.）（圖2），平均占真菌群落組成的56.08%。此外，不同的腐乳樣品在真菌屬成分上存在顯著差異，這可能與腐乳產(chǎn)地、發(fā)酵原料和發(fā)酵工藝的不同有關(guān)[14]。

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）腐乳16個(gè)樣品所得到的真菌屬相對豐度百分比如圖2所示。16種腐乳樣品中的微生物群落主要由土赤殼屬（Ilyonectriasp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）、酵母屬（Saccharomycopsissp.）、放射毛霉屬（Actinomucorsp.）、假絲酵母屬（Candidasp.）、根霉屬（Rhizopussp.）等胞外水解酶產(chǎn)生菌組成。此外，還存在剛毛藻屬（Cadophorasp.）、枝孢屬（Cladosporiumsp.）、束毛藻屬（Trichomeriumsp.）、瓶霉屬（Phialophorasp.）和鐮刀菌屬（Fusariumsp.）等大量的大豆共生體和病原菌。在產(chǎn)生水解酶的屬中，放射毛霉屬（Actinomucorsp.）在除了SH8和BJ19的其余14個(gè)腐乳樣本中均有分布，而根霉（Rhizopussp.）分布比較有限，僅在ZJ1（2.11%）中被檢測出；綜合對比各樣本中的真菌多樣性，推測放射毛霉屬（Actinomucorsp.）比其他絲狀屬更適合作為腐乳生產(chǎn)發(fā)酵劑中的水解酶生產(chǎn)菌[15]。此外，在16個(gè)腐乳樣品中均檢測到了曲霉屬（Aspergillussp.），平均占所有屬的8.65%，在樣本SH8中更是以85.32%的比例占絕對優(yōu)勢。有報(bào)道稱曲霉在腐乳生產(chǎn)過程中的后發(fā)酵中非常重要并占主導(dǎo)地位[16]，這與本研究的結(jié)果一致。

圖2 16種腐乳樣品中真菌屬的相對豐度百分比（%）Fig.2 Relative abundance percentages (%) of the fungal genera in 16 sufu samples

利用主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA）和層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）對16種腐乳中真菌組成的異同進(jìn)行了分析，所得結(jié)果如圖3所示。根據(jù)PCoA圖，主坐標(biāo)成分PC1和PC2分別占真菌群落方差的36.98%和18.86%。中國東部地區(qū)的真菌（ZJ2、ZJ4、ZJ5、ZJ6、SH9、AH11和JX12）可以歸為一組，說明腐乳的真菌群落可能受地理因素的影響，因?yàn)閬碜酝坏貐^(qū)的樣品在進(jìn)行腐乳發(fā)酵制備時(shí)通常具有相似的溫度和水分條件[17]。除此之外，課題組研究發(fā)現(xiàn)，中國南方（GD14、GL15、LGM16）和中國北方（JL17、BJ18和BJ20）各樣本間的距離均比較近，表明這些樣本之間的菌群差異性較小，可歸為一類，這表明除了地理因素之外，還有其它因素可影響腐乳真菌的多樣性。這些腐乳產(chǎn)品可能使用類似的接種發(fā)酵劑、大豆原料或預(yù)發(fā)酵工藝[18]，這還需要進(jìn)一步確認(rèn)。另一方面，花香調(diào)味的ZJ1、ZJ4、ZJ5、SH9、BJ19以及酒香調(diào)味的ZJ2、ZJ6、SH8、AH11、GL15、JL17、BJ20和香辛調(diào)味的JX12、GD14、GZ16、BJ18這3組不同調(diào)味香料的樣品在PCoA圖中呈現(xiàn)不規(guī)則的分布，這表明調(diào)味香料不是影響腐乳中真菌群落組成的主要因素。

圖3 16種腐乳樣品中真菌組成的主坐標(biāo)分析（A）和層次聚類分析（B）Fig.3 Principal coordinate analysis (A) and hierarchical cluster analysis (B) of the fungal genus compositions among 16 sufu samples

2.3 腐乳樣品中的細(xì)菌多樣性分析

16種腐乳樣品的細(xì)菌α多樣性檢測結(jié)果如表3所示。在細(xì)菌多樣性方面，16個(gè)樣本中的ZJ1以最高的ACE（230.465）、Chao（186.895）、Shannon指數(shù)（1.117）和最低的Simpson指數(shù)（0.297）而展現(xiàn)出最高的細(xì)菌豐度和多樣性。BJ19和GZ16分別以較低的ACE（39.697和86.113）和Chao（39.500和85.857）以及較高的Simpson指數(shù)（0.523和0.565）展現(xiàn)出較低的細(xì)菌豐度和多樣性。對比真菌的α多樣性結(jié)果，BJ19的細(xì)菌α多樣性與真菌的α多樣性結(jié)果一致，說明該產(chǎn)品在腐乳的發(fā)酵過程中應(yīng)該是選用了特殊的發(fā)酵或加工方法[19]。此外，ZJ2和JX12的Shannon值最高，分別為2.187和2.162，Simpson值最低，分別為0.321和0.153，說明其菌群分布較其他樣本更為均勻。而AH11的Shannon值最低（0.844），Simpson值最高（0.677），表明該樣品中以少數(shù)物種為主[20]。

表3 16種腐乳樣品中細(xì)菌的α多樣性分析Table 3 α diversity analysis of bacteria in 16 sufu samples

16個(gè)腐乳樣品中細(xì)菌屬的相對豐度百分比如圖4所示，16份腐乳樣品中平均菌群含量排名前6位的是乳球菌屬（Lactococcussp.）（33.83%）、芽孢桿菌（Bacillussp.）（11.79%）、四聯(lián)球菌（Tetragenococussp.）（7.72%）、腸桿菌（Enterobactersp.）（6.36%）、鏈球菌（Streptococcuasp.）（6.10%）和明串珠菌（Leuconostocsp.）（5.72%），占菌群組成的71.52%，這與alpha多樣性分析結(jié)果一致，即細(xì)菌群落傾向于以少數(shù)物種為主[21]。

從圖4中還可以看到，腐乳樣品中的細(xì)菌群落由可水解蛋白的芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、乳桿菌屬（Lactobacillussp.）、魏斯氏菌屬（Weissellasp.）、梭菌屬（Clostridiumsp.）、腸球菌屬（Enterococcussp.）、棒狀桿菌屬（Corynebacteriumsp.）等增味菌和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）等潛在的致病性或腐敗菌株組成。所有腐乳產(chǎn)品中，乳球菌屬（Lactococcussp.）最占優(yōu)勢，在腐乳樣本ZJ1、GL15、SH9、JL17、ZJ2、ZJ5和GZ16中分布范圍高達(dá)42.28%～76.69%。鏈球菌（Streptococcussp.）在SH8和BJ19中分布范圍高達(dá)59.04%和16.36%。明串珠菌屬（Leuconostocsp.）在樣品SH9、GZ16和GD14中分別為35.21%、21.47%和13.67%。魏斯氏菌屬（Weissellasp.）在BJ19、JX12和BJ20中的分布占12.68%、10.14%和10.00%。樣品JL17中以乳酸菌（Lactobacillussp.）含量較高，為32.66%。這些不同樣品中的微生物組成支持了乳酸菌在腐乳發(fā)酵中的重要性和復(fù)雜機(jī)制。此外，從圖4中看到，芽孢桿菌菌株廣泛存在于樣品AH11、JX12和GD14中，但在許多其他腐乳樣品中分布較少。

圖4 16種腐乳樣品細(xì)菌屬的相對豐度百分比（%）Fig.4 Relative abundance percentages (%) of the bacterial genera in 16 sufu samples

利用主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA）和層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）對16種腐乳中細(xì)菌組成的異同進(jìn)行了分析，所得結(jié)果如圖5所示。與真菌群落相似，不同腐乳樣品的細(xì)菌群落差異顯著。16種腐乳樣品大體可分為乳酸桿菌類進(jìn)化支（ZJ2、ZJ5、SH9、ZJ1、GL17、BJ20）和芽孢桿菌進(jìn)化支（ZJ4、ZJ6、AH11、JX12、GD14）。這與之前對黃酒發(fā)酵的研究一致，8種發(fā)酵劑中有4種菌群以乳酸菌為主，而其余4個(gè)以芽孢桿菌為主。芽孢桿菌能提供多種水解酶，加速發(fā)酵物質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物的降解，但芽孢桿菌對腐乳發(fā)酵的起源、影響及意義有待進(jìn)一步研究。與真菌群落不同的是，樣品中的細(xì)菌群落沒有按區(qū)域進(jìn)行聚類，說明腐乳樣品中的細(xì)菌群落具有較強(qiáng)的變異性，可能受到多種因素的影響。與真菌群落相似，16種不同產(chǎn)品的菌群在發(fā)酵后也不能很好地按照調(diào)味方式進(jìn)行聚類。因此可得出以下結(jié)論：腐乳中的細(xì)菌群落比真菌群落變化更大，其群落多樣性在發(fā)酵后可能受到氣候變化、浸泡和鹽漬等高滲處理等多種因素的影響。

圖5 16種腐乳樣品中細(xì)菌屬組成的主坐標(biāo)分析（A）和層次聚類分析（B）Fig.5 Principal Coordinate Analysis (A) and Hierarchical Cluster Analysis (B) of the bacterial genus compositions among 16 sufu samples

2.4 腐乳樣品中的化學(xué)成分分析

對選自華東、華南、華北等不同產(chǎn)地的16份腐乳樣品中可溶性蛋白和氨基氮含量等化學(xué)成分進(jìn)行檢測，所得結(jié)果如表4所示。從表中可以看出，不同產(chǎn)地對于腐乳中的化學(xué)成分具有一定的影響，比如，華東產(chǎn)區(qū)中，產(chǎn)自浙江的腐乳樣品（ZJ1、ZJ2、ZJ4、ZJ5、ZJ6）和產(chǎn)自上海的腐乳樣品（SH8和SH9）中的可溶性蛋白含量和氨基氮含量彼此間比較接近，說明這些腐乳樣品中所使用的發(fā)酵劑菌種具有較為相近的產(chǎn)蛋白酶能力。同時(shí)，產(chǎn)自安徽和江西的腐乳樣品（AH11）和（JX12）可溶性蛋白含量和氨基氮含量明顯高于其它華東地區(qū)的腐乳樣品，結(jié)合前邊的細(xì)菌豐度檢驗(yàn)結(jié)果，推測是由于這兩種樣品中含量較為豐富的芽孢桿菌作用所致，為驗(yàn)證該推測，課題組又檢測了也具有高豐度的芽孢桿菌分布的產(chǎn)自華南地區(qū)GD14樣品中的可溶性蛋白和氨基氮含量，發(fā)現(xiàn)該腐乳樣品也具有較高的可溶性蛋白和氨基氮含量，這說明芽孢桿菌在腐乳發(fā)酵的蛋白質(zhì)分解中扮演極為重要的角色。

表4 16種腐乳樣品的化學(xué)成分測定Table 4 Chemical determination of 16 different sufu samples

3 討論

研究表明，醬油、醋、腐乳等發(fā)酵調(diào)味品中的微生物組成是決定其最終質(zhì)量的關(guān)鍵因素[22]。本研究基于高通量測序技術(shù)，將腐乳發(fā)酵過程中微生物群落、化學(xué)成分、產(chǎn)地及風(fēng)味相關(guān)性進(jìn)行了探討分析，以期揭示腐乳發(fā)酵過程中微生物多樣性的影響因素及潛在后果。

研究中課題組發(fā)現(xiàn)華東地區(qū)所產(chǎn)的腐乳樣本中的真菌群落可大致分為一類，這說明了地理因素在腐乳發(fā)酵過程中的重要作用。然而，腐乳樣品中的細(xì)菌群落就不能很好地按照地域進(jìn)行聚類，這表明細(xì)菌群落在腐乳發(fā)酵過程中的變異性更大，除去地理?xiàng)l件之外，還可能受到加工技術(shù)及發(fā)酵環(huán)境因素的影響，這和前人的報(bào)道相一致[23]。

微生物多樣性分析有助于揭示腐乳發(fā)酵的關(guān)鍵菌群和功能菌群，為今后腐乳發(fā)酵菌群的合理設(shè)計(jì)提供依據(jù)。結(jié)果表明，放射毛霉屬（Actinomucorsp.）作為產(chǎn)水解酶的真菌，在腐乳發(fā)酵過程中起著極為重要的作用，通過分析16種腐乳樣品的真菌多樣性，發(fā)現(xiàn)放射毛霉屬（Actinomucorsp.）作為優(yōu)勢菌以較高的豐度百分比廣泛分布于華南、華東和華北等多個(gè)產(chǎn)地的腐乳樣品樣本（GD14、ZJ1、AH11、BJ20）中；此外，課題組也在16種腐乳樣品中檢測到大量的可產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等水解酶的曲霉屬（Aspergillussp.），這些曲霉因其可廣泛增加可溶性蛋白含量和氨基氮水平等特點(diǎn)被廣泛用于豆制品的食品發(fā)酵中，腐乳樣品的真菌多樣性分析結(jié)果說明毛霉和曲霉對于腐乳的發(fā)酵生產(chǎn)具有極為重要的作用。陳卓等發(fā)現(xiàn)放射毛霉屬是紅腐乳發(fā)酵前期的主要菌種之一，紅曲霉在發(fā)酵后占主導(dǎo)地位，該觀點(diǎn)和本研究所得結(jié)果一致[24]。

本研究中根據(jù)細(xì)菌屬的豐度，可將16種腐乳樣品的細(xì)菌群落分為兩大進(jìn)化支：乳酸菌進(jìn)化支和芽孢桿菌進(jìn)化支。這兩個(gè)分支的存在引起了課題組對于芽孢桿菌在豆制品發(fā)酵中的潛在作用的關(guān)注。芽孢桿菌是對食品發(fā)酵至關(guān)重要的菌種[25]，它可以產(chǎn)蛋白酶等水解酶，因而在腐乳的發(fā)酵和成熟中發(fā)揮重要作用；本研究通過對比AH11、JX12和GD14這三個(gè)產(chǎn)地的細(xì)菌多樣性結(jié)果和化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)腐乳樣品中可溶性蛋白和氨基氮的含量同芽孢桿菌的含量呈現(xiàn)正相關(guān)，這為后期針對不同用戶需求設(shè)計(jì)生產(chǎn)腐乳發(fā)酵劑提供了理論依據(jù)。此外，腐乳樣品中的細(xì)菌多樣性分析結(jié)果顯示，包括乳球菌屬（lactococcussp.）和鏈球菌（Streptococcuasp.）在內(nèi)的乳酸菌廣泛地存在于16種腐乳樣品中，研究顯示，這些菌群腐乳pH及風(fēng)味的維持及生物防腐等方面發(fā)揮著重要影響[26]。

HTS技術(shù)可有效地揭示腐霉樣品中細(xì)菌和真菌生態(tài)系統(tǒng)的整體狀況。采用高通量測序，不僅檢測出毛霉、曲霉和芽孢桿菌以及乳酸菌等優(yōu)勢菌群在各樣品中的分布豐度，也檢測出短梗霉（Aureobasidiumsp.）、聚孢霉（Clonostachyssp.）和金黃桿菌屬（Chrysobacteriumsp.）等腐乳中的一些稀有屬在AH11、ZJ2、SH9、ZJ5、ZJ6和ZJ4等樣本中具有豐富的含量。研究表明，這些稀有屬均來自于大豆材料[27]，且其存在會影響腐乳發(fā)酵微生物群落的組成[28-29]，具體影響機(jī)制還需要對腐乳發(fā)酵過程中微生物多樣性及其特性的動(dòng)態(tài)變化做進(jìn)一步的研究。