2 型糖尿病合并白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中PEDF和VEGF的表達(dá)及意義

胡亞茹，陳 悅，韓 雪，陳亞茹，馬竹宇，王劍鋒

0 引言

白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未完全明確。年齡相關(guān)性白內(nèi)障被認(rèn)為是晶狀體衰老過(guò)程，同時(shí)伴隨晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)功能性狀改變和多種細(xì)胞因子的表達(dá)異常。研究表明色素上皮細(xì)胞衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)表達(dá)與衰老有密切的關(guān)系[1]。劉恬等[2]研究發(fā)現(xiàn)6歲以下的先天性白內(nèi)障LECs中PEDF的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于50歲以上年齡相關(guān)性白內(nèi)障，提示PEDF的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致晶狀體的老化，下調(diào)程度隨著晶狀體的混濁程度加重進(jìn)一步加重。糖尿病患者更容易發(fā)生白內(nèi)障，具體機(jī)制尚不確切，本研究通過(guò)檢測(cè)2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者LECs中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和PEDF表達(dá)水平，探討2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，為預(yù)防和減緩糖尿病患者發(fā)生白內(nèi)障提供新的途徑。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象回顧性研究。選擇2020-08/2021-04在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科就診并實(shí)施手術(shù)的2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障和年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者各30例30眼。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡50～80歲；(2)白內(nèi)障病史大于1a；(3)均符合白內(nèi)障診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且均有手術(shù)指征，無(wú)影響視力的嚴(yán)重并發(fā)癥；(4)白內(nèi)障核硬度分級(jí)[3-4]≥Ⅱ級(jí)；(5)手術(shù)均順利；(6)晶狀體后囊膜完整；(7)2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者糖尿病病史大于1a，血糖水平控制平穩(wěn)，術(shù)前未發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并增殖性糖尿病視網(wǎng)膜血管疾病、視神經(jīng)炎、葡萄膜炎、高度近視、青光眼等病史；(2)合并除糖尿病之外的其它系統(tǒng)性疾??；(3)合并嚴(yán)重干眼；(4)過(guò)熟期白內(nèi)障；(5)有眼部外傷、手術(shù)及眼底激光史；(6)臨床資料不完整。所有患者均知情同意，并已通過(guò)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器Trizol試劑(購(gòu)自Invitrogen公司)、SYBR?Green(Takara公司)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑(ThermoFisher公司)、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)；VEGF和PEDF抗體(Proteintech公司)，HRP標(biāo)記抗體(Biosharp公司)；Tecan M1000多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tex公司)、組織研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)、Real-time PCR儀(7500)(美國(guó)ABI公司)、Nanpdrop one超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(ThermoFisher公司)。

1.2.2標(biāo)本采集常規(guī)白內(nèi)障超聲乳化吸除術(shù)中連續(xù)環(huán)形撕囊，撕除晶狀體中央5.5～6.0mm的前囊膜(含LECs)，將切口處的血擦干凈，再將囊膜從切口取出，然后用生理鹽水沖洗，清除囊膜表面殘留的黏彈劑、血跡、房水；將囊膜分為2份，兩份大小盡量相似，一份立即放入無(wú)菌EP管中，-80℃冰箱保存，用于蛋白檢測(cè)。另一份放入含Trizol的EP管-20℃冰箱保存以進(jìn)行mRNA的檢測(cè)。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)LECs中VEGF和PEDFmRNA的表達(dá)因單個(gè)囊膜中蛋白和RNA含量較少，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果，標(biāo)本按相近原則將10例囊膜標(biāo)本(每例為半個(gè)囊膜)合并為1組樣本。使用組織碾磨機(jī)對(duì)兩組樣本進(jìn)行粉碎性碾磨，用Trizol法提取兩組標(biāo)本的總RNA，20μL的DEPC液進(jìn)行溶解，然后測(cè)量?jī)山MRNA的濃度及純度，RNA純度較好時(shí)根據(jù)不同的RNA濃度逆轉(zhuǎn)錄成RNA對(duì)應(yīng)的第一鏈cDNA。逆轉(zhuǎn)錄完成后按照相同比例對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)稀釋，同時(shí)按照引物說(shuō)明書將引物濃度稀釋至10μmol/L，震蕩混勻之后進(jìn)行qRT-PCR加樣和上機(jī)，檢測(cè)VEGF和PEDF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4Western-blot檢測(cè)LECs中VEGF和PEDF蛋白的含量標(biāo)本按相近原則將10例囊膜標(biāo)本(每例為半個(gè)囊膜)合并為1組樣本。使用組織碾磨機(jī)對(duì)兩組樣本進(jìn)行粉碎性碾磨，加入裂解液對(duì)組織進(jìn)行裂解，提取總蛋白,然后以標(biāo)準(zhǔn)BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量。按照Western-blot標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和顯色，最后等體積混合A液和B液(0.5mL：0.5mL)配制成ECL發(fā)光液并以凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光成像,用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，觀察VEGF和PEDF蛋白的表達(dá)情況。晶狀體囊膜標(biāo)本按相近原則將10例合并為1組樣本，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1兩組患者一般資料比較本研究共納入年齡相關(guān)性白內(nèi)障和2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者各30例。兩組患者性別及晶狀體核硬度，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)，兩組患者年齡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2兩組患者LECs中VEGF和PEDFmRNA表達(dá)情況兩組患者LECs中均存在VEGF、PEDF的表達(dá)。2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障組中VEGF mRNA表達(dá)水平高于年齡相關(guān)性白內(nèi)障組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障組中PEDF mRNA水平低于年齡相關(guān)性白內(nèi)障組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者LECs中VEGF和PEDF mRNA及蛋白的表達(dá)情況

2.3兩組患者LECs中VEGF和PEDF蛋白表達(dá)情況2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障組患者LECs中VEGF蛋白的表達(dá)量高于年齡相關(guān)性白內(nèi)障組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障組患者LECs中PEDF的蛋白表達(dá)量低于年齡相關(guān)性白內(nèi)障組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

3 討論

與年齡相關(guān)性白內(nèi)障相比，糖尿病患者白內(nèi)障發(fā)生早，進(jìn)展快，是糖尿病主要并發(fā)癥之一，發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，近年研究其與多種細(xì)胞因子的表達(dá)異常有關(guān)。VEGF是新生血管形成的強(qiáng)效誘導(dǎo)因子，可由多種細(xì)胞分泌，刺激新生血管生長(zhǎng)，大量研究主要聚焦在糖尿病視網(wǎng)膜病變、濕性年齡相關(guān)性黃斑變性等眼部新生血管性疾病，呈高表達(dá)狀態(tài)。PEDF是一種多效能多肽因子[5]，分布于全身多種組織并參與其生理病理過(guò)程，1999年Dawson等[6]首次發(fā)現(xiàn)PEDF具有很強(qiáng)的血管抑制作用，對(duì)多種血管生成刺激因子具有活性。PEDF已在眼內(nèi)多種組織中檢測(cè)到，調(diào)節(jié)正常血管狀態(tài)及視網(wǎng)膜分化，角膜、玻璃體等眼內(nèi)無(wú)血管組織透明非血管狀態(tài)的維持可能與PEDF有關(guān)[7]。

PEDF與VEGF被公認(rèn)為是一對(duì)新生血管生成調(diào)控因子，大量研究證明這一對(duì)因子在視網(wǎng)膜新生血管相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用。PEDF與VEGF具有相反的作用，當(dāng)PEDF表達(dá)下降時(shí)，VEGF表達(dá)水平升高，二者之間相互制約，相互調(diào)節(jié)，在正常視網(wǎng)膜組織中VEGF、PEDF的表達(dá)維持在一定的水平，參與視網(wǎng)膜某些正常生理功能，兩者保持著平衡，相互制約。當(dāng)患者由于高血糖、血管阻塞等原因，使視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙，導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血，兩者之間的平衡關(guān)系被打破，視網(wǎng)膜組織中VEGF表達(dá)升高，PEDF表達(dá)減少，在非增殖期和臨床前期視網(wǎng)膜血管病變中發(fā)揮了重要的作用，并促進(jìn)了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[8]。汪浩等[9]觀察2型糖尿病患者房水中VEGF水平升高，PEDF表達(dá)水平明顯降低，提示糖尿病患者房水中存在VEGF與PEDF的失衡，可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。陳艷文[10]觀察糖尿病合并白內(nèi)障患者房水中VEGF及炎性因子IL-6、IL-8的表達(dá)明顯升高，我們以前的研究結(jié)果也顯示糖尿病合并白內(nèi)障患者房水中IL-6、VEGF的表達(dá)升高，并與術(shù)后黃斑水腫有一定的相關(guān)性，提示炎癥反應(yīng)及眼內(nèi)VEGF水平的變化與糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生有密切相關(guān)性[11]。

2005年Segev等[12]利用cDNA微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)人晶狀體前囊下的LECs中存在PEDF。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PEDF的表達(dá)位于LECs胞漿內(nèi)[13]。根據(jù)在其它組織細(xì)胞中PEDF生物學(xué)特性的研究結(jié)果[14-15]，PEDF可反映細(xì)胞增殖潛能，而且在細(xì)胞周期復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起負(fù)性效應(yīng)，是表達(dá)廣泛的細(xì)胞生存/保護(hù)因子。晶狀體作為一個(gè)無(wú)血管組織，認(rèn)為晶狀體中合成與表達(dá)PEDF是為了維持無(wú)血管化，推測(cè)PEDF的存在可能是晶狀體在進(jìn)化過(guò)程中獲得的血管生成抵御機(jī)制。

劉恬等[16]檢測(cè)到6歲以下的先天性白內(nèi)障LECs中PEDF的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于50歲以上年齡相關(guān)性白內(nèi)障，提示PEDF的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致晶狀體的老化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)性白內(nèi)障前囊下LECs中PEDF的蛋白和基因表達(dá)及其水平隨著晶狀體混濁程度的增加呈下降趨勢(shì)[14]。糖尿病患者更容易發(fā)生白內(nèi)障，具體機(jī)制尚不確切，既往研究結(jié)果顯示糖尿病患者房水中存在VEGF與PEDF的失衡，糖尿病白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中PEDF、VEGF的表達(dá)水平是否存在同樣的變化，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示與年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者相比，2型糖尿病合并白內(nèi)障患者LECs中的VEGF的表達(dá)水平升高，相反PEDF的表達(dá)水平明顯降低，與以往研究的糖尿病患者視網(wǎng)膜組織、房水中的變化趨勢(shì)一致[8-10]，因此我們推測(cè)2型糖尿病合并白內(nèi)障患者LECs中也同樣存在PEDF、VEGF表達(dá)的失衡，并且比年齡相關(guān)性白內(nèi)障的平衡失調(diào)更明顯，這種平衡的明顯失調(diào)可能導(dǎo)致了糖尿病患者更早發(fā)生白內(nèi)障、并且進(jìn)展更快。干預(yù)眼內(nèi)PEDF、VEGF水平可能為預(yù)防和減緩糖尿病患者發(fā)生白內(nèi)障提供新的途徑，也為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供更長(zhǎng)的時(shí)間窗。