采用高效液相色譜儀串聯(lián)示差折光檢測器分析原料糖漿中低聚麥芽糖組分方法的探討

徐煜琪

上海工微所科技有限公司，上海 200233

麥芽糖(maltose)是由兩個葡萄糖經(jīng)α-1,4糖苷鍵連接而成的二糖，又稱為麥芽二糖。因C1羥基位置不同，而分為α-和β-兩種異構(gòu)體[1]。

低聚麥芽糖一般是以淀粉為原料，經(jīng)酶法生產(chǎn)含3～8個葡萄糖分子的碳水化合物，能經(jīng)小腸逐步消化吸收。低聚麥芽糖的滲透壓為葡萄糖的1/4，其甜度為蔗糖的40%，生理特點(diǎn)是被吸收利用的速度比單糖和雙糖慢，一次攝入后可以維持較長時間的能量補(bǔ)充；同時，維持胰島素和血糖之間的相對平衡[2]。

奶糖糖果，是以食糖或糖漿或甜味劑、乳制品等為主要原料，制成具有乳香味的糖果[3]。在奶糖糖果中，膠質(zhì)型奶糖糖果多數(shù)以低聚麥芽糖漿為底料。而其中，麥芽四糖(maltotetraose)與麥芽五糖(maltopentaose)對膠質(zhì)型奶糖糖果口感的影響尤其顯著，隨著麥芽五糖的的比例升高，膠質(zhì)型奶糖糖果會更硬，反之亦然[3]。同時，麥芽四糖和麥芽五糖的價(jià)格也相對較高。因此在原料麥芽糖漿中，麥芽四糖與麥芽五糖在糖漿中的占比就顯得尤其重要?？焖?、有效的檢測原料糖漿中麥芽四糖與麥芽五糖就有著重要的意義。

現(xiàn)在，低聚麥芽糖的液相分析方法，常用的色譜柱有鈣柱、糖柱、氨基柱等類型。最常用的為離子交換型色譜柱，配合使用檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器(EvaporativeLight-scattering Detector，ELSD)，或脈沖安培檢測器(Pulsed Amperometric Detector，PAD)[4-5]，也有報(bào)道使用高效液相色譜串聯(lián)電噴霧檢測器(HPLC-CAD)來檢測糖類物質(zhì)[6]。但由于鈣柱、糖柱等價(jià)格高，分析參數(shù)單一；蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)和脈沖安培檢測器(PAD)的購置成本、維護(hù)成本和維護(hù)要求都很高，而且檢測器通用性差。對于日常的低聚麥芽糖漿驗(yàn)收而言，成本過高，實(shí)際應(yīng)用性較差。

示差折光檢測器(Refractive Index Detector，RID)是根據(jù)不同物質(zhì)具有不同的折射率來進(jìn)行組分監(jiān)測。凡是具有與流動相折射率不同的組分，均可以使用這種檢測器[7-8]。示差折光檢測器(RID)分為反射式和折射式兩種。作為通用型檢測器，示差折光檢測器(RID)能分析無紫外吸收的物質(zhì)，尤其是糖類，使用方便，設(shè)置簡單，大多食品檢測實(shí)驗(yàn)室都有配備。

參考GB 5009.8—2016 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定[9]，GB/T 20881—2007 低聚異麥芽糖[10]，GB/T 20883—2017 麥芽糖中，提及對葡萄糖，麥芽糖，低聚麥芽糖的測定方法[11]，如使用常規(guī)的外標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算，需購置單一的純度較高的低聚麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)品，成本較高。因此本文使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)根據(jù)保留時間進(jìn)行初步定位，然后采用面積歸一法，計(jì)算低聚麥芽糖各組分含量。可降低成本，同時也具有一定的參考價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品及試劑

葡萄糖純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度99.0%)，D-麥芽糖(純度94.9%)，麥芽三糖(96.0%)，麥芽四糖(99.0%)(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。乙腈購買于上海迪馬科技有限公司。實(shí)驗(yàn)使用水都為一級水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

METTLER TOLEDO 電子天平MS204S/02，METTLER TOLEDO 電子天平XS205 DualRange，IKA VORTEX GENIUS 3渦旋振蕩器，Agilent LC1260液相色譜儀(Agilent 1260 Quat Pump VL G1311C四元泵，Agilent 1260ALS G1329B自動進(jìn)樣器，Agilent 1260TCC G1316A柱溫箱，Agilent 1260RID G1362A示差折光檢測器)，Waters XBridge? BEH Amide 5 μm×4.6 mm×250 mm Column色譜柱+Waters XBridge? BEH Amide 5 μm VanGuard? Cartridge 3.9 mm×5 mm保護(hù)柱。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品于100 mL容量瓶中，加30 mL一級水溶解樣品，渦旋1 min后，用水定容至刻度，混勻后，過0.45 μm水相微孔膜后，供儀器檢測。

分別準(zhǔn)確稱取葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖標(biāo)準(zhǔn)品0.010 g，用一級水溶解后，定容至10 mL，各取4種標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL，用一級水定容至10 mL后，過0.45 μm水相微孔膜后，供儀器檢測。

1.4 液相條件

采用乙腈-水在不同的配比下，配合不同的柱溫條件，考察各組分的分離度。

采用乙腈-水比例為50∶50、55∶45、60∶40。流速設(shè)置為1.0 mL/min，柱溫箱溫度設(shè)定為：30 ℃、35 ℃、40 ℃。檢測器溫度設(shè)定為40 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同流動相比例的比較

在柱溫箱設(shè)置溫度為30 ℃時，采用不同的乙腈與水的混合比，對低聚麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品混合樣品進(jìn)行高效液相色譜分析，得到相應(yīng)圖譜。

采用乙腈∶水=50∶50，如圖1所示，各組分不能分離。

圖1 乙腈∶水=50∶50葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖標(biāo)樣色譜圖

采用乙腈∶水=60∶40，如圖2所示，各組分可以完全分離，但是隨著聚合度提高，色譜峰有前沿，而且所需檢測的糖漿中，有聚合度>5以上的低聚麥芽糖，單個樣品所需檢測時間較長。

圖2 乙腈∶水=60∶40葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖標(biāo)樣色譜圖

采用乙腈∶水=55∶45，如圖3所示，出峰順序依次為：葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖。各色譜峰峰型較好，保留時間合適，且考慮所需檢測的糖漿中聚合度 >5以上的的低聚麥芽糖出峰時間推斷，一般檢測單一樣品的時間不超過20 min。因此，采用乙腈∶水=55∶45最為合適。

圖3 乙腈∶水=55∶45葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖標(biāo)樣色譜圖

2.2 不同柱溫箱溫度的比較

查詢色譜柱說明書顯示，該色譜柱一般耐受溫度為50 ℃以下，因此在乙腈∶水=55∶45條件下，柱溫箱設(shè)置30 ℃，35 ℃，40 ℃下，觀察個組分分離情況，如圖4、圖5、圖6所示，各組分分離度基本相似，但隨著柱溫升高，色譜柱的使用壽命會有所下降，因此將柱溫箱溫度設(shè)為30 ℃。

圖4 柱溫箱設(shè)置為30 ℃下色譜圖

圖5 柱溫箱設(shè)置為35 ℃下色譜圖

圖6 柱溫箱設(shè)置為40 ℃下色譜圖

2.3 不同色譜柱的對比

Waters XBridge? BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column色譜柱(下文以BEH色譜柱表示)，液相條件：流動相乙腈-水=55∶45，流速1.0 mL/min，柱溫箱設(shè)置為30 ℃，示差折光檢測器(RID)設(shè)置為40 ℃。HPLC Carbohydrate Analysis Column Aminex HPX-42A Carbohydtate Column 300 mm×7.8 mm色譜柱(下文以HPX-42A色譜柱表示)，液相條件：流動相為水，流速0.5 mL/min，柱溫箱設(shè)置為85 ℃，示差折光檢測器(RID)設(shè)置為50 ℃。鈣柱，液相液相條件：流動相為水，流速0.5 mL/min，柱溫箱設(shè)置為90 ℃，示差折光檢測器(RID)設(shè)置為35 ℃。其中，HPX-42A色譜柱、鈣柱的的液相條件由糖漿供應(yīng)方提供。在進(jìn)行樣品檢測時，為降低成本，本文并未購買麥芽五糖及以上的標(biāo)準(zhǔn)品，而是默認(rèn)其按照保留時間依次出峰，采用面積歸一化法進(jìn)行定量計(jì)算，分析結(jié)果見表1。

表1 不同色譜柱對同一樣品分析結(jié)果

如圖7所示，使用BEH色譜柱時，糖漿原料中，各多聚麥芽糖分離完全，無峰重疊，但在聚合度>8以上時，色譜峰扁平，峰型相對較差，但在實(shí)際應(yīng)用中，考慮到更多關(guān)注的是麥芽三糖，麥芽四糖的含量，最后高聚合度麥芽糖含量較低，影響較小。

圖7 Waters XBridge? BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column色譜柱

如圖8所示，使用HPX-42A時，麥芽十糖及以下組分基本分離，但仍有重疊，尤其是麥芽六糖及以上多聚麥芽糖，重疊較為嚴(yán)重，而且色譜峰都有前沿現(xiàn)象。

圖8 HPLC Carbohydrate Analysis Column Aminex HPX-42A Carbohydtate Column 300 mm Column色譜圖

以上兩種色譜柱雖然出峰順序不同，但檢測結(jié)果大致上相差不大的，可以通過比對簡單地進(jìn)行糖漿的驗(yàn)收，不至于完全受制于供應(yīng)商的檢測結(jié)果。

如圖9所示，使用鈣柱時，麥芽五糖及以上未能完全分離，而且與進(jìn)樣峰重疊在一起，并且麥芽四糖、麥芽五糖分離不完全，數(shù)據(jù)偏差較大，可供參考意義不大。

圖9 鈣柱色圖譜

3 結(jié)論

使用高效液相色譜儀串聯(lián)示差折光檢測器(HPLC-RID)，采用Waters XBridge? BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column色譜柱，流動相為乙腈∶水=55∶45，柱溫箱溫度設(shè)置為30 ℃，示差折光檢測器(RID)溫度設(shè)置為40 ℃，使用定性分析和面積歸一化法相結(jié)合的方法，能基本計(jì)算出麥芽糖漿各個組分含量。糖果企業(yè)可參考該方法對原料糖漿進(jìn)行驗(yàn)收，對糖漿的組分含量做到心中有數(shù)，從而在采購時掌握主動權(quán)。