微生物發(fā)酵酉素方對(duì)脾虛證小鼠的影響※

官清華 黃君陽(yáng) 陳炳焜 連蓮香 蔡韶芳 饒線明▲

功能性消化不良（functional dyspepsia,FD）約占我國(guó)脾胃病門診量的50%[1]，西醫(yī)治療以抑酸、促進(jìn)胃動(dòng)力、抗焦慮抑郁等為主[2]，但療效不甚理想，而中醫(yī)從“脾虛”辨證治療FD 具有確切作用[3]。相關(guān)研究表明，現(xiàn)代微生物發(fā)酵中藥具有提高中藥活性成分利用率、增強(qiáng)中藥藥效、降低中藥不良反應(yīng)、節(jié)省藥材資源、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[4]，同時(shí)也能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控和開展規(guī)模生產(chǎn)，故筆者將多年臨床實(shí)踐用于FD 治療的酉素方，通過(guò)新型微生物發(fā)酵配制，對(duì)脾虛證小鼠胃腸功能與免疫功能進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)ICR 小鼠80 只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由閩侯縣上街行難實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作室提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。分籠飼養(yǎng)于室溫20～26 ℃的環(huán)境，經(jīng)3 d過(guò)渡喂養(yǎng)。

1.2 發(fā)酵方法發(fā)酵酉素方（黨參10 g，茯苓15 g，淮山30 g，炒白術(shù)10 g，谷芽6 g，黃芪10 g，薏苡仁30 g，芡實(shí)30 g，扁豆30 g，馬蹄金30 g，菜豆殼30 g，陳皮10 g，木香10 g，炙甘草3 g）按藥材總質(zhì)量與清水1∶5的比例，用夾層罐通蒸汽加熱，待溫度達(dá)95 ℃開始計(jì)時(shí)，保持微沸1 h，期間控制溫度在95 ℃以上，煎煮60 min，過(guò)濾藥液，并進(jìn)行酶解和滅酶滅菌處理，按10%接種量接種活化種子液（含5%植物乳桿菌活化種子液、5%嗜酸乳桿菌活化種子液），于40 ℃條件下發(fā)酵3 d，再將中藥發(fā)酵液置于15～20 ℃條件下后發(fā)酵2 d，離心過(guò)濾和超濾處理，并進(jìn)行低溫真空濃縮處理。

1.3 主要試劑與儀器活性炭粉；阿拉伯樹膠；小鼠胃動(dòng)素檢測(cè)試劑盒；酶標(biāo)定測(cè)量?jī)x（ThermoFisher）；高速離心機(jī)；灌胃針。

1.4 動(dòng)物分組、造模及給藥將80 只ICR 小鼠按體重和性別隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、模型組、發(fā)酵酉素方低劑量組和發(fā)酵酉素方高劑量組?？瞻讓?duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水。其余各組采用飲食不節(jié)加勞倦過(guò)度的復(fù)合造模法制備脾虛小鼠模型，即第1 d至第12 d，單日禁食不禁水，不限量喂食甘藍(lán)，游泳至耐力極限（即指小鼠口鼻部首次浸入水中）；雙日根據(jù)小鼠體重按0.02 mL/g喂食豬油。模型小鼠出現(xiàn)便溏（嚴(yán)重者脫肛）、皮毛枯槁、拱背納呆、體重減輕、瞇眼等癥狀即表示造模成功。

造模成功后，從第13 d開始，空白對(duì)照組和模型組予蒸餾水灌胃。發(fā)酵酉素方低劑量組給予低濃度酉素方溶液（濃度22.32 g/kg，為成人單位公斤體重的1倍量），發(fā)酵酉素方高劑量組給予高濃度酉素方溶液（濃度59.81 g/kg，為成人單位公斤體重的2.68倍量），每日早晚各灌胃給藥1 次，連續(xù)給藥7 d。灌胃量按小鼠體重0.3 mL/10 g給藥。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 小鼠一般情況 記錄小鼠體重、體征變化，包括毛色、有無(wú)拱背、運(yùn)動(dòng)狀況、飲食狀況、大便性狀、有無(wú)瞇眼、有無(wú)脫肛等。

1.5.2 消化道排空速率的測(cè)定 第7 d 灌服給藥后20:00 起禁食不禁水12 h，第8 d 早上8:00 每只小鼠根據(jù)體重按0.02 mL/g 灌服5%活性炭阿拉伯膠混懸液，30 min 后迅速脫臼處死，剖開腹腔，取出小腸（自幽門至回盲部）。將小腸管不加牽引地平鋪在玻璃板上，以幽門為起點(diǎn)，測(cè)量炭末在腸管內(nèi)的移動(dòng)距離（cm）和小腸全長(zhǎng)（cm），計(jì)算每只小鼠活性炭的移動(dòng)距離占小腸全長(zhǎng)的百分比（%），其值越大則消化道排空速率越快。

1.5.3 胸腺和脾臟臟器指數(shù)的測(cè)定 小鼠脫臼處死后，解剖取胸腺和脾臟，分別稱取胸腺和脾臟重量（mg），計(jì)算臟器與體質(zhì)量（g）之比，即為胸腺和脾臟指數(shù)（mg/g）。其值越大提示免疫功能強(qiáng)。

1.5.4 胃腸激素的測(cè)定 連續(xù)給藥7 d 后摘取小鼠眼眶，取血采集血清，按試劑盒方法測(cè)定和計(jì)算小鼠血清胃動(dòng)素（MTL）濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在滿足參數(shù)檢驗(yàn)的前提下，運(yùn)用方差分析檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較以復(fù)合造模法喂養(yǎng)12 d 后，模型組、發(fā)酵酉素方低劑量組和高劑量組小鼠多出現(xiàn)毛發(fā)稀松無(wú)光澤、體形消瘦、腹部?jī)蓚?cè)凹陷、背微弓、大便稀溏、神情萎靡、瞇眼等癥狀或體征，體重顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），提示脾虛證小鼠造模成功。治療后，與模型組比較，發(fā)酵酉素方高、低劑量組小鼠的毛發(fā)較順亮、食量較大、行為較活躍，體重增加（P＜0.01），而高劑量組與低劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體重比較（g，）

表1 各組小鼠體重比較（g，）

注：與空白對(duì)照組比較，AP＜0.01，aP＜0.05；與模型組比較，BP＜0.01，bP＜0.05

2.2 各組小鼠消化道排空速率、MLT水平比較與空白對(duì)照組比較，模型組的消化道排空速率、MLT 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，發(fā)酵酉素方高劑量組小鼠的消化道排空速率、MLT 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠消化道排空定量指標(biāo)觀測(cè)結(jié)果（）

表2 各組小鼠消化道排空定量指標(biāo)觀測(cè)結(jié)果（）

注：與空白對(duì)照組比較，AP＜0.01，aP＜0.05；與模型組比較，BP＜0.01，bP＜0.05

2.3 各組小鼠胸腺和脾臟臟器指數(shù)比較與空白對(duì)照組比較，發(fā)酵酉素方高劑量組的胸腺指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，發(fā)酵酉素方高劑量組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠臟器指數(shù)定量指標(biāo)的觀測(cè)結(jié)果（）

表3 各組小鼠臟器指數(shù)定量指標(biāo)的觀測(cè)結(jié)果（）

注：與空白對(duì)照組比較，AP＜0.01，aP＜0.05；與模型組比較，BP＜0.01，bP＜0.05

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為FD 的發(fā)病因素及機(jī)制呈多元化，與胃腸功能障礙、心理精神因素、胃腸激素改變、幽門螺桿菌感染、炎癥、內(nèi)臟高敏感性、特定基因型改變與遺傳易感性、早期生活應(yīng)激等有關(guān)。西醫(yī)主要采取對(duì)癥治療，病情易反復(fù)，療效滿意度較差。中醫(yī)認(rèn)為FD主要是以脾胃虛弱為本，氣機(jī)阻滯為標(biāo)，因此尤其注重健脾補(bǔ)虛來(lái)治療消化系統(tǒng)疾病。以飲食不節(jié)加勞倦過(guò)度的復(fù)合造模法制備的脾虛動(dòng)物模型，無(wú)其他藥物干擾且更符合臨床特點(diǎn)，可用于相關(guān)中藥的藥理學(xué)研究。

酉素方系第三批全國(guó)名老中醫(yī)陳炳焜及饒線明師徒二人臨床多年用于治療FD 的有效實(shí)踐方，全方按照中醫(yī)健脾益氣，藥食同源的思路組合，以四君子湯為基礎(chǔ)，佐藥食同源之品，結(jié)合當(dāng)?shù)夭菟幒现贫?。四君子湯出自《太平惠民和劑局方》，由黨參、茯苓、白術(shù)和甘草四味中藥組成。方中君藥黨參具有補(bǔ)氣健脾養(yǎng)胃的功效；臣藥白術(shù)味甘、苦，性溫，可補(bǔ)氣健脾、燥濕利水；佐藥茯苓味甘、淡，性平，可利水滲濕、健脾化痰；使藥甘草味甘，性平，可益氣滋養(yǎng)、通陽(yáng)復(fù)脈。諸藥共用以益氣健脾，為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)補(bǔ)益脾胃之名方[5]。Meta 分析[6]結(jié)果顯示，四君子湯加味治療FD 在總有效率方面優(yōu)于常規(guī)西藥組。酉素方中有淮山、芡實(shí)、扁豆、薏苡仁等藥食同源補(bǔ)脾之品，通過(guò)影響消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等相關(guān)功能以達(dá)到健脾的作用[7]，方中地方草藥馬蹄金[8]、菜豆殼[9]常被用于理氣消脹，能有效緩解FD癥狀。

但是，由于FD 患者眾多，傳統(tǒng)中藥煎煮費(fèi)時(shí)耗力，無(wú)法統(tǒng)一質(zhì)控和規(guī)模生產(chǎn)，因此需要結(jié)合現(xiàn)代工藝進(jìn)行藥劑轉(zhuǎn)化，以期滿足眾多患者便捷服用的需求。目前，現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)既可滿足標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控、規(guī)模生產(chǎn)、方便攜帶的現(xiàn)實(shí)需要，又可以有效提取中藥活性成分，提高中藥利用率，減低中草藥毒性[4]。陳旸等[10,11]利用植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌對(duì)人參進(jìn)行發(fā)酵，將有效成分人參總苷轉(zhuǎn)化為小分子單體人參皂苷Rd 和稀有人參皂苷Rg，有效提高人參有效成分活性與功能性。王身艷[12]采用藥用真菌使草烏發(fā)酵，降低了草烏中劇毒成分烏頭堿、中烏頭堿與次烏頭堿的含量，而增加了毒性較小的苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰中烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿的含量。故本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)，以新型微生物發(fā)酵制備酉素方藥液，對(duì)脾虛證小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)中采用飲食不節(jié)加勞倦過(guò)度的復(fù)合造模法制備脾虛證小鼠模型，結(jié)果顯示脾虛證小鼠造模成功。通過(guò)對(duì)成功造模的脾虛證小鼠給予發(fā)酵酉素方進(jìn)行治療發(fā)現(xiàn)，高劑量酉素方對(duì)于脾虛模型小鼠的體重變化、消化道排空速率、胃動(dòng)素濃度以及臟器指數(shù)都有較顯著的改善，進(jìn)一步證實(shí)新型微生物發(fā)酵酉素方對(duì)脾虛小鼠的胃腸功能和免疫功能有較好的調(diào)節(jié)作用。因此本研究提示，新型微生物發(fā)酵酉素方可通過(guò)調(diào)節(jié)胃腸功能和免疫功能而用于治療FD。本研究的不足之處在于未開展陽(yáng)性藥物組與酉素方（不發(fā)酵）組對(duì)脾虛小鼠影響的比較實(shí)驗(yàn)，將在今后研究中進(jìn)一步予以探討和證實(shí)。

綜上，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了新型微生物發(fā)酵酉素方有助于調(diào)節(jié)胃腸功能和免疫功能，后期可進(jìn)一步探討高劑量酉素方的微生物發(fā)酵法與傳統(tǒng)煎煮法的優(yōu)劣及其作用機(jī)制的差異，為廣大FD 患者提供簡(jiǎn)便效廉的健康服務(wù)新途徑。