尿液外泌體來源hsa_circ_0008925與IgA腎病腎臟纖維化的相關(guān)性研究

史媛慧，吳章麗，彭娜娜，肖 杰，徐晶晶，竇 璠，曹玉涵

(1.皖南醫(yī)學院 a.研究生學院；b.麻醉學院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腎臟內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

IgA腎病(immunoglobulin A nephropathy，IgAN)是全球范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，約占中國人群原發(fā)性腎小球疾病的45%[1]。約20%～40%IgAN患者會出現(xiàn)腎功能減退，并在20～30年內(nèi)發(fā)展為終末期腎臟病[2]。腎臟纖維化幾乎是所有慢性腎臟病進展至終末期腎病的主要病理改變。目前，腎臟纖維化的診斷主要基于腎穿刺活檢病理[3]。然而，腎穿刺活檢是一種創(chuàng)傷性操作，可能出現(xiàn)出血、感染等嚴重并發(fā)癥，更無法實時、動態(tài)了解腎臟纖維化進程。研究證實尿液外泌體攜帶著腎臟固有細胞來源的生物學信息，如蛋白質(zhì)、核酸等多種信號分子[4]。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)在外泌體中富集且穩(wěn)定，尿液中circRNAs可能作為腎臟纖維化的潛在生物標志物[5]。

本研究通過檢測IgAN患者尿液外泌體hsa_circ_0008925表達量與健康對照的表達差異，并進一步分析尿液外泌體hsa_circ_0008925與腎臟纖維化的相關(guān)性，探討尿液外泌體hsa_circ_0008925表達量對IgAN腎臟纖維化的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018～2019年于弋磯山醫(yī)院腎內(nèi)科腎穿刺活檢確診的IgAN患者30例和34例健康對照者。排除標準：①年齡<18歲或年齡>80歲；②合并繼發(fā)性腎臟疾病，如狼瘡性腎炎、乙肝相關(guān)性腎炎等；③泌尿系統(tǒng)急、慢性感染；④存在嚴重的心血管疾病、惡性腫瘤、肝功能異常等；⑤臨床病例資料不全的患者。本研究經(jīng)弋磯山醫(yī)院倫理委員會批準，所有入選患者均簽署知情同意書。

1.2 尿標本收集及其外泌體提取 腎穿刺活檢前一天收集晨尿約100 mL。晨尿樣本經(jīng)4℃、3 000 g離心30 min后，收集上清液，經(jīng)4℃、13 500 g離心30 min，再次收集上清液，經(jīng)4℃、100 000 g超速離心70 min，棄上清，收集沉淀即為尿液外泌體，重懸于100 μL PBS緩沖液。

1.3 尿液外泌體RNA提取 使用Trizol-LS試劑(Ambion)，按照生產(chǎn)商提供的使用說明書提取尿液外泌體總RNA。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit，TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real Time PCR試劑盒(TB Green Premix Ex Taq，TaKaRa)進行cDNA擴增，檢測hsa_circ_0008925的表達情況，U6作為內(nèi)參。設(shè)計引物如下，hsa_circ_0008925正向引物：5′-TTATGGCTGTCCTTGGGAGTTT-3′；反向引物：5′-GGTATTCTCGGTCTGTTTTGGA-3′。U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。RT-qPCR反應(yīng)程序：反轉(zhuǎn)錄(37℃，15 min；85℃，5 s)，熱啟動(95℃，10 min)，40個PCR循環(huán)(95℃，10 s；60℃，1 min)。

1.5 腎臟纖維化檢測 腎穿刺活檢樣本固定于10%中性福爾馬林24 h，常規(guī)脫水、包埋、切片(厚度3 μm)、脫蠟、染色、脫水、封片、鏡檢。Masson染色評估腎小管間質(zhì)纖維化。纖維化分級：①0級，無纖維化；②1級，輕度纖維化，纖維化面積0～25%；③2級，中度纖維化，纖維化面積26%～50%；④3級，重度纖維化，纖維化面積>50%。

2 結(jié)果

2.1 IgAN患者與健康對照者的基線臨床和病理資料分析 IgAN組和對照組在年齡、性別和收縮壓上差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，IgAN組中舒張壓、血肌酐、血尿素氮、胱抑素C均高于對照組(P<0.001)，而腎小球濾過率(eGFR)低于對照組(P<0.001)。與對照組相比，尿液外泌體hsa_circ_0008925相對表達量在IgAN組中上調(diào)(P<0.001)，詳見表1。

2.2 不同纖維化程度IgAN患者基線臨床和病理資料分析 根據(jù)腎臟纖維化程度將IgAN患者分為2組：無-輕度纖維化組(纖維化面積≤25%)(n=8)；中-重度纖維化組(纖維化面積>25%)(n=22)。兩組間年齡、性別、收縮壓、舒張壓、血肌酐、血尿素氮、胱抑素C、eGFR、24 h尿蛋白差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與無-輕度纖維化組相比，尿液外泌體hsa_circ_0008925相對表達量在中-重度纖維化IgAN組上調(diào),詳見2。

2.3 尿液外泌體hsa_circ_0008925表達量與臨床病理指標相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析提示，尿液外泌體hsa_circ_0008925表達水平與血肌酐(rs=0.376，P=0.002)、胱抑素C(rs=0.491，P<0.001)均呈正相關(guān)；與eGFR(rs=-0.334，P=0.007)呈負相關(guān)。其他詳見表3。

表1 IgAN患者與健康者的基線臨床和病理資料對比

表2 不同纖維化程度IgAN患者基線臨床和病理資料對比

表3 尿液外泌體hsa_circ_0008925與血肌酐、血尿素氮、胱抑素C、eGFR、24 h尿蛋白相關(guān)性分析

2.4 尿液外泌體hsa_circ_0008925對IgAN腎臟纖維化的診斷價值 ROC曲線分析提示尿液外泌體hsa_circ_0008925可以區(qū)分中-重度纖維化和無-輕度纖維化的IgAN患者(AUC=0.778，95%CI：0.610～0.947，P=0.022)，當尿液外泌體hsa_circ_0008925相對表達量為0.089時可區(qū)分無-輕度纖維化和中-重度纖維化的IgAN患者，靈敏度為72.7%，特異度為87.5%(圖1)。而eGFR(AUC=0.372，95%CI：0.174～0.570，P=0.291)、血肌酐(AUC=0.588，95%CI：0.380～0.797，P=0.467)、胱抑素C(AUC=0.685，95%CI：0.492～0.877，P=0.127)對中-重度纖維化和無-輕度纖維化的IgAN患者無診斷價值。

圖1 ROC曲線分析尿液外泌體hsa_circ_000892、eGFR、血肌酐及胱抑素C對不同纖維化程度IgAN患者的診斷價值

3 討論

早期、無創(chuàng)性診斷腎臟纖維化，是臨床上亟待解決的科學問題。迄今尚無可靠的可診斷腎臟纖維化的無創(chuàng)性生物標志物[6]。尿液中蘊含豐富的生物學信息，尿液中有來自腎臟的脫落細胞。尿液離心后獲得的尿沉渣細胞可作為反映腎臟病理生理改變的信息來源[7]。近年來，以實時定量聚合酶鏈式擴增反應(yīng)(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)為基礎(chǔ)的尿液非編碼RNA生物標志物檢測成為研究熱點。Li等[8]首次用RT-PCR方法檢測尿沉渣細胞中穿孔素及顆粒酶B的mRNA，可作為診斷異體腎移植急性排斥反應(yīng)的生物標志物。外泌體是細胞來源的納米級囊泡，可將攜帶的非編碼RNA傳遞至細胞外，作為細胞間信息交換的重要工具。Feng等[9]發(fā)現(xiàn)尿液外泌體攜帶的CCL2 mRNA可作為評估IgAN患者腎臟損害的潛在生物標志物。

circRNAs是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，不受RNA外切酶影響，能夠在細胞及體液內(nèi)穩(wěn)定存在，不易降解。最新研究表明，circRNAs在外泌體中富集且穩(wěn)定，可以在尿液中檢測到[10]。Luan等[11]在IgAN患者的尿液外泌體中發(fā)現(xiàn)了差異表達的circRNAs，提示外泌體中circRNAs在IgAN的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為IgAN分子病因?qū)W和非侵入性生物標志物。Luan等[12]通過對比IgAN患者和健康對照者circRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)在IgAN患者中發(fā)現(xiàn)了476個表達差異circRNAs，但并未進一步分析具有差異性的circRNAs是否可作為診斷IgAN的非侵入性生物標志物。

本研究基于RT-PCR檢測方法來尋找IgAN患者尿液腎臟纖維化的生物標志物，發(fā)現(xiàn)IgAN患者尿液外泌體hsa_circ_0008925表達水平顯著高于健康對照組。進一步比較IgAN患者不同纖維化程度尿液外泌體hsa_circ_0008925表達量，發(fā)現(xiàn)尿液外泌體hsa_circ_0008925表達水平與腎臟纖維化嚴重程度呈正相關(guān)。此外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)尿液外泌體hsa_circ_0008925表達水平與血肌酐、胱抑素C呈正相關(guān)，與eGFR呈負相關(guān)。ROC曲線提示尿液外泌體hsa_circ_0008925表達量可區(qū)分不同纖維化程度的IgAN患者，且AUC優(yōu)于eGFR、血肌酐以及胱抑素C等傳統(tǒng)臨床生化指標。hsa_circ_0008925的染色體定位位于chr6:108222573-108246136，其基因名稱為SEC63。SEC63編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中一種常駐蛋白，SEC63失活后導(dǎo)致多囊蛋白1介導(dǎo)的多囊腎病的發(fā)生[13]。既往有研究報道，腎小管內(nèi)SEC63失活后導(dǎo)致蛋白穩(wěn)態(tài)失調(diào)，激活I(lǐng)re1-α/Xbp1通路，從而促進炎癥反應(yīng)、肌成纖維細胞增多和細胞外膠原沉積，進而發(fā)展為腎間質(zhì)纖維化[14]。

本研究通過對尿液外泌體中circRNAs檢測，初步發(fā)現(xiàn)尿液外泌體hsa_circ_0008925可作為診斷IgAN患者腎臟纖維化的可靠、無創(chuàng)性生物標志物。本研究的局限性在于樣本量小，需擴大樣本量進一步驗證，并且hsa_circ_0008925在IgAN和腎臟纖維化中的分子生物學機制需進一步研究。綜上所述，尿液外泌體來源的hsa_circ_0008925可能成為診斷IgAN腎臟纖維化的無創(chuàng)性生物標志物，為IgAN腎臟纖維化的診療提供新的思路。