植物α-半乳糖苷酶的進化及功能研究進展

李秀梅，陳中健，晏石娟，李文燕

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，α-Gal；EC 3.2.1.22）廣泛存在于動物、植物及微生物（古細菌、細菌和真菌）中，是一類專一性催化α-半乳糖苷鍵水解的外切糖苷酶，屬于糖苷水解酶家族；該酶能專一性識別底物末端α-連接的非還原性D-半乳糖殘基并催化其水解，大部分α-Gal主要催化半乳低聚糖、半乳甘露聚糖、半乳糖脂及糖蛋白中α-1,6-半乳糖苷鍵的水解，少數(shù)α-Gal專一性的催化α-1,3-或α-1.4-半乳糖苷鍵的水解［1-2］。除水解酶活性外，一些α-Gal 還具有半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性［3］。不同來源的α-Gal 已廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化工、農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域［4-6］。例如，在食品及飼料工業(yè)領(lǐng)域，α-Gal 被廣泛用于消除豆制品、飼用豆粕及其他餅粕中致使人和動物胃腸脹氣的含有α-1,6-半乳糖苷的產(chǎn)氣因子——棉子糖家族寡糖，進而促進人體對豆制品的消化和吸收，消除棉子糖家族寡糖的抗營養(yǎng)性，提高畜禽對豆粕等飼料的利用率［5,7］。在化工領(lǐng)域，利用α-Gal 與β-甘露聚糖酶協(xié)同對富含半乳甘露聚糖類植物（如瓜兒豆、槐豆等）多糖膠的水解與修飾作用，水解支鏈末端半乳糖基，改變半乳甘露聚糖性質(zhì)，顯著提高其凝膠特性［8］；在醫(yī)藥方面，利用α-Gal 糖基轉(zhuǎn)移酶的特性改造環(huán)糊精及其衍生物，增加其包埋藥物的穩(wěn)定性［9］；利用α-Gal 可專一性水解血紅細胞表面抗原α-1,3-半乳糖苷鍵的特性，可用于B→O 血型改造、克服異種器官移植超應(yīng)急排斥反應(yīng)等［10-11］。因此，α-Gal 被認為是最具應(yīng)用潛力的酶制劑之一。

微生物是α-Gal 的主要來源，國內(nèi)外關(guān)于α-Gal 的研究大多來自細菌、真菌等微生物，其研究重點還更多局限于酶學(xué)性質(zhì)應(yīng)用領(lǐng)域的探討，主要包括催化活性、最適pH 值、最適底物、最適溫度等［1,4,6,12］。盡管當(dāng)前利用基因工程等手段可以實現(xiàn)α-Gal 在大腸桿菌、酵母菌等異源生物中的高效表達，但是無論天然提取或異源表達的α-Gal 在催化活性、最適pH 值、熱穩(wěn)定性、表達效率等方面仍存在諸多問題，極大限制了其規(guī)模化產(chǎn)業(yè)應(yīng)用［6,12］。與微生物相比，植物來源的α-Gal 研究報道則相對較少，主要集中在豆類、葫蘆科、禾本科等少數(shù)物種的研究。盡管已有研究表明α-Gal 參與植物生長發(fā)育［13］、種子萌發(fā)［14］、糖的運輸與卸載［15-16］、逆境脅迫應(yīng)答［17-19］等重要生理過程，但其作用機制仍不清楚，這也極大限制了α-Gal 在作物遺傳改良中的應(yīng)用。鑒于α-Gal 的廣闊應(yīng)用前景和巨大市場經(jīng)濟價值，以產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用為最終目標的基礎(chǔ)研究已成為 α-Gal領(lǐng)域的研究熱點和新的發(fā)展趨勢［4,6,12］。因此，亟需開展不同物種來源的α-Gal 基因發(fā)掘、克隆與鑒定、酶催化機理以及功能作用的分子機制研究，進而通過分子設(shè)計手段改造具有高催化活性和熱穩(wěn)定性的α-Gal以滿足潛在的巨大市場需求，并為拓寬α-Gal 在食品工業(yè)、作物育種等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。本文主要就α-Gal 的來源與分類、催化特性、家族系統(tǒng)進化及其在植物中的生物學(xué)功能等方面的研究現(xiàn)狀、熱點及發(fā)展趨勢進行綜述。

1 α-Gal 的來源、種類與催化特性

1.1 α-Gal 的來源及分布

α-Gal 是一類能特異性識別非還原末端α-半乳糖殘基，并催化含有α-半乳糖苷的低聚糖（如蜜二糖、棉子糖、水蘇糖等）以及半乳甘露聚糖、半乳糖脂和糖蛋白水解的外切糖苷水解酶類［1-2］。α-Gal 廣泛存在于自然界的動物、植物和微生物中，從古細菌、細菌等低等原核生物，到被子植物、哺乳動物等高等真核生物中均有分布，尤其在細菌、真菌等微生物中分布最為廣泛、研究最為深入［1,4,6,12］。目前已報道α-Gal 的細菌來源有嗜熱芽孢桿菌、極端嗜熱杜氏桿菌等，真菌來源有里氏木霉、米曲霉等，植物來源有咖啡豆、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜等，動物來源有人等。

1.2 α-Gal 的種類

糖苷水解酶（Glycoside hydrolases，GH）是一類水解糖苷鍵（glycosidic bonds）的酶，在生物體糖和糖綴合物的水解與合成過程中扮演著重要角色。根據(jù)蛋白序列的相似性及催化特性的 不同［20-21］，CAZy（Carbohydrate Active Enzymes database，http://www.cazy.org/）將糖苷水解酶分為173 個GH 家族，即GH1～GH173。其中，具有α-Gal活性的GH 家族有GH4、GH27、GH31、GH36、GH57、GH97 和GH110 等7 個家族（表1）。從表1 可以看出，不同GH 家族的來源與分布存在不均衡性。在原核微生物中，7 個GH 家族在細菌中均有分布，而在古細菌中僅有GH36 和GH57兩個GH 家族分布；在真菌、動植物等真核生物中，僅有GH27 和GH36 兩個家族分布。目前已鑒定的α-Gal 大部分屬于GH27 和GH36 家族。根據(jù)酶的最適pH，可將α-Gal 分為酸性α-Gal（AGAL,最適pH 4.0～7.0）、堿性α-Gal（AGA,最適pH 7.0～9.0）和中性α-Gal（最適pH 7.0）。（古）細菌、真菌等微生物來源的α-Gal 大多呈酸性，如GH27、GH31、GH57、GH110；少部分呈中性，如GH4、GH97。而植物來源的α-Gal 大部分為酸性（如GH27）或堿性（如GH36），極少部分為中性。

表1 植物α-半乳糖苷酶的種類、來源及催化特性Table 1 Classification,sources and catalytic properties of plant α-galactosidase

1.3 α-Gal 的催化特性

α-Gal 的催化特性與蛋白氨基酸序列、功能結(jié)構(gòu)域及活性中心密切相關(guān)［20-21,33］，不同來源的GH 家族在蛋白功能結(jié)構(gòu)域及催化特性方面存在顯著差異。根據(jù)GH 催化作用機制的不同分為兩類：構(gòu)型保持酶（Retaining enzymes）和構(gòu)型翻轉(zhuǎn)酶（Inverting enzymes）［20-21,33］。GH4 家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域由 羅斯曼折疊（Rossmann fold）結(jié)構(gòu)基序（即3 個平行的β 折疊與兩對α 螺旋形成β-α-β-α-β 結(jié)構(gòu)）組成，其催化反應(yīng)依賴NAD+和Mn2+等二價金屬離子作為輔助因子，屬于構(gòu)型保持酶［22-23］。GH27、GH31 和GH36 同屬于GH-D 水解酶家族，其蛋白功能結(jié)構(gòu)域在進化上相對保守，核心功能結(jié)構(gòu)域均由(β/α)8桶狀拓撲結(jié)構(gòu)組成，催化中心具有保守的D-D-x-[WY]特征性序列，亦屬于構(gòu)型保持酶［25,27-28］。盡管GH27、GH31 和GH36 在功能結(jié)構(gòu)域上存在保守性，但在具體功能特性（如蛋白酶聚集狀態(tài)、最適pH、底物特異性等）方面仍存在明顯差異（表1）。例如，不同來源的GH27 水解酶呈現(xiàn)單體（如水稻α-Gal）、二聚體（如人源α-Gal）和四聚體（如釀酒酵母α-Gal）3 種聚合狀態(tài)，并在pH 4.0～7.0 時具有較高的催化活性，主要催化蜜二糖、棉子糖、水蘇糖等半乳低聚糖，半乳甘露聚糖、半乳糖脂等α-1,6-半乳糖苷鍵的水解［24-25］。GH31 通常形成二聚體，并在pH 4.6～5.2 時具有最高活性，可催化蜜二糖、棉子糖、水蘇糖等低聚糖的α-1,6-半乳糖苷鍵水解。GH36 則大多以四聚體形式存在，通常在pH 7.0～9.0 時呈現(xiàn)較高活性，可催化蜜二糖、棉子糖、水蘇糖等低聚糖，以及半乳甘露低聚糖末端的α-1,6-半乳糖苷鍵水解［27-28,34］。此外，除GH31 僅具有糖苷水解酶活性外，GH27 和GH36 兼具糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶活性，催化半乳糖基轉(zhuǎn)移形成半乳二糖、三糖和四糖，或者催化半乳低聚糖鏈延長形成四碳糖、五碳糖和六碳糖［35-36］。GH57 家族僅存在于少數(shù)（古）細菌中，熱穩(wěn)定性強，如從海棲熱袍菌Thermotoga neapolitana和激烈火球菌Pyrococcus furiosus分離獲得迄今為止最耐熱的的α-半乳糖苷酶，其最適溫度分別為100～103、115 ℃［29-30］；該家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域由(β/α)7桶狀拓撲結(jié)構(gòu)組成，亦屬于構(gòu)型保持酶，且在pH 5.0～5.5 時可水解蜜二糖和棉子糖，但不能水解半乳甘露低聚糖［29-30］。GH97 家族則屬于雙功能酶——構(gòu)型翻轉(zhuǎn)酶和構(gòu)型保持酶，兼具α-葡萄糖苷和α-半乳糖苷水解酶活性；其功能結(jié)構(gòu)域由(β/α)8桶狀拓撲結(jié)構(gòu)組成，可催化β-L-阿拉伯糖吡喃糖苷和α-D-半乳糖苷水解［31-32,37］。GH110 家族具有高度專一性的NAD+依賴的α-1,3-半乳糖苷水解酶活性，其功能結(jié)構(gòu)域由5～6 個平行β-螺旋（Parallel β-helix）組成，專一催化B 型血紅細胞特異抗原表面α-1,3-半乳糖殘基水解，可用于B→O 的血型改造［10-11］。

2 植物α-Gal 的進化分析

2.1 α-Gal 家族的進化關(guān)系

盡管CAZy 公共數(shù)據(jù)庫已對α-Gal 進行功能分類，針對各GH 家族的催化功能亦有相關(guān)研究報道（表1），但是目前有關(guān)α-Gal的7個家族（GH4、GH27、GH31、GH36、GH57、GH97 和GH110）之間的進化關(guān)系仍不清楚。利用生物信息學(xué)方法對公共數(shù)據(jù)庫已報道的7 個α-Gal 家族基因進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果（圖1）表明：α-Gal 由共同祖先演化而來，且α-Gal 在古細菌等低等原核生物中早已存在并保留至今，如GH57和GH36家族；細菌等原核生物來源的α-Gal種類顯著多于真菌、動植物等真核生物，如細菌具有全部的7 個α-Gal家族，而真菌等真核生物僅有GH27 和GH36 兩個GH 家族（表1、圖1）；α-Gal 蛋白催化功能結(jié)構(gòu)域在進化上相對保守，其核心結(jié)構(gòu)由保守的(β/α)n(n=7、8）桶裝結(jié)構(gòu)組成［25,27-28］，并在進化過程中分化出具有特定功能的結(jié)構(gòu)域，如GH4 家族羅斯曼折疊（Rossmann fold）［20-23］和GH110 家族平行β-螺旋（Parallel β-helix）結(jié)構(gòu)基序［10-11］（表1）。α-Gal 在進化過程中發(fā)生功能分化可能與特定功能或適應(yīng)特殊環(huán)境有關(guān)，如激烈火球菌Pyrococcus furiosus來源的α-Gal（GH57）具有極端耐熱性（最適溫度高達115 ℃，半衰期在100 ℃下長達15 h）相關(guān)［30］，而Bacteroides fragilis等來源的α-Gal（GH110）則專一性催化水解α-1,3-半乳糖苷鍵、非α-1,6-半乳糖苷鍵，其核心催化結(jié)構(gòu)域由6 個平行β-螺旋（Parallel β-helix）結(jié)構(gòu)組成（表1）［10-11］。

2.2 植物α-Gal 家族的進化分析

在植物基因組中，α-Gal 僅存在于GH27 和GH36 家族，分布范圍從低等藻類到高等被子植物，家族同源基因的數(shù)量因物種而異，表明α-Gal家族基因在植物進化過程中發(fā)生了基因擴增和基因丟失［38］。低等單細胞藻類植物大多僅含1 個α-Gal 編碼基因，而多細胞藻類及苔蘚等陸生植物含有多個α-Gal 編碼基因，如擬南芥中GH27和GH36 家族分別有4 個和5 個基因編碼α-Gal，而水稻中則分別有5 個和6 個基因編碼α-Gal［38］。Yan 等［38］對植物來源的GH27 家族進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，GH27 家族可分為3 個亞家族，其中亞家族I 存在于所有植物中，而亞家族I、IIII 則分別分布于綠色藻類植物和陸生植物。值得注意的是，亞家族I中筋骨草Ajuga reptans來源的α-Gal基因（圖1，AAR02007.1）編碼蛋白具有RFO 合成酶/半乳糖水解酶活性，不僅可以催化棉籽糖水解產(chǎn)生蔗糖和半乳糖，而且可以催化RFOs 的鏈伸長，產(chǎn)生水蘇糖、毛蕊花糖［3,39］。通過植物來源的GH36 家族系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，GH36 家族可分為多個亞家族，且各亞家族在進化過程中發(fā)生功能分化，演化出具有特定功能的RS/STS（Raffinose synthase/Stachyose synthase）亞家族。且RS/STS 亞家族編碼蛋白被證實也具有RFO 合成酶/半乳糖水解酶活性。例如，玉米ZmRS（圖1，Zm00001d039685）同時具有棉子糖合成和半乳糖醇水解活性［40］，而擬南芥AtRS4和AtSTS（圖1,AT4G01970）不僅具有水蘇糖合成活性，而且具有水蘇糖和半乳糖醇特異性水解活性［36］。與細菌等原核生物不同的是，植物來源的GH27 和GH36 家族在進化過程中發(fā)生功能分化可能與適應(yīng)陸生干旱環(huán)境有關(guān)［38］。

圖1 α-半乳糖苷酶家族系統(tǒng)進化關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationship of α-galactosidase family

3 植物α-Gal 的生物學(xué)功能

3.1 α-Gal 參與RFO 生物合成、卸載與及解代謝

在植物中，α-Gal 參與植物棉子糖系列寡糖（Raffinose family oligosaccharides,RFOs）的生物合成及代謝過程［38］。RFOs 是在α-半乳糖轉(zhuǎn)移酶作用下，將半乳糖基單元轉(zhuǎn)移至蔗糖或更高級的寡糖（如棉子糖、水蘇糖等）上合成的，最終可以得到聚合度高達15 碳糖的一系列低聚糖［41］。迄今為止，已經(jīng)確定了兩種RFOs 生物合成途徑。一種是肌醇半乳糖苷依賴途徑。該途徑第一個關(guān)鍵步驟是由肌醇半乳糖苷合酶（Galactinol synthase，GolS）催化UDP -半乳糖和L-肌醇合成肌醇半乳糖苷，然后在棉子糖合酶（Raffinose synthase，RS）催化下，將半乳糖苷的半乳糖單元添加到蔗糖中形成棉子糖；在部分植物中，棉子糖可在水蘇糖合酶（Stachyose synthase,STS）催化下，將半乳糖單元添加到棉子糖中合成水蘇糖、毛蕊花糖［42］。另一種是非肌醇半乳糖苷依賴途徑。該途徑的關(guān)鍵酶是半乳糖體：半乳糖體半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（Galactan: galactan galactosyltransferase,GGT），屬于酸性α-Gal 的GH27 家族［24,39］，該酶通過將RFO 分子末端的半乳糖基轉(zhuǎn)移到另一個RFO 分子上，從而催化RFO 的鏈延長。例如，當(dāng)與水蘇糖孵育時，GGT 能夠催化產(chǎn)生棉子糖和毛蕊花糖［24,39］。但值得注意的是，目前人們發(fā)現(xiàn)葉片中有GGT 酶活性，但尚未在種子中檢測到，這說明不依賴半乳糖苷的RFO 合成途徑可能存在于植物葉片中，而不存在于植物種子中。

植物中的RFO 分解代謝雖然與生物合成反應(yīng)一樣重要，但卻很少受到關(guān)注。而α-Gal 是催化α-半乳糖苷鍵水解的酶類，它能水解非還原末端以α-1,6 糖苷鍵結(jié)合的半乳糖苷化合物，半乳糖基被依次移動，可將RFOs 水解為蔗糖和D-半乳糖；此外，α-Gal 還能水解含有α-半乳糖苷鍵的雜多糖，如半乳甘露聚糖、半乳糖脂及糖蛋白［1-2］。RFO 水解所得的蔗糖和D-半乳糖既可作為能量來源，也可被重新利用形成RFOs。作為能量來源，蔗糖可以通過轉(zhuǎn)化酶降解為葡萄糖和果糖，也可以通過蔗糖合酶降解為UDP-葡萄糖和果糖［43］。隨后，葡萄糖、果糖和D-半乳糖可以輕易進入其他代謝途徑。半乳糖的累積能對α-Gal 起到反饋抑制作用，但游離的D-半乳糖可通過細胞溶質(zhì)中的半乳糖激酶（Galactokinase,GalK）迅速轉(zhuǎn)化為半乳糖-1-磷酸，并通過傳統(tǒng)的Leloir 途徑或焦磷酸酶依賴途徑進一步代謝［42-43］，通過降解RFO 釋放半乳糖并促進其轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸刍蚱渌a(chǎn)物。有趣的是，所有RFO 生物合成和分解代謝反應(yīng)都是可逆的。

此外，α-Gal 還參與部分植物RFO 在韌皮部的卸載［38］。植物葉片光合作用產(chǎn)生的碳水化合物只有不到80%被輸出到異養(yǎng)組織和器官用于生長發(fā)育［44-45］。蔗糖是大部分植物長途運輸?shù)闹饕妓衔?。蔗糖從“源”到“庫”轉(zhuǎn)運的第一步是韌皮部運輸，即光合作用所生成的糖從葉肉細胞（Mesophyll cells，MCs）到伴生細胞（Companion cells，CCs），再到小葉脈篩分子（Sieve elements，SEs）的轉(zhuǎn)運，主要采取質(zhì)外體裝載（Apoplasmic loading）和被動的共質(zhì)體裝載（Passive symplasmic loading）兩種策略［46-47］。前者是一個轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的能量耦合過程，而后者是一個滲透驅(qū)動過程，通過胞間連絲將蔗糖從MCs 轉(zhuǎn)運到CCs［46-47］。在通過SEs 進行長距離運輸并到達庫組織后，蔗糖被直接用于提供生長發(fā)育所需的碳和能量，或者被代謝成RFOs 或淀粉儲存在庫組織中。另外，部 分植物韌皮部運輸?shù)闹饕妓衔锸敲拮犹呛退K糖，而不是蔗糖，如南瓜科、唇形科和木樨科。除了上述兩種轉(zhuǎn)運策略外，這些植物還采用第3 種韌皮部加載策略——聚合物誘捕裝載（Polymer-trapping loading）［46-47］。在聚合物誘捕裝載模型中，葉片光合作用產(chǎn)生的蔗糖通過特化的胞間連絲從MCs 擴散到特化的CCs，然后聚合形成RFOs，即棉子糖和水蘇糖。在庫組織中，RFOs 從韌皮部卸載，α-Gal 將RFOs 水解為蔗糖和半乳糖，這些半乳糖也可以通過質(zhì)外體途徑進行分離。這就可以解釋為什么早期研究雖然發(fā)現(xiàn)這些植物韌皮部中的碳水化合物主要以RFOs 的形式進行運輸，但在庫組織中卻幾乎檢測不到RFOs［48］。最近研究表明在甜西瓜和黃瓜中編碼α-Gal 的基因ClAGA2［49］和CsAGA2［16］是控制水蘇糖和棉子糖水解的關(guān)鍵因素，并在維管束中特異性高表達；敲除ClAGA2后，SWEET3（Sugars will eventually be exported transporter 3）和TST2（Tonoplast sugar transporter 2）會影響甜西瓜的果糖積累［49］。

3.2 α-Gal 參與種子發(fā)育、脫水耐受及萌發(fā)

α-Gal 參與種子發(fā)育及脫水耐受過程。種子發(fā)育過程也是可溶性糖等物質(zhì)積累及種子活力形成的過程，而在此過程中，種子承受脫水的能力，以減少脫水的有害影響，減緩其代謝活動，最終在干燥狀態(tài)下長期保持生存能力，這種性質(zhì)被稱為“脫水耐受性”［50］。脫水耐受性是正常種子在發(fā)育過程中獲得的，在種子萌發(fā)后喪失。RFOs隨著種子的發(fā)育而積累，在種子成熟失水過程中形成玻璃態(tài)以維持膜和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性，從而發(fā)揮保護劑的作用，并且RFOs 也可以作為種子的貯藏化合物［51-53］。從種子脫水干燥到種子萌發(fā)后，可能需要α-Gal 活性和RFOs 維持一個穩(wěn)定的還原性單糖水平。Lahuta 等［54］通過研究羽扇豆種子發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)α-Gal 降低了RFOs與蔗糖的比例，而且發(fā)育種子和成熟種子中具有較高的α-Gal 活性，可能是導(dǎo)致種子貯藏期間活力下降的原因之一。玉米ZmAGA1在發(fā)育過程、成熟和干燥的種子中轉(zhuǎn)錄量較低，在吸脹24～36 h后有所增加［55］。種子貯藏性即種子貯藏后壽命，與種子的脫水耐受性部分相關(guān)，種子活力也與種子貯藏壽命密切相關(guān)。因此，具有良好脫水耐受性的種子往往具有較長的壽命和較高的活力。在擬南芥中過表達玉米的ZmAGA1會降低成熟種子中RFOS 和半乳糖苷的含量，從而導(dǎo)致種子發(fā)芽率更高，但種子衰老耐受性下降［14］。進一步分析表明，吸脹后ZmAGA1過表達種子的RFO 水平最低，α-Gal 活性迅速增加［14］。

此外，α-Gal 還參與種子萌發(fā)調(diào)控。雖然RFOs 從種子發(fā)育時便開始積累，但種子在萌發(fā)過程中不能直接使用RFOs，需要α-Gal 將RFOs分解為蔗糖和半乳糖，再進一步水解為單糖。這些單糖可能被吸收到生長的莖尖和根尖細胞膜或細胞壁中并為其提供能量，從而提高種子萌發(fā)活力［14］。例如，在豌豆（Pisum sativum）中過表達咖啡豆的α-Gal 能降低種子內(nèi)的棉子糖和水蘇糖含量，同時種子仍然保持90%以上的萌發(fā)率［56］。有研究表明，在芝麻種子成熟和早期萌發(fā)過程中，α-Gal 活性逐漸增加。當(dāng)用α-Gal 特異性抑制劑DGJ（Deoxygalactono jirimycin）處理豌豆種子時，種子的RFOs 分解受阻，發(fā)芽率顯著降低，并伴有GalK 和UDP-半乳糖焦磷酸化酶活性下降［57］。添加外源半乳糖可以解除對種子萌發(fā)的抑制，添加外源蔗糖可以部分解除抑制［57］，說明半乳糖含量與種子萌發(fā)呈正相關(guān)。研究表明酸性α-Gal和堿性α-Gal 在萌發(fā)中的表達也有先后，在豌豆種子中分離得到的酸性α-Gal 在種子成熟期間轉(zhuǎn)錄顯著增加，在萌發(fā)過程中也保持活性，而堿性α-Gal 在胚根突起后表達。酸性α-Gal 活性增加水解RFOs 或半乳甘露聚糖已在豆科植物中得到證實。酸性α-Gal 活性在番茄［58］和椰棗［59］萌發(fā)過程中的胚乳珠孔區(qū)顯著增加，然而，對玉米種子的研究發(fā)現(xiàn)酸性α-Gal 與種子萌發(fā)時的寡糖分解沒有關(guān)系，可能是3 種堿性α-Gal 發(fā)揮主要作用，這3 種α-Gal 與種子吸脹蛋白SIP（Seed imbibition protein）具有同源性，催化含有半乳糖基的RFOs 水解［55］。利用Genevestigator (https://genevestigator.com/)公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對擬南芥和玉米α-Gal 家族基因（GH27 和GH36）進行基因表達分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥AtSIP1、AtSIP3、AtAGAL2和玉米ZmSIP2、ZmRS7、ZmAGAL4、ZmAGAL5等α-Gal 編碼基因在種子吸脹萌發(fā)過程中呈顯著上調(diào)表達（圖2A）。此外，在玉米胚誘導(dǎo)愈傷組織中，ZmAGA1、ZmRS7、ZmAGAL1/2/4也呈顯著上調(diào)表達（圖2A）。

圖2 擬南芥和玉米GH27 和GH36 家族基因表達譜Fig.2 Expression profiles of GH27 and GH36 family genes in Arabidopsis thaliana and maize

從瓜爾豆（Cyampsis tetragonaloba）萌發(fā)種子的糊粉細胞中分離到一個編碼α-Gal 的基因，表明α-Gal 被分泌到胚乳中降解貯存的半乳甘露聚糖［60］。對列當(dāng)屬植物酸性α-Gal 亞家族成員OmAGAL2的研究表明，車前糖貯藏在干種子胚外，在種子萌發(fā)時，被質(zhì)外體中的OmAGAL2 水解成蔗糖，為胚萌發(fā)提供必需的己糖［61］。這些結(jié)果進一步證實，α-Gal 參與多種植物胚乳中貯藏碳水化合物的代謝，促進種子的萌發(fā)。

3.3 α-Gal 參與植物非生物逆境脅迫響應(yīng)

α-Gal 通過調(diào)節(jié)植物細胞內(nèi)RFOs 含量間接參與植物非生物逆境脅迫響應(yīng)。高等植物通過可溶性糖的合成、運輸和降解，協(xié)同調(diào)控胞內(nèi)可溶性糖的濃度，以響應(yīng)外界環(huán)境條件。目前，RFOs在植物非生物脅迫應(yīng)答中主要存在3 種不同的調(diào)控機制：（1）棉子糖可在風(fēng)干過程中保持細胞膜的穩(wěn)定性，防止復(fù)水后細胞內(nèi)溶物的泄漏和膜融合［62］；（2）半乳糖醇和棉子糖可作為滲透保護劑和ROS 清除劑，減輕不利條件下產(chǎn)生的氧化損傷［52,63］；（3）棉子糖可運輸?shù)饺~綠體中保護類囊體，穩(wěn)定光系統(tǒng)Ⅱ，在不利條件下維持植物的光合作用［64］。

極低溫（寒冷、寒冷或霜凍）和高溫會對植物生長和作物產(chǎn)量產(chǎn)生極其有害的影響。研究表明，冷處理可誘導(dǎo)擬南芥和水稻的棉子糖積累，并且在耐寒材料中的棉子糖水平顯著高于冷敏感材料［65-67］。Keller 等［68］研究表明，在抗凍甜菜中，棉子糖在肉質(zhì)根髓組織中的積累與抗凍性相關(guān)。在低溫脅迫下，水稻幼苗和葡萄藤木本組織中，GolS和RS基因的轉(zhuǎn)錄明顯增加，并出現(xiàn)棉子糖積累［69］。Han 等［70］研究表明，完全消除棉子糖的玉米zmrs突變株系對低溫脅迫的耐受性相較對照株下降。進一步的分析也證實了玉米ZmDREB1A 蛋白可以直接與ZmRS的啟動子結(jié)合，激活ZmRS表達，從而導(dǎo)致棉子糖積累并提高玉米的耐寒性［70］。類似地，乙烯響應(yīng)因子108（ERF108）可以直接靶向RS 酶基因來調(diào)節(jié)三葉橙（Poncirus trifoliata）的冷脅迫反應(yīng)［71］。此外，鈣調(diào)素類蛋白42（MtCML42）已被證明可以正向調(diào)節(jié)C-repeat binding factor（CBF）通路，進而增加MtGolS1和MtGolS2的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致棉子糖積累并增強苜蓿的耐寒性［72］。在矮牽牛中過表達α-Gal則會導(dǎo)致植物內(nèi)源棉子糖的減少和抗凍性降低，反之，下調(diào)α-Gal 會使植株抗凍性提高［17］。這些結(jié)果表明RFOs 在植物冷脅迫響應(yīng)中具有積極作用，α-Gal 活性增加會降低棉子糖含量，從而降低植物的抗凍性。

與冷馴化相比，去冷馴化也是一種重要的調(diào)節(jié)機制，它可以保證植物在去除脅迫條件后恢復(fù)到正常生長狀態(tài)。盡管人們研究了RFOs 在脅迫條件下的積累及其生理意義，但對脅迫消除后RFOs 的分解機理卻很少關(guān)注。α-Gal 負責(zé)在RFOs 分解代謝過程中去除非還原末端半乳糖殘基。Gu等［73］研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜酸性α-Gal（CsAGAL1）蛋白存在于液泡中，而堿性α-Gal（CsAGA2 和CsAGA3）蛋白分別存在于細胞質(zhì)和葉綠體中［73］。當(dāng)去除冷脅迫后，酸性和堿性α-Gal 在RNA 水平和蛋白活性水平均上調(diào)，而且冷脅迫期間積累在黃瓜葉片不同亞細胞的RFOs 在冷脅迫緩解后可被不同的α-Gal 原位分解。

鹽脅迫也是植物生長面臨的重要非生物脅迫之一。研究表明，堿性α-Gal 轉(zhuǎn)基因煙草植株在鹽脅迫下的種子發(fā)芽率和生長性能均高于野生型煙草［74］；而在玉米研究中發(fā)現(xiàn)，玉米堿性α-Gal家族基因ZmAGA1在種子萌發(fā)過程中卻不響應(yīng)鹽脅迫［55］。此外，Genevestigator 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，ZmAGA1在熱、旱、鹽、滲透等非生物脅迫下呈現(xiàn)顯著上調(diào)（圖2B），表明該基因在玉米苗期對上述非生物脅迫敏感。類似地，同屬GH36 家族的ZmRS8基因在干旱脅迫下呈現(xiàn)顯著上調(diào)，而ZmSIP2、ZmAGA3/4、ZmRS2則在冷、熱及水淹脅迫下呈明顯上調(diào)；在GH27 家族中，除ZmAGAL2在上述脅迫下呈現(xiàn)不同程度上調(diào)外，其他該家族同源基因表達變化不明顯（圖2B）。上述研究結(jié)果表明，植物α-Gal 家族基因在響應(yīng)非生物逆境脅迫中的功能可能已經(jīng)發(fā)生了分化，需要更進一步的深入研究。

3.4 α-Gal 參與植物細胞壁重塑

細胞壁是存在于植物細胞外圍的一層厚壁，主要起保護作用，同時也是影響細胞生長與分化的主要障礙［75-76］。植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠等多糖組成，這些大分子的組成和結(jié)構(gòu)調(diào)控了細胞壁的拉伸強度和穩(wěn)定性［77-78］。在細胞生長和分化過程中，植物細胞壁韌度不斷受到?jīng)_擊，并發(fā)生松弛和軟化［79］。質(zhì)外體α-Gal通過參與細胞壁代謝（細胞壁解離和擴張）在葉發(fā)育［13］、果實成熟［80］或通氣組織形成［81］中發(fā)揮重要作用。過度軟化是限制水果貨架期和儲存的主要因素，而α-Gal 可以通過影響果實的硬度來縮短采后壽命［82］。一般認為，果實成熟過程中發(fā)生的軟化現(xiàn)象是由α-Gal、果膠甲酯酶、纖維素酶、β-甘露聚糖酶等多種酶協(xié)同水解細胞壁多糖所致［83］。其中，α-Gal定位在細胞壁和細胞質(zhì)，參與細胞壁半纖維素成分半乳甘露聚糖支鏈末端α-半乳糖基的水解，從而調(diào)控果實軟化。隨著果實成熟，不同軟硬程度的番茄品種α-Gal 活性變化不同，其中，在果皮軟的番茄品種中，α-Gal活性顯著增加［84］。Soh 等［80］研究發(fā)現(xiàn)，木瓜中含有3 個α-Gal，其中α-Gal2 是主要的活性來源，且該酶在生長期木瓜中表達量很低，但是隨著果實成熟該酶的表達量和活性顯著增加，同時果皮的硬度逐漸減弱，表明在這一過程中，α-Gal2 對細胞壁的調(diào)控可能不僅起水解酶的作用，還具有聚糖酶和轉(zhuǎn)糖苷酶的活性。類似地，在黃瓜成熟過程中，CsGAL2可通過解離細胞壁促進果實快速生長［85］。

α-Gal 除參與果實成熟外，還與種子發(fā)育和萌發(fā)過程中種胚和胚乳細胞壁的形成和降解密切相關(guān)。在棗椰樹種子中，α-Gal 與胚乳細胞壁的形成和萌發(fā)時的降解息息相關(guān)［86］。在細胞壁形成中，該酶參與甘露聚糖的合成；在休眠種子中，絕大部分甘露聚糖存儲在占胚乳體積65%的細胞壁里，此時α-Gal 則定位在胚乳的蛋白體中；但是當(dāng)種子開始萌發(fā)，該酶被釋放到細胞壁，在細胞壁解離的過程中酶活性提高10 倍［86］。類似地，在種子萌發(fā)過程中，α-Gal 也發(fā)揮調(diào)控細胞壁解離的作用。例如，生菜的胚乳細胞壁富含半乳甘露聚糖，種胚萌發(fā)后胚乳細胞壁開始降解，為種子后續(xù)生長提供能量，這一過程是由α-Gal和endo-β-甘露聚糖酶協(xié)同完成的［87］。另外，研究發(fā)現(xiàn)，α-Gal 活性在番茄［58］和椰棗［59］萌發(fā)過程中的胚乳珠孔區(qū)增加，使胚乳細胞壁發(fā)生松弛和軟化，有利于種子胚根突破胚乳完成萌發(fā)。此外，與大多數(shù)有胚乳的種子一樣，咖啡的胚乳也含有大量的細胞壁儲備多糖（Cell wall storage polysaccharides），作為種子萌發(fā)和幼苗建成的能量，而這些儲備多糖一般是半乳甘露聚糖［88］。α-Gal 通過沉積后半乳糖取代的方式（Postdepositional degree of galactose substitution）參與半乳甘露聚糖的生物合成［88］。而在椰子胚乳中α-Gal活性的缺乏會導(dǎo)致胚乳中細胞壁定位的半乳甘露聚糖的水解障礙，從而造成凝乳椰子表型［89］。

植物細胞的不可逆伸長由兩個方面調(diào)控：一是細胞膨脹，二是細胞壁的延伸限制。在豇豆下胚軸里，α-Gal 的特異性抑制劑可以通過約束細胞壁的延伸從而抑制下胚軸的伸長［90］。在擬南芥中，α-Gal 的T-DNA 插入嵌合體呈現(xiàn)蓮座葉的突變體葉片形態(tài)，根據(jù)GUS 染色實驗發(fā)現(xiàn)該酶定位在葉片細胞壁上，說明該酶可在葉片發(fā)育過程中影響葉片細胞壁的有序擴張［13］。綜上所述，α-Gal 在果實成熟、種子萌發(fā)、葉片發(fā)育及衰老等生理過程發(fā)揮作用主要是通過參與細胞壁重塑（合成、修飾與水解）實現(xiàn)。

4 結(jié)語與展望

α-Gal 廣泛存在于動物、植物和微生物中，不同來源的α-Gal 其理化特性存在明顯差異［56-58］。根據(jù)其序列相似性及催化特性，α-Gal 可分為7 個GH 家族，由共同祖先演化而來，其催化的功能結(jié)構(gòu)域在進化上相對保守。近年來，隨著國內(nèi)外對α-Gal 的研究不斷深入，越來越多不同物種來源和不同家族的α-Gal 被鑒定出來，并廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料工業(yè)、化工、農(nóng)業(yè)及生物醫(yī)藥等多個領(lǐng)域。因此，α-Gal 亦被認為是最有應(yīng)用前景的酶制劑之一。然而，與一些應(yīng)用較為成熟的纖維素酶、脂肪酶等酶制劑相比，α-Gal在其催化的高級結(jié)構(gòu)、催化活性位點、酶與底物結(jié)合機制、酶的熱穩(wěn)定性等方面的研究仍非常有限，極大地限制了α-Gal 的進一步應(yīng)用。因此，亟需從不同來源物種中發(fā)掘、鑒定更多具有α-Gal酶活的編碼基因，并深入研究其催化分子機理，尤其是蛋白的高級機構(gòu)與構(gòu)效關(guān)系，進而通過分子設(shè)計手段對酶分子和表達宿主進行改造，消除基因表達、蛋白修飾和分泌等方面障礙，實現(xiàn)具有高催化活性和熱穩(wěn)定性的α-Gal 高效表達，以滿足潛在的巨大市場需求，并為拓寬α-Gal 在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

在植物中，α-Gal 僅有GH27 和GH36 兩個家族，均具有α-1,6-半乳糖苷水解酶活性，少數(shù)兼具水解酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。已有研究表明，α-Gal 廣泛參與植物葉片發(fā)育與衰老、果實成熟、種子發(fā)育與萌發(fā)以及逆境脅迫響應(yīng)等重要生理過程，然而目前有關(guān)其參與上述過程的生理及分子機制仍不清楚。細胞壁重塑在植物生長發(fā)育、果實成熟、種子萌發(fā)等過程中發(fā)揮重要作用。盡管已有研究表明，α-Gal 參與植物細胞壁的修飾及半乳甘露聚糖支鏈末端α-半乳糖基的水解，但在種子萌發(fā)過程中α-Gal 是否也通過水解細胞壁半乳甘露聚糖使細胞壁松弛軟化，進而促進種子胚根突破種皮完成萌發(fā)，仍需更多直接相關(guān)實驗數(shù)據(jù)。這是因為，一方面，不同物種種子細胞壁組成成分及種子種胚結(jié)構(gòu)存在較大差異。對于胚乳包被且胚乳富含半乳甘露聚糖的種子（如咖啡豆），在萌發(fā)早期α-Gal 與β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶協(xié)同作用水解半乳甘露聚糖促使細胞壁軟化，進而促進胚根突破形成萌發(fā)；而對于一般作物種子，是否也存在類似機制仍有待實驗證實。另一方面，若α-Gal 參與細胞壁水解，那么α-Gal 應(yīng)該屬于質(zhì)外體定位酶，但通過對模式植物擬南芥和玉米等α-Gal 基因編碼蛋白氨基酸進行信號肽預(yù)測分析，并未發(fā)現(xiàn)細胞外（質(zhì)外體）定位的信號肽，那么非經(jīng)典分泌蛋白α-Gal是如何轉(zhuǎn)運至質(zhì)外體的，這也有待深入研究。綜上所述，利用包括基因編輯在內(nèi)的遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等多種手段，深入研究α-Gal 家族基因的生物學(xué)功能及分子機理，將有助于上述問題的解決，這也是未來有關(guān)植物α-Gal 研究的熱點和發(fā)展方向。