基于同源重組的CRISPR 精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)及其在農(nóng)作物育種中的應(yīng)用

江桐欣，李曉琳，朱慶鋒，張 琪，張愛(ài)霞，劉勤堅(jiān)，于 洋，劉文華

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225）

成簇的有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR associated，Cas）是細(xì)菌和古細(xì)菌的獲得性免疫體系。自CRISPR 體系被改造成以RNA 為導(dǎo)向、以Cas蛋白為效應(yīng)蛋白的可程序化設(shè)計(jì)的核酸酶后，便取代以往的鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活子類(lèi)效應(yīng)子核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN），成為基因編輯領(lǐng)域最常用的工具。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中，CRISPR基因編輯通常用來(lái)敲除基因，達(dá)到驗(yàn)證基因功能或創(chuàng)制新種質(zhì)的目的。CRISPR 核酸酶在基因位點(diǎn)產(chǎn)生的雙鏈切口（DNA double strand break，DSB），經(jīng)非同源末端連接修復(fù)（Non-homologous end joining，NHEJ）后，在切口處往往插入或缺失一定數(shù)目的核苷酸，引起移碼突變而提前出現(xiàn)終止密碼子，從而使基因編碼產(chǎn)物失去正常功能。因?yàn)椴迦牖蛉笔У暮塑账嵬耆请S機(jī)性的，因而CRISPR基因敲除是一種非精準(zhǔn)的基因編輯。但是，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化形成的作物精英品種，往往會(huì)丟失一些優(yōu)良基因，而要從野生種或者地方品種中引入無(wú)遺傳拖拽（Genetic drag）的優(yōu)良基因，需要在精英品種基因組的安全位點(diǎn)進(jìn)行基因插入或等位基因位點(diǎn)進(jìn)行基因替換。與CRISPR 介導(dǎo)的基因敲除相比，CRISPR 介導(dǎo)的基因插入和基因替換屬于更為精準(zhǔn)的基因編輯，是實(shí)現(xiàn)基因編輯自由的終極目標(biāo)。

CRISPR 精準(zhǔn)基因編輯包括單堿基編輯（Base editing，BE）、引導(dǎo)編輯（Prime editing，PE）和基于同源重組（Homologous recombination，HR）的基因插入或替換。單堿基編輯是對(duì)堿基C 或A進(jìn)行置換產(chǎn)生T 或G 的編輯［1-6］，引導(dǎo)編輯是對(duì)任意數(shù)個(gè)到幾十個(gè)核苷酸進(jìn)行突變、插入或替換的編輯［7-8］。由于單堿基和引導(dǎo)編輯利用的脫氨酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被限制在CRISPR 產(chǎn)生的雙鏈切口附近，因而只能對(duì)切口附近的一個(gè)至數(shù)十個(gè)堿基進(jìn)行編輯，不能滿足長(zhǎng)片段的插入或替換?；谕粗亟M的CRISPR 精準(zhǔn)編輯，即基因打靶（Gene targeting，GT），可在CRISPR 靶位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈切口后，在含有靶位點(diǎn)同源序列的供體DNA 或RNA 存在的情況下，利用細(xì)胞內(nèi)在的同源定向修復(fù)（Homology directed repair，HDR）機(jī)制，在靶位點(diǎn)進(jìn)行DNA 大片段的插入或替換。本文從HDR 修復(fù)機(jī)制、CRISPR 組分（Cas9/12和sgRNA/crRNA）及修飾、供體DNA/RNA 及修飾、CRISPR 組分和供體DNA/RNA 在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的遞送等方面進(jìn)行綜述，并對(duì)基于同源重組的CRISPR 精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物基因功能分析和新技術(shù)育種中的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 DNA 雙鏈切口同源重組修復(fù)

1.1 SDSA 途徑介導(dǎo)的同源重組修復(fù)

在植物中，DNA 產(chǎn)生雙鏈切口（DSB）后，細(xì)胞中存在兩種主要修復(fù)機(jī)制，即非同源性末端連接修復(fù)（NHEJ）和同源定向修復(fù)（HDR），且發(fā)生NHEJ 的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HDR［9-11］。合成依賴(lài)鏈退火（Sequence-dependent strand anneling，SDSA）途徑是植物體細(xì)胞中主要的基于同源重組的修復(fù)機(jī)制，其過(guò)程如下：基因組DNA 產(chǎn)生雙鏈切口后，在MRN 復(fù)合體（Mre11、Rad50、Nbs1）等的作用下形成3'突出末端。在含有與3'突出末端同源的外源供體DNA 存在的情況下，突出末端侵入供體DNA，與供體DNA 同源臂互補(bǔ)配對(duì)，并以供體DNA 為模板合成DSB 缺失部分核苷酸，當(dāng)合成到另一個(gè)同源臂時(shí)脫離供體DNA，返回與基因組DNA 另一條鏈退火配對(duì)，這樣外源供體DNA 替換DSB 處的基因，或在DSB 處插入新的基因（圖1A）。此途徑中CtIP、RAD52、RAD54 等蛋白起到關(guān)鍵作用［12-14］。在植物減數(shù)分裂形成配子時(shí)，有一條與SDSA 途徑前半部分重疊的特殊同源重組修復(fù)途徑，稱(chēng)為雙鏈切口修復(fù)（Double-strand break repair，DSBR），雙鏈切口修復(fù)除在切口處產(chǎn)生基因的插入或替換外，有時(shí)也會(huì)產(chǎn)生基因的交換和重組［15］。

圖1 DNA 雙鏈切口同源重組修復(fù)Fig.1 DNA double-strand break（DSB）repair via homology recombination

1.2 NHEJ 輔助的SSA 途徑介導(dǎo)的同源重組修復(fù)

DNA 產(chǎn)生雙鏈切口后，如果在切口兩側(cè)出現(xiàn)重復(fù)序列，細(xì)胞會(huì)采用單鏈退火修復(fù)（Singlestrand annealing，SSA）連接兩個(gè)斷口。SSA 的修復(fù)過(guò)程如下：在MRN 復(fù)合體等的作用下，形成3'突出末端，切口兩側(cè)的3'突出末端在重復(fù)序列處退火配對(duì)，切除不配對(duì)的近3'末端序列，最后在連接酶的作用下形成丟失重復(fù)序列之間序列的DNA［16］。有別于微同源介導(dǎo)的末端連接（Microhomology mediated end joining，MMEJ），SSA 最短同源序列的長(zhǎng)度一般在63～89 bp［17］。在植物中，RAD51 家族蛋白XRCC2、RAD51B 和RAD51D 在SSA 途徑中起著重要作用［18］。

借助NHEJ 修復(fù)，SSA 也可被用于在基因組中插入或替換DNA 片段［19］，其過(guò)程如下：在細(xì)胞中引入含有待插入或替換序列和DSB 一側(cè)同源序列的供體DNA，當(dāng)基因組DNA產(chǎn)生雙鏈切口后，依賴(lài)NHEJ 途徑，使供體DNA 無(wú)縫插入在DSB 處，并重構(gòu)DSB 位點(diǎn)。當(dāng)再次產(chǎn)生DSB 后，SSA 修復(fù)機(jī)制發(fā)生作用，最后實(shí)現(xiàn)DNA 序列的插入或替換（圖1B）。

2 用于同源重組精準(zhǔn)基因編輯的CRISPR 核酸酶

2.1 Cas 及融合蛋白

Cas 蛋白是CRISPR 基因編輯系統(tǒng)的核心組分，這類(lèi)來(lái)自細(xì)菌和古細(xì)菌病毒免疫系統(tǒng)的蛋白，自從被改造為基因編輯工具后，在植物基因插入或替換中便得到廣泛應(yīng)用。Li 等［20］用Cas9 和供體DNA 在煙草原生質(zhì)體中獲得9%的基因打靶（Gene targeting，GT）效率，但在擬南芥原生質(zhì)體中未獲得成功。Li 等［21］利用Cas9 和供體DNA對(duì)水稻內(nèi)源的除草劑敏感基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因進(jìn)行替換，效率為2.0%。Shi 等［22］利用Cas9 和供體DNA 在玉米中進(jìn)行基因替換和插入，其效率分別為1%和2.5%～4.1%。Wolter 等［23］利用Cas12 和供體DNA在擬南芥中進(jìn)行基因打靶，效率為1.47%。Vu 等［24］利用Cas12 和供體DNA 在番茄中也成功進(jìn)行基因打靶，其效率因光照和溫度的變化而變化，介于6%～10%。

使用原始的Cas9 和供體DNA 進(jìn)行基因打靶，雖然其效率在不同植物中有所不同，但一般都在5%以內(nèi)，還有許多提升空間。考慮到DNA 雙鏈切口重組修復(fù)途徑中的一些關(guān)鍵蛋白以及Cas9 和供體DNA 的共位性（Colocalization）可能對(duì)HDR效率提高產(chǎn)生的影響，近年來(lái)相繼出現(xiàn)許多Cas9融合蛋白（圖2）。CtIP 在DSB 修復(fù)早期與5'端切除有關(guān)，開(kāi)啟了基于同源重組的SDSA 途徑。在動(dòng)物中，Charpentier 等［25］采用Cas9-CtIP 融合蛋白將基于同源重組的轉(zhuǎn)基因整合效率提高近2 倍。在HDR 途徑中，RAD52 有助于3'突出末端侵入供體DNA，Shao 等［26］利用RAD52-Cas9融合蛋白，將人細(xì)胞和豬細(xì)胞中同源重組效率分別提高3 倍和2.2 倍。根據(jù)動(dòng)物和植物HDR 途徑的相似性，在植物中使用Cas9-CtIP 和Cas9-RAD52 也有可能提高HR 效率。與該推論一致的是，在楊樹(shù)中過(guò)量表達(dá)CtIP 并同時(shí)抑制NHEJ途徑，可使基于同源重組的基因敲入效率提高48%［27］。除此類(lèi)HDR 途徑關(guān)鍵蛋白外，另一類(lèi)可直接結(jié)合或催化反應(yīng)后結(jié)合雙鏈或單鏈供體DNA 的蛋白或酶，也可與Cas9 形成融合蛋白，從而提高HR 效率。VirD2 是來(lái)自根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的毒性因子，能識(shí)別T-DNA 5'端邊界序列，繼而通過(guò)其松弛酶活性產(chǎn)生單鏈切口，并與產(chǎn)生的單鏈DNA 5'端共價(jià)結(jié)合，在T-DNA 由農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)位及其在植物細(xì)胞基因組整合過(guò)程中起著重要作用。利用VirD2 與單鏈DNA 的結(jié)合活性，Ali 等［28］使用Cas9-VirD2 融合蛋白在水稻中成功實(shí)現(xiàn)OsALS和OsCCD7 基因的替換以及OsHDT 基因HA 標(biāo)簽的無(wú)縫整合，HR 效率與Cas9 相比提高4 倍。鏈霉親和素（Steptavidin，SA）是自然界中存在的能非共價(jià)結(jié)合4 個(gè)生物素（Biotin）分子的蛋白，水溶性的單價(jià)鏈霉親和素（mono-Streptavidin，mSA）也具有較強(qiáng)的生物素單分子結(jié)合活性［29］。我們實(shí)驗(yàn)室采用Cas9-mSA 融合蛋白，在豬細(xì)胞基因組中進(jìn)行Rosa26 位點(diǎn)Green1 基因的無(wú)縫整合，效率為6%，在水稻中也成功獲得OsALS基因的替換植株，HR 效率約為4%。逆轉(zhuǎn)錄子（Retron）是細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的病毒免疫相關(guān)操縱子，包括逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transciptase，RT）基因和一段非編碼RNA，非編碼RNA 能被RT 逆轉(zhuǎn)錄成多拷貝單鏈DNA（Multicopy single-stranded DNA，msDNA），并形成RNA-msDNA 共價(jià)復(fù)合體［30］。Kong 等［31］在人細(xì)胞基因組中，利用Cas9-RTEMX1 和HEK3 位點(diǎn)進(jìn)行替換，其效率高達(dá)10%。同樣，Zhao 等［32］在人基因組中，利用Cas9-RT 進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯，HDR 效率最高可達(dá)11.4%。借鑒動(dòng)物中利用Cas9-RT 提高HDR 效率的成功經(jīng)驗(yàn)，在植物中利用Cas9-RT 進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯，有望獲得相同效果。

圖2 Cas 及融合蛋白Fig.2 Cas and fusion proteins

2.2 sgRNA/crRNA 及修飾

CRISPR 核酸酶的另一組分是與Cas 蛋白結(jié)合的小分子RNA，稱(chēng)為sgRNA（single guide RNA）或crRNA（CRISPR RNA）。與Cas9 蛋白結(jié)合的是sgRNA，與Cas12 結(jié)合的是crRNA。sgRNA 包括5'端與靶序列互補(bǔ)配對(duì)的含20 個(gè)核苷酸的引導(dǎo)序列以及3'端具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的83 個(gè)或93 個(gè)核苷酸的骨架序列（圖3）。為提高sgRNA 在細(xì)胞中的表達(dá)量和穩(wěn)定性，研究者對(duì)sgRNA 進(jìn)行序列和結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，衍生出幾種新型sgRNA，包括U-A 堿基對(duì)換的sgRNA（sgRNA flipped）、莖環(huán)結(jié)構(gòu)中配對(duì)堿基數(shù)增加10 個(gè)的sgRNA（sgRNA extended）、結(jié)合兩種修飾類(lèi)型的sgRNA（sgRNA flipped and extended）［33］。crRNA 包括5'端能形成莖環(huán)機(jī)構(gòu)的20、24 或29 個(gè)核苷酸的骨架序列，以及3'端與靶序列互補(bǔ)配對(duì)的21 個(gè)核苷酸的向?qū)蛄校▓D3）。同樣，對(duì)crRNA 5'端進(jìn)行延長(zhǎng)，增加4 個(gè)、9 個(gè)等數(shù)目的核苷酸，均可提高基于NHEJ 和HDR 的基因編輯效率［34］。

圖3 sgRNA/crRNA 及修飾Fig.3 sgRNA/crRNA and modifiers

3 用于同源重組精準(zhǔn)基因編輯的供體DNA/RNA

3.1 雙鏈供體DNA 及修飾

用于同源重組精準(zhǔn)基因編輯的雙鏈供體DNA具有如下結(jié)構(gòu)：5'端和3'端與靶位點(diǎn)同源的序列；中間為需要替換或插入的目標(biāo)序列。與靶位點(diǎn)同源的序列也稱(chēng)為同源臂，其為基因組雙鏈缺口產(chǎn)生后的3'突出端侵入供體DNA 提供互補(bǔ)配對(duì)序列，同源臂的長(zhǎng)度為數(shù)百到數(shù)千堿基不等［35］。供體DNA 可進(jìn)行多種修飾，產(chǎn)生多種可提高HR 效率的衍生體（圖4）。為防止細(xì)胞中脫氧核酸酶對(duì)雙鏈供體DNA 的降解，對(duì)雙鏈供體DNA 末端2～3 個(gè)磷酸酯鍵進(jìn)行硫代磷酸化（Phosophorothioation）修飾，有利于提高雙鏈供體DNA 在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。Gutierrez-Triana 等［36］采用硫代硫酸化的供體DNA 注射動(dòng)物胚胎，極大地提高了HR 效率。在水稻中，Lu 等［19］硫代磷酸化雙鏈供體DNA 4 個(gè)末端，并磷酸化雙鏈供體DNA 2 個(gè)5'末端，通過(guò)NHEJ 輔助的SSA 途徑，獲得6.1%的基因替換效率。5'端生物素標(biāo)記（Biotinylation）的雙鏈供體DNA，能結(jié)合Cas9-mSA 融合蛋白，使供體DNA 和DSB 共位，從而提高HDR 效率。我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用此方法成功獲得OsALS基因的替換水稻，HR 效率為4%。此外，有研究表明染色質(zhì)及其結(jié)構(gòu)影響HDR 效率［37］。Cruz-Becerra 等［38］將供體雙鏈DNA 染色質(zhì)化并引入人細(xì)胞，與“裸露”雙鏈DNA 相比，HR 介導(dǎo)的基因插入效率提高2.3～7.4 倍。

3.2 單鏈供體DNA/RNA 及修飾

單鏈供體DNA 與雙鏈供體DNA 一樣，含有5'和3'末端同源臂，但對(duì)HDR 效率的影響表現(xiàn)出不對(duì)稱(chēng)性（Asymmetry）的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAM（Protospacer adjacent motif）遠(yuǎn)端同源臂較短、PAM 近端同源臂較長(zhǎng)，可提高HDR 效率60%［39］。單鏈RNA 也可作為HDR 模板，Butt 等［40］在水稻中表達(dá)sgRNA 和模板RNA 相連的嵌合RNA，獲得OsALS 基因替換的水稻植株。同樣地，在水稻中，Li 等［41］利用Cas12 和在細(xì)胞核中表達(dá)crRNA 和供體RNA，使HDR 介導(dǎo)的OsALS基因替換效率達(dá)到1.7%～4.6%。為提高同源重組效率，單鏈供體DNA 或RNA 也可進(jìn)行適當(dāng)修飾（圖4）。在水稻中，Ali 等［28］利用5'端帶有T-DNA右邊界序列（Right border，RB）的供體單鏈DNA和Cas9-VirD2 蛋白，通過(guò)VirD2 識(shí)別和共價(jià)結(jié)合RB 序列，使單鏈供體DNA 和基因組DNA 雙鏈切口共位，從而使HR 介導(dǎo)的基因插入或替換效率提高4 倍。在逆轉(zhuǎn)錄子（Retron）基因編輯體系中，供體DNA 為多拷貝單鏈DNA（msDNA），每份拷貝供體DNA 的5'端通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄子結(jié)構(gòu)性RNA（msr）間接連接在sgRNA 上，這樣當(dāng)Cas9-逆轉(zhuǎn)錄酶（Cas9-RT）在細(xì)胞中產(chǎn)生雙鏈切口時(shí)，多份拷貝單鏈供體DNA 同時(shí)出現(xiàn)在雙鏈切口處，極大地提高了HDR 效率，在人細(xì)胞中HDR 介導(dǎo)的基因替換效率大于10%［31-32］。逆轉(zhuǎn)錄子基因編輯在動(dòng)物細(xì)胞中的成功應(yīng)用為植物基因編輯工具的開(kāi)發(fā)提供了一條嶄新的途徑。

圖4 供體DNA/RNA 及修飾Fig.4 Donor DNA/RNA and modifiers

4 植物遺傳轉(zhuǎn)化及CRISPR 組分和供體DNA/RNA 遞送

4.1 依賴(lài)于組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化及CRISPR 組分和供體DNA/RNA 遞送

像植物所有基因轉(zhuǎn)化一樣，植物基因插入或替換等精準(zhǔn)基因編輯往往需要通過(guò)組織培養(yǎng)，在植物細(xì)胞中同時(shí)遞送CRISPR 組分及供體DNA 或RNA，待細(xì)胞基因被編輯后，再誘導(dǎo)編輯細(xì)胞進(jìn)行胚胎發(fā)生，獲得再生植株（圖5A）。CRISPR組分及供體DNA 或RNA 可通過(guò)根癌農(nóng)桿菌侵染、基因槍轟擊和PEG/Ca2+轉(zhuǎn)化植物愈傷組織或原生質(zhì)體進(jìn)入植物細(xì)胞，且它們?cè)诩?xì)胞中的位置和數(shù)量直接影響基因插入或替換的效率。

圖5 植物遺傳轉(zhuǎn)化和CRISPR 組分和供體DNA/RNA 的遞送Fig.5 Plant genetic transformation and delivery of CRISPR reagents and donor DNA/RNA

將Cas9、sgRNA 和兩端含有sgRNA 識(shí)別位點(diǎn)的供體DNA 編碼序列置于同一個(gè)農(nóng)桿菌雙元表達(dá)載體上，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染進(jìn)入植物細(xì)胞并整合到植物基因組后，植物細(xì)胞核中就同時(shí)存在翻譯產(chǎn)生的Cas9、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的sgRNA 以及CRISPR組分酶切釋放的供體DNA，當(dāng)CRISPR 組分在靶基因處產(chǎn)生雙鏈切口后，可保障在切口處有供體DNA 的存在，從而實(shí)現(xiàn)靶基因的插入或替換，這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為植物原位基因打靶（in plantaGene targeting）［42］。植物原位基因打靶利用的供體DNA 只有一份，在農(nóng)桿菌雙元載體中插入雙生病毒（Geminivirus）復(fù)制子組分編碼序列，可使供體DNA 通過(guò)滾環(huán)復(fù)制形成多份拷貝，從而提高植物原位打靶的效率。Cermak 等［43］利用含有豆類(lèi)黃矮病毒（Bean yellow dwarf virus，BeYDV）復(fù)制子組分編碼序列的雙元載體，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，成功在ANT1 基因編碼序列前插入35S 啟動(dòng)子，在獲得的轉(zhuǎn)化植株中，有2/3 是HDR 介導(dǎo)的精準(zhǔn)插入。使用同樣的供體DNA 擴(kuò)增策略，Wang 等［44］利用小麥矮化病毒（Wheat dwarf virus，WDV）復(fù)制子，在水稻ACT1 和GST 位點(diǎn)分別實(shí)現(xiàn)19.4%和7.7%的精準(zhǔn)替換。

利用基因槍也可將Cas9、sgRNA 和供體DNA遞送到組織細(xì)胞，再通過(guò)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)分化產(chǎn)生基因編輯植株?；驑屴D(zhuǎn)化可根據(jù)需要以DNA、RNA 或核酸蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）的形式引入CRISPR 組分和供體DNA 或RNA，且不受引入數(shù)量的限制，因而在水稻和玉米等作物中廣泛使用。Ali 等［28］使用基因槍轉(zhuǎn)化法，將Cas9-VirD2、sgRNA 和帶有RB 序列的供體DNA 成功引入水稻愈傷組織細(xì)胞，分別獲得OsALS基因被替換、OsCCD7基因被替換及OsHDT基因后無(wú)縫整合HA 編碼序列的水稻再生植株。Sun 等［45］利用基因槍轉(zhuǎn)化法，將含有Cas9、sgRNA 和供體DNA 編碼序列的雙元載體以及游離供體DNA，一同引入水稻愈傷組織細(xì)胞，成功獲得OsALS 的替換植株。Lu 等［19］利用基因槍轉(zhuǎn)化法，將Cas9和sgRNA 編碼質(zhì)粒以及供體DNA 引入水稻愈傷組織細(xì)胞，利用雙鏈切口的NHEJ 輔助的SSA 途徑，在基因組中多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因插入或替換。Svitshev 等［46］用基因槍法轉(zhuǎn)化玉米幼胚，引入CRISPR 組分和供體雙鏈DNA 或單鏈DNA，也成功獲得ALS2 替換植株。

PEG/Ca2+轉(zhuǎn)化法可將Cas9 和sgRNA 組成的RNP 以及供體DNA 引入植物原生質(zhì)體，實(shí)現(xiàn)基因的插入或替換等精準(zhǔn)基因編輯。但對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，原生質(zhì)體再生植株難度較高。目前，在萵苣和番茄等植物中，已有通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得CRISPR 基因敲除植株的報(bào)道［47-48］，將來(lái)有望在這些植物中實(shí)施基于同源重組的更為精準(zhǔn)的基因編輯。

4.2 無(wú)組織培養(yǎng)過(guò)程的遺傳轉(zhuǎn)化及CRISPR 組分和供體DNA/RNA 遞送

組織培養(yǎng)是限制植物基因轉(zhuǎn)化或基因編輯效率的瓶頸之一，成熟植株從頭誘導(dǎo)分生組織分化形成幼莖的方法可消除這一瓶頸的影響。在雙子葉植物中，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子WUSCHEL2（Wus2）、SHOOT MERISTEMLESS（STEM）及植物細(xì)胞分裂素生物合成基因-異戊基轉(zhuǎn)移酶基因（Isopentenyl transferase，Ipt）在分生組織發(fā)生和維護(hù)及幼莖分化中起著關(guān)鍵的作用。Maher 等［49］將CRISPR 組分及Wus2、STEM 和Ipt 的不同組合，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染幼苗或成熟植株，在植株上產(chǎn)生靶基因編輯的幼莖，切下幼莖，進(jìn)一步在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，可獲得基因敲除的植株。目前，這一避開(kāi)植物組織培養(yǎng)、直接在幼苗和成熟植株上進(jìn)行的基因遞送，在Nicotiana benthamiana、番茄、馬鈴薯和葡萄中得以實(shí)現(xiàn)。

利用病毒將sgRNA 遞送到植物頂端分生組織，以期在后代種子中獲得基因編輯植株，是避開(kāi)組織培養(yǎng)的另一種有效方法。Ellison 等［50］用煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus）遞送融合了Flowering Locus T（FT）RNA 的sgRNA 到穩(wěn)定表達(dá)Cas9 的Nicotiana benthamiana植株頂端分生組織，在后代植株中有30%發(fā)生多位點(diǎn)基因編輯。在小麥中，Li 等［51］用大麥條紋花葉病毒（Barley strip mosaic virus）遞送融合了FT RNA 的sgRNA 到植株頂端分生組織，在后代植株中有12.9%～100.0%發(fā)生基因編輯。由于病毒遞送受到載體容量影響，基因插入或替換需要遞送除sgRNA 外的供體DNA 或RNA，因此將該技術(shù)用于基于同源重組的精準(zhǔn)基因編輯具有一定的挑戰(zhàn)性。

5 基于同源重組的CRISPR 精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)應(yīng)用前景展望

在開(kāi)發(fā)出基于NHEJ 輔助的SSA 介導(dǎo)的CRISPR 基因插入或替換技術(shù)后，Lu 等［52］呼吁在全球協(xié)作開(kāi)展水稻蛋白標(biāo)簽計(jì)劃（Rice Protein Tagging Project，RPTP），即在5 年內(nèi)對(duì)水稻全基因組編碼蛋白進(jìn)行原位FLAG 或HA 標(biāo)簽。預(yù)見(jiàn)在不久的將來(lái)，隨著這一計(jì)劃的順利實(shí)施，水稻蛋白定位，蛋白與蛋白互作，蛋白與DNA、RNA、碳水化合物和脂肪等互作的研究，將獲得長(zhǎng)足發(fā)展。這種系統(tǒng)性地解析水稻全基因組編碼蛋白功能的研究，將為水稻重要農(nóng)藝性狀的改良提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

基于同源重組的CRISPR 精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)還可直接應(yīng)用于作物育種中。Dong 等［53］利用該技術(shù)在水稻基因組的安全位點(diǎn)（Genomic safe harbor，GSH）插入類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因（5.2 kb），獲得類(lèi)胡蘿卜素在水稻種子中高水平表達(dá)而其他性狀不受影響的“黃金大米”。作物中的許多復(fù)雜生命過(guò)程，如次生代謝產(chǎn)物合成、C3 和C4 光合作用、生物固氮等，往往涉及到多基因的協(xié)同表達(dá)和時(shí)空調(diào)控。隨著同源重組介導(dǎo)的CRISPR 精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)不斷優(yōu)化，可望在作物代謝產(chǎn)物流向控制、C3向C4 光合作用轉(zhuǎn)變及固氮效能提高等方面有所突破。在作物遺傳改良中，許多性狀是由具有不同的編碼序列或啟動(dòng)子序列的等位基因決定的，利用基于同源重組的CRISPR 基因編輯技術(shù)可克服傳統(tǒng)育種的遺傳拖拽現(xiàn)象，達(dá)到在精英品種中迅速引入并固定野生植物或農(nóng)家品種中優(yōu)良等位基因的目的。在作物雜交育種中，如果選育的目標(biāo)性狀是由隱型突變基因控制的，可利用有性生殖過(guò)程中的同源重組機(jī)制，構(gòu)建隱性突變基因的CRISPR 基因驅(qū)動(dòng)（Gene drive），使隱性突變基因在雜種F1代中進(jìn)行超孟德?tīng)栠z傳，從而使優(yōu)良性狀在雜種F1代中迅速穩(wěn)定下來(lái)。

生物基因組的自由撰寫(xiě)（編輯）是自基因組完整閱讀（測(cè)序）以來(lái)合成生物學(xué)領(lǐng)域一直追求的目標(biāo)，基于同源重組的CRISPR 精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)在動(dòng)植物中的成功應(yīng)用，無(wú)疑是向這一目標(biāo)邁進(jìn)的一大步。隨著對(duì)植物同源定向重組修復(fù)機(jī)制研究的更加深入和CRISPR 基因編輯技術(shù)的不斷革新，基于同源重組的CRISPR 精準(zhǔn)編輯技術(shù)必將在農(nóng)作物功能基因組學(xué)研究和新技術(shù)育種中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。