基于腸道宏基因組對彈涂魚兩棲適應性的研究

董 博，鄧涵逸，孫藝秋，房元杰，彭淼曦，石 瓊，貝錦龍，魏文康，陳 莊

（1.廣東省農業(yè)科學院農業(yè)生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.深圳市海洋生物基因組 學重點實驗室，廣東 深圳 518083；3.深圳大學生命科學與海洋學院，廣東 深圳 518061）

【研究意義】彈涂魚是一類可以在水中和陸地上生存的硬骨魚類，棲息于海洋潮間帶灘涂，低潮時暴露在空氣中。3.6 億年前，魚類成功從水生生物轉變?yōu)殛懙厣锘蛩淖銊游?，這一過渡期間的形式尚存在化石中。兩棲魚類成為了解脊椎動物水陸轉變相關遺傳變化提供了有用的研究模型［1］。

【前人研究進展】依據(jù)基因組數(shù)據(jù)分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹結果對彈涂魚分類，大彈涂魚屬（Boleophthalmus）和青彈涂魚屬（Scartelaos）構成一個類群，而齒彈涂魚屬（Periophthalmodon）和彈涂魚屬（Periophthalmus）構成另一類群。這個分群與它們的水生習性一致，前一類群水生習性強，而后一類群陸生習性特別強，其中大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）棲息于中低潮帶的泥灘，植食性，刮食底棲硅藻，水生習性較強；而大鰭彈涂魚（Periophthalmus magnuspinnatus）棲息于中高潮帶的水草或紅樹林灘涂區(qū)域，肉食性，主要捕食水生昆蟲及小型甲殼生物等，一生中約2/3 的時間離水生活，陸生習性最強。作為從水生魚類進化到陸生四肢動物過渡環(huán)節(jié)的代表，彈涂魚及其兩棲適應性一直受到國內外研究者的關注，其陸地適應包括通過空氣呼吸、有更高的氨耐受性、使用改良的胸鰭進行陸地運動、抗病能力強以抵抗水陸兩種生境中眾多不同的病源微生物等［2］。這些進化的表型被認為是選擇壓力驅動的遺傳進化的結果［1］。然而，目前對胃腸道微生物群宏基因組這一生物體第二基因組所賦予的兩棲適應性知之甚少。

免疫是兩棲魚類在從水到陸地過渡期間應對多樣化環(huán)境和各種病原體的關鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，與其他硬骨魚分離后，彈涂魚的先天免疫系統(tǒng)基因顯著擴增［1］。在已測序的脊椎動物中，彈涂魚擁有最多數(shù)量（11 拷貝）的TLR13［1-2］，這有利于防御陸地病原體。除了提供陸地適應的基因組外，彈涂魚腸道微生物群在免疫等生理特征中起重要作用［3-7］。胃腸道微生物群與宿主共同從水到陸地的過渡期間進行了數(shù)百萬年進化，魚類的許多生理功能由它們維持或參與，包括病原體的拮抗作用、腸上皮細胞的增殖和免疫系統(tǒng)的成熟等［8-10］。

【本研究切入點】長期以來，人們認為所有魚類的宿主遺傳背景和環(huán)境因素使其選擇“核心微生物群”來維持所有魚類成員共有的一些基本功能［11］。這個假設可以推廣到兩棲動物和陸生脊椎動物。而彈涂魚的獨特生活習性將為這一假設以及核心微生物群如何從水生變?yōu)殛懙兀?2-13］提供參考?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用16S 擴增子測序和宏基因組技術，通過比較分析兩種水陸生習性差異較大的彈涂魚代表種與具有代表性的水生魚類的胃腸道微生物群組成、豐度、多樣性和功能，以期得出有益于其兩棲適應性的標志胃腸道微生物群，為彈涂魚對兩棲生活的適應性提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的大彈涂魚和大鰭彈涂魚分別于2016年7 月和2017 年7 月在廣東省珠海市淇澳島野外捕獲。供試的水生魚類為草魚、鰱魚和鳙魚，于2016 年8 月在廣東省廣州市一孵化場收集，每尾重約1～2 kg，采用深圳澳華農牧有限公司的商業(yè)飼料喂養(yǎng)。選擇大而健康的個體，用無菌蒸餾水沖洗魚體表，并使用70%乙醇消毒，然后作無菌解剖取出后腸，擠出腸道內容物和上皮粘膜，于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。所有試驗均按照動物倫理委員會的指導方針開展。

1.2 宏基因組DNA 提取

本研究選取4 條大彈涂魚、3 條大鰭彈涂魚、8 條草魚、5 條鰱魚、1 條鳙魚的腸道內容物和上皮粘膜樣品共21 份，冰上解凍后采用DNA 提取試劑盒（CTAB 法）提取總細菌DNA［14］。在1%瓊脂糖凝膠上檢測DNA 的完整性和純度，通過Qubit 熒光計（Thermo Fisher Scientific，USA）測量DNA 濃度。將提取的宏基因組DNA 保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 文庫構建和驗證

通過超聲波基因剪切儀Covaris 將宏基因組DNA 分解成350 bp 片段用于電泳測定。隨后將片段化的DNA 與End Repair Mix（NEB，USA）混合于20 ℃下溫育30 min。用QIAquick PCR 純化試劑盒（Qiagen，USA）純化末端修復的DNA，然后加入A-Tailing Mix（NEB，USA）。連接后，通過2%瓊脂糖凝膠選擇接頭連接的DNA 以回收靶片段。純化凝膠并進行PCR 擴增以富集接頭連接的DNA 片段。然后通過2%瓊脂糖凝膠選擇PCR 產物，并使用QIAquick PCR 純化試劑盒純化以回收靶片段。構建的文庫以兩種方式定量，包括使用Agilent 2100 生物分析儀與Agilent DNA 1000 試劑測定平均分子長度，以及通過定量實時PCR 儀（Agilent，USA）對文庫進行定量。

1.4 文庫測序

首先在cBot 儀器（Hiseq 4000 PE Cluster Kit，Illumina，USA）的流動池內擴增合格的文庫用于生成簇。隨后將聚集的流動細胞加載到Hiseq 4000 測序儀（Hiseq 4000 SBS Kit，Illumina）上進行雙末端測序，推薦的測序基因長度為100 bp 或150 bp。

1.5 宏基因組的組裝和注釋

通過Illumina Hiseq PE150 平臺對總共21 個樣品進行測序。宏基因組由MEGAHIT 軟件組裝，分析由深圳倍森基因科技有限公司實施［14-15］。推斷的氨基酸序列的注釋通過蛋白質分子序列比對搜索工具BLASTP 針對NR 數(shù)據(jù)庫進行（E≤1e-3，KAIJU）［16］。為了確定腸道微生物群的準確系統(tǒng)發(fā)育組成，將所有宏基因組測序基因比對到原核參考基因組，使用具有默認參數(shù)的核酸分子序列比對搜索工具BLASTN 提交至NCBI 的基因組數(shù)據(jù)庫，針對每個相應宿主的基因組過濾序列相似性≥75%的測序基因。

1.6 OTU 統(tǒng)計和維恩圖繪制

通過軟件USEARCH（v7.0.1090）［17］將標簽聚類到OTU（操作分類單元）：（1）使用UPARSE 將標簽聚集為97%閾值，得到OTU 唯一代表序列。每個樣本的OTU 數(shù)主要代表樣本多樣性程度。（2）使用UCHIME（v4.2.40）過濾掉嵌合體。（3）使用USEARCH GLOBAL（擴增子分析軟件）將所有標簽映射到每個OTU 代表性序列，然后將每個樣品中每個OTU 的標簽號總結為OTU 豐度表。使用核糖體數(shù)據(jù)庫RDP（v.2.2）分類器對序列進行分類（在Greengenes 數(shù)據(jù)庫上訓練，以0.8 信任值作為閾值）。

基于OTU 豐度列出每組的OTU 用于比較。維恩圖由軟件R（v3.1.1）繪制，其中匯總了公共或特定的OTU ID。不同的顏色代表不同的樣本或組，每個圓圈的內部象征性地表示觀察到的OTU數(shù)量，重疊區(qū)域或交叉點表示公共OTU 集，單層區(qū)域表示在某個樣本/組中唯一標識的OTU 數(shù)量。

2 結果與分析

2.1 魚類宏基因組數(shù)據(jù)集的總結

本研究選取4 條大彈涂魚、3 條大鰭彈涂魚、8 條草魚、5 條鰱魚、1 條鳙魚的腸道內容物和上皮粘膜樣本進行16S rRNA 測序，分別生成29 Mb、17.39 Mb、22 Gb、46.7 Gb 和12 Gb 的原始數(shù)據(jù)。由于宿主污染占原始數(shù)據(jù)的大部分，因此對所有序列數(shù)據(jù)過濾以去除宿主污染并生成魚類宏基因組數(shù)據(jù)。最終從宏基因組數(shù)據(jù)中，本研究注釋共4 966 種、1 453 屬、378 科、178 目、76 類和54 門。

草魚的胃腸道微生物群（表1）由梭桿菌門（35.39%）、厚壁菌門（20.34%）、擬桿菌門（18.10%）、變形菌門（14.89%）和CKC4 門（7.66.%）主導，這與之前的研究結果一致［12,18］，但豐度可能因飼養(yǎng)條件和魚類年齡不同而有所不同。代表性的屬分別是氣單胞菌屬（19.02%）、希瓦氏菌屬（3.79%）、鯨桿菌屬（2.96%）、擬桿菌屬（1.60%）和梭菌屬（0.81%）。

表1 彈涂魚與草魚、鰱魚、鳙魚在胃腸道微生物門水平上的相對豐度（%）Table 1 Relative abundance (%) of the gastrointestinal phyla annotated in mudskippers and Ctenopharyngodon idellus,Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis

2.2 彈涂魚和草魚、鰱魚、鳙魚之間微生物物種及豐度的比較

2.2.1 彈涂魚胃腸道微生物組成 在彈涂魚的宏基因組中，本研究觀察到胃腸道微生物群的厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門占比較大（表1），然而每個菌的豐度在大彈涂魚和大鰭彈涂魚之間顯著不同。例如，厚壁菌門在大彈涂魚中占胃腸道微生物約35%，而在大鰭彈涂魚中僅為1%；相反，梭桿菌門在大鰭彈涂魚中占43%，遠遠超過其在大彈涂魚中的比例。此外，大彈涂魚的胃腸道微生物門水平上的多樣性顯著高于大鰭彈涂魚。胃腸道細菌的多樣性從雜食性動物到食草性動物一般是增加的［19-20］，草食性的大彈涂魚胃腸道細菌多樣性高于雜食性的大鰭彈涂魚也可以證明這一事實［2］。

這兩種彈涂魚物種胃腸道微生物組成的另一個顯著區(qū)別是藍細菌在大彈涂魚中所占比例為6.11%，而在大鰭彈涂魚中則未發(fā)現(xiàn)，這種差異與兩者間較大的水陸習性差異相符合。前者更偏水生且更多地攝取海水中的藻類（包括藍藻）［19-20］等。

2.2.2 草魚、鰱魚和鳙魚胃腸道微生物組成 鳙魚、鰱魚和草魚的宏基因組結果（表1）與之前的報道［21-25］一致，其中4 種主要門類厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門豐度相對較高。厚壁菌門和擬桿菌門的比例從這3 種鯉科魚類到大彈涂魚，再到大鰭彈涂魚逐漸增加，與上述3種水生性鯉科魚類及偏水生性的大彈涂魚相比，偏陸生性的大鰭彈涂魚胃腸道中厚壁菌門和擬桿菌門比例更高［20］。

2.2.3 彈涂魚和草魚、鰱魚、鳙魚之間胃腸道微生物差異 胃腸道微生物群在3 種鯉科魚類與彈涂魚中的最大差異在于CKC4 門，在鯉科魚類中占比從4%～27%不等，而在大彈涂魚中僅為0.21%，在大鰭彈涂魚中則未發(fā)現(xiàn)（圖1）。目前關于CKC4 門細菌群的信息很少，其最早在斑馬魚胃腸道中被發(fā)現(xiàn)。之前的研究表明CKC4 門可能對雌激素及其類似物敏感，推測內分泌暴露顯著改變了斑馬魚腸道微生物群中CKC4 門的豐度［26］，CKC4 門可能與宿主脂質代謝的變化有關。

圖1 彈涂魚和草魚、鰱魚、鳙魚宏基因組中注釋的胃腸道微生物門水平相對豐度比較Fig.1 Comparison of relative abundance of the gastrointestinal phyla annotated in the metagenomes of mudskippers and Ctenopharyngodon idellus, Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis

2.3 不同物種之間的微生物群種類組成和豐度比較

本研究在NCBI 上下載了38 種物種的16S rRNA 測序數(shù)據(jù)，以及可用的宏基因組結果。對收集的不同物種微生物組數(shù)據(jù)加以對比，可反映每個進化群體中胃腸道微生物群的整體變化和細微變化。將不同物種分為5 類，分別為兩棲魚類、海水魚類、淡水魚類、兩棲動物和陸生動物（表2）。

表2 獲取腸道16S rRNA 數(shù)據(jù)進行比較的40 個脊椎動物匯總Table 2 Summary of 40 vertebrate species with available 16S rDNA data for comparisons

彈涂魚和草魚、鰱魚和鳙魚的胃腸道微生物組成與豐度在圖1 中的分布與表1 呈現(xiàn)的結果一致。根據(jù)5 類魚類中綱水平微生物群組成可知，彈涂魚中的黃桿菌含量遠遠高于其他魚類。事實上，黃桿菌屬于條件致病菌，廣泛分布于水和陸地，并對野生魚類和人工繁殖的魚類種群構成嚴重威脅［27］。本研究通過搜索相應的宏基因組注釋結果，在大彈涂魚的胃腸道微生物群中發(fā)現(xiàn)腸球菌菌株（0.07%）。這些革蘭氏陽性細菌通常存在于陸生哺乳動物中［28］。

由圖2 可知，瘤胃菌科Ruminococcaceae 和毛螺菌科Lachnospiraceae 在彈涂魚、兩棲動物和陸地哺乳動物中相對豐富（分別為0.16%和0.61%，7.0% 和4.4%，10.3% 和11.9%）。特別是S24-7 家族，在陸地動物胃腸道微生物群（14.60%）中特別豐富，在彈涂魚（0.78%）中也有少量，但不存在于水生魚類和兩棲動物中。

圖2 5 類物種的胃腸道微生物群的門（A）、綱（B）、科（C）水平分類組成Fig.2 Taxonomic compositions of gastrointestinal microbiota in five species at the phylum (A),class (B) and family (C) level

同樣，梭菌科Clostridiaceae、莫拉氏科Moraxella、梭桿菌科Fusobacteriaceae 在淡水魚類中最為豐富（分別為16.6%、3.3%和33.2%）；在彈涂魚中比較豐富（分別為3.6%、4.0%和14.2%），但在其他3 組中低于1.5%、0.3%、6.0%。已有研究發(fā)現(xiàn)，酪酸梭菌可以改善南美白對蝦的生長性能，增加體內粗蛋白含量，調節(jié)腸道消化能力，增強腸道對氨脅迫的免疫功能［29］；產氣莢膜梭菌是魚類中一種重要的食源性病原體，被認為是魚類的致病微生物［30］。

2.4 彈涂魚與陸生動物胃腸道微生物比較分析

維恩圖可以顯示多樣本/組中的共同/唯一OTU 的數(shù)量。如果與OTU 代表性物種結合，可以獲得不同環(huán)境的核心微生物組。通過文獻找到40 種物種的可用胃腸道宏基因組數(shù)據(jù)。OTU 集的相關維恩圖顯示將有助于確定彈涂魚和陸生動物之間的關系。本研究發(fā)現(xiàn)，兩棲彈涂魚和陸生動物（包括兩棲動物和陸棲哺乳動物）腸菌之間有759 個OTU 重疊；不同于魚類的彈涂魚與陸生動物的OTU 大部分來自S24-7 以及毛螺菌Lachnospiraceae、瘤胃菌科Ruminococcaceae、理研菌科Rikenellaceae（圖3）。這些菌株的詳細功能值得進一步探索。

圖3 彈涂魚、兩棲動物和陸生動物胃腸道微生物中不同典型OTU 科水平的分類組成Fig.3 Taxonomic compositions of various typical OTU in gastrointestinal microbiota of mudskippers,amphibians and terrestrial animals at family level

2.5 大彈涂魚與草魚宏基因組功能注釋比較

基于所有彈涂魚樣本的宏基因組數(shù)據(jù)的功能注釋和豐度信息，選擇每個樣本中前35 個功能類別及其豐度信息來繪制熱圖并聚類以獲得功能差異。從圖4 可見，大彈涂魚中宏基因組功能特征與草魚的功能特征具有顯著差異，最顯著的差異是氨通道蛋白AmtB，其在大彈涂魚微生物群中比在草魚中更豐富，并且其高氨運輸能力與彈涂魚適于潮間生活的氨抗性特征相關［1-2］。

圖4 大彈涂魚與草魚宏基因組的功能注釋熱圖Fig.4 Heat map of function annotation from the metagenomes of Boleophthalmus pectinirostris and Ctenopharyngodon idellus

3 討論

魚類微生物組研究目前在魚類研究中的代表性較低，特別是與其他動物宿主相比具有獨特生理和生化差異的兩棲彈涂魚。因此，本研究首次研究了魚類、兩棲動物和陸地脊椎動物之間的胃腸道微生物群差異或重疊。兩棲魚類、海水魚類、淡水魚類、兩棲動物和陸生動物的進化譜系雖然清晰，但胃腸道微生物群和相應的宏基因組的進化仍然不明確。

3.1 大彈涂魚和大鰭彈涂魚之間的胃腸道微生物群組成的差異

為了研究彈涂魚胃腸道微生物在兩棲習性中的作用，本研究選擇大部分陸棲物種大鰭彈涂魚和相對偏水生大彈涂魚來收集胃腸道微生物并對其進行后續(xù)的16S rDNA 擴增子測序。盡管這兩種彈涂魚物種具有密切的遺傳關系，但它們在地理標志微生物類別、多樣性和豐富程度之間存在顯著差異，這可能是由于不同的棲息地和飼養(yǎng)偏好。本研究發(fā)現(xiàn)，大彈涂魚胃腸道微生物中藍細菌豐度較高，這可能與其更多的水生生活方式和對藻類的偏好有關［1-2］。另外，大彈涂魚中胃腸道微生物群多樣性較大鰭彈涂魚高，而這與偏植食性動物的胃腸道微生物多樣性通常較高是一致的［19-20］。

3.2 彈涂魚、水生魚類和陸地動物的胃腸道微生物群特征比較

魚類（彈涂魚和草魚、鰱魚、鳙魚）胃腸道微生物類別在門的水平上相對穩(wěn)定。盡管每種門的豐度在不同魚類中變化很大，但最豐富的門是厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和變形菌門。然而，一個顯著的例外是CKC4 門，它僅在草魚、鰱魚、鳙魚的鯉科魚類中普遍存在，在彈涂魚中僅存在0.21%。為了仔細檢查家族層面的差異，本研究發(fā)現(xiàn)許多微生物菌株只存于兩棲彈涂魚和陸生動物，如瘤胃菌科Ruminococcaceae 和毛螺菌科Lachnospiraceae，特別是S24-7，表明兩棲彈涂魚通過胃腸道微生物來適應陸地生活。研究還發(fā)現(xiàn)，大彈涂魚中的黃桿菌比其他魚類多，檢測到胃腸道微生物群中的腸球菌菌株豐度為0.07。據(jù)報道，腸球菌菌株產生AMP 樣物質并且對從病魚中分離的病原菌表現(xiàn)出廣譜抑制，特別是對革蘭氏陰性菌冷黃桿菌Flavobacterium frigidarium、果膠弧菌Vibrio pectenicida、對蝦弧菌V.penaeicida和美人魚發(fā)光桿菌Photobacterium damselae［31］。在彈涂魚胃腸道中腸球菌菌株和致病性黃桿菌之間可能存在平衡關系，因此彈涂魚可以在這種不利環(huán)境中忍受相對高豐度的黃桿菌。在健康的彈涂魚個體中，這種病原體的相對高豐度表明兩棲魚可能已經對不同生活棲息地的致命病原體產生了特殊的抗性。彈涂魚這種強大的免疫特性有待進一步研究。

3.3 核心微生物群和影響胃腸道微生物群的關鍵因素

許多因素促成了硬骨魚類胃腸道微生物群的組成，包括宿主遺傳、環(huán)境、胃腸道生理、細菌共生體和營養(yǎng)［32］。核心微生物組，即環(huán)境中所有魚類個體中存在的微生物群落成員，已經成為研究胃腸道微生物群落科研人員的主要目標［32-34］。

總體而言，包括海水魚類［34］和淡水魚類［26,35-38］在內的胃腸道微生物群主要是變形菌門，其次是梭桿菌門和厚壁菌門，以及擬桿菌門、放線菌門和疣粒菌門［38］，占總菌群的90%，每個主要門的含量在不同物種中都有顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)彈涂魚的胃腸道微生物群同時擁有陸地、淡水、海洋和兩棲群體的典型家族，這與彈涂魚的水陸過渡和咸淡水界面棲息的特征情況非常吻合［2］。在一定程度上，這一發(fā)現(xiàn)也為生態(tài)環(huán)境和棲息特點影響核心微生物菌群的假設提供了證據(jù)，即在過渡階段兩棲性的彈涂魚依靠多樣的腸道微生物來應對不同環(huán)境。

3.4 與彈涂魚兩棲適應性相關微生物菌株

彈涂魚是兩棲魚類，但很少有關于其先天免疫系統(tǒng)成分的系統(tǒng)研究，尤其是當免疫力來自胃腸道微生物群對病原體屏障的研究。本研究首次分析了兩種代表性兩棲彈涂魚（大彈涂魚和大鰭彈涂魚）的胃腸道微生物群，并對其中的微生物進行注釋，以探討胃腸道中是否存在特殊菌株或抗菌肽以適應潮間帶復雜多變的不利環(huán)境（如高氨低氧）。

本研究結果表明，彈涂魚中不同 OTU 最多來自 S24-7、毛螺菌Lachnospiraceae、瘤胃菌Ruminococcaceae、理研菌Rikenellaceae，這提示以上菌株對陸地生物獨特的功能值得研究。從綱水平菌群比較大彈涂魚和草、鰱、鳙魚的胃腸道微生物組成，黃桿菌在大彈涂魚中含量高于其他海洋魚類和淡水魚類。另外，瘤胃菌Ruminococcaceae 和毛螺菌Lachnospiraceae 在彈涂魚、兩棲類和陸棲類群中相對豐富。

值得注意的是，S24-7 家族在陸地動物腸道微生物群中占有獨特地位（14.60%），在彈涂魚（0.78%）中也可以找到，但在魚類和兩棲動物中均不存在，該家族表現(xiàn)出對于恒溫性腸道的強烈偏好性，核心代謝為發(fā)酵及厭氧細菌［38］。這使得該類研究中大部分為陸生動物群體。據(jù)報道，具有脲酶活性的S24-7 產生脲酶，能夠分解尿素產生氨，增加血液循環(huán)中的氨含量，由此推測彈涂魚的氨耐受能力強，與胃腸道中的S24-7 存在一定關聯(lián)。另外，多項研究報道了S24-7 家族成員豐度的改變與不同的環(huán)境條件有關，且至少有一些成員是先天免疫系統(tǒng)的目標，該家族涉及宿主-微生物相互作用，并且能夠影響腸道功能和健康，具體表現(xiàn)在其可以改變宿主腸道中的局部免疫系統(tǒng)，細菌細胞在正常生理狀態(tài)下不與腸細胞接觸；然而它們可能會將DNA 釋放到粘液層中，通過特異性受體（如Toll 樣受體9）影響宿主先天免疫細胞［39］。據(jù)報道，S24-7 可通過與腸粘液層相互作用調節(jié)免疫功能［40］。

4 結論

彈涂魚胃腸道微生物群具有典型的陸生、淡水、海洋和兩棲動物復合微生物群落，這與彈涂魚陸地-水過渡的特殊生態(tài)位以及在淡水和海水界面生存的特點有關。這一發(fā)現(xiàn)也為核心腸道微生物群的概念提供了支持，因為不同的生態(tài)環(huán)境和生活習慣選擇了相應的微生物群，而在過渡階段的兩棲動物將兩套胃腸道微生物群集合起來應對兩個不同的環(huán)境。本研究展示了5 個類群OTU集（淡水魚類、海洋魚類、陸地動物、兩棲動物和彈涂魚）。韋恩圖的對比關系進一步反映了從水生到兩棲進化過程中兩棲動物（如彈涂魚）胃腸道微生物群的變化。結果表明，有243 個OTU在陸地脊椎動物中被發(fā)現(xiàn)，但在淡水和海洋魚類中均不存在，這些物種可能涉及陸地代謝、氨抗性和干暴露等細菌或真菌，其中13 個OTU 出現(xiàn)在兩棲動物中，其余230 個出現(xiàn)在陸生動物中。此外，兩棲動物和彈涂魚中存在27 種OTU，但在淡水魚類和海洋魚類中不存在，提示這些OTU可能與兩棲生活方式有關。

與水生魚類相比，彈涂魚胃腸道微生物群的多樣性更高，即彈涂魚擁有硬骨魚類中最大的TLR基因多樣性（11 個重復成員）［1］。更多樣性的TLR 譜系將通過PRR（模式識別受體）識別更多的病原體類別，并促進免疫因子和AMP 表達的下游激活［41］，這將極大提高腸上皮的免疫力和健康［42-43］。結合前人有關TLR 擴張的發(fā)現(xiàn)，支持有關兩棲物種具有高免疫抵抗力而適于惡劣和多樣潮間下生活的結論。