黃芪多糖對脂多糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

秦劭晨，王愛梅，萬曉波

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院·山西 太原 030024；2太原市中醫(yī)醫(yī)院·山西 太原 030009)

腦梗死在臨床上有較高的致死率、致殘率。腦梗死發(fā)生后盡早建立側(cè)支循環(huán)，促進(jìn)血管新生，增加腦血流灌注，可有效減輕神經(jīng)功能缺損，改善預(yù)后。血管內(nèi)皮細(xì)胞對維持血管正常功能、血管新生有著至關(guān)重要作用，而血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖是血管新生發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的連接完整性，VEGF與其受體VEGFR結(jié)合，激活下游效應(yīng)分子誘發(fā)侵襲性運(yùn)動行為，促進(jìn)血管新生[2]。堿性成纖維生長因子(bFGF)是一種強(qiáng)效血管擴(kuò)張劑，能特異性擴(kuò)張梗死灶周圍血管，增加局部供血加速成纖維細(xì)胞增殖，最終促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活和增殖[3]。

中藥黃芪性甘溫,歸脾、肺兩經(jīng)，具有有補(bǔ)氣固表、托毒排膿、利尿生肌功效，其主要成分黃芪多糖具有提高免疫力、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[4]，但是其在神經(jīng)系統(tǒng)中的具體作用機(jī)制尚未明確。本研究通過觀察黃芪多糖對LPS誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并通過檢測對白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、VEGF和bFGF的影響探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物、細(xì)胞、試劑 黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)：上海吉至生化科技有限公司。地塞米松(DEX)：上海吉至生化科技有限公司。人血管內(nèi)皮細(xì)胞(human vascular endothelial cells，HUVECs)細(xì)胞：武漢大學(xué)細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清：美國Gibco公司；脂多糖(LPS)：美國CST公司；Annexin V-FITC/PI apoptosis kit：中國聯(lián)科生物公司；一氧化氮(NO)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究公司。TRIZOL：碧云天生物公司；引物：英濰捷基生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；PrimeScriptTM RT reagent kit、TB Green?Premix Ex TaqTMII：Takara生物公司；IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF ELISA試劑盒：美國Signalway Antibody公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 New Classic ME精密分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國Eppendorf公司；ABI PrismTM 7500熒光定量PCR儀：美國Thermo life公司；TGL-16E高速冷凍離心機(jī)：中國博科公司；ProFlex PCR擴(kuò)增儀、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Attune CytPix成像型流式細(xì)胞儀：美國Thermo Fisher公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 HUVECs用含10%FBS DMEM培養(yǎng)基于5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HUVECs細(xì)胞，分為正常組(NC)，模型組(LPS 1 mg/L)，給藥組加入各濃度的APS，陽性藥對照組加入地塞米松(DEX，3.92 mg/L)。

2.2 CCK8檢測HUVECs增殖活力 HUVECs以5 000個/孔種于96孔板中，12 h后去除上清加入終濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L的APS培養(yǎng)24 h加入CCK8孵育30 min，450 nm波長酶標(biāo)儀檢測各孔光密度(OD)值。全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，取平均值。

2.3 分光光度法檢測細(xì)胞上清液NO含量和LDH、SOD活性 將HUVECs細(xì)胞按照2×105個/孔密度種于6孔板中，在條件為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，正常組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，除正常組外，各組均加入LPS(1 mg/L)刺激24 h，APS組加入APS(8 mg/L)作用24 h，陽性藥對照組加入DEX(3.92 mg/L)作用24 h，收集細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒說明書操作。全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，取平均值。

2.4 RT-PCR檢測細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β、VEGF和bFGF mRNA表達(dá) 取2.3 培養(yǎng)各組HUVECs，根據(jù)試劑盒說明書提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄cDNA根據(jù)TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。Gene Bank數(shù)據(jù)庫中檢索引物,交由英濰捷基生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列見表1。PCR擴(kuò)增按照試劑盒說明書操作。計(jì)算結(jié)果用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化目的基因的相對表達(dá)，通過 2-ΔΔCt定量目的基因。

2.5 ELISA檢測細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β、VEGF和bFGF的水平 將HUVECs細(xì)胞按照5×104個/孔密度種于12孔板中，在條件為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，細(xì)胞造模給藥方法參照2.1，收集細(xì)胞，加入PBS超聲裂解，通過4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，收集細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒說明書操作細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β、VEGF和bFGF的水平。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將HUVECs細(xì)胞按照1×105個/孔密度種于6孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，各組細(xì)胞按2.3給藥培養(yǎng)。給藥結(jié)束后收集細(xì)胞，HUVECs用預(yù)冷PBS離心洗滌，收集10×105個細(xì)胞，用PBS稀釋 5×Binding Buffer至1×工作液，取1×Binding Buffer 500μL重懸細(xì)胞，每管加入5μL Annexin V-FITC 和10μL PI，輕柔混勻后室溫避光孵育5 min后，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

表1 PCR引物序列

3 結(jié)果

3.1 APS對HUVECs細(xì)胞增殖活力的影響 不同濃度的APS作用于HUVECs細(xì)胞，從2.0 mg/L濃度開始對HUVECs細(xì)胞有不同的促增殖作用，增殖率呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，其中8.0 mg/L的APS對HUVECs細(xì)胞增殖作用最明顯(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表2 不同濃度APS處理后HUVECs細(xì)胞活力比較

3.2 APS對LPS誘導(dǎo)HUVECs損傷模型細(xì)胞活力的影響 與正常組比較，LPS(1 mg/L)單獨(dú)作用HUVECs細(xì)胞時可抑制APS活力，LPS(1 mg/L)聯(lián)合各濃度的APS作用于HUVECs細(xì)胞后，APS濃度在4～32 mg/L對HUVECs細(xì)胞具有明顯促進(jìn)增殖作用(P<0.05)，其中8.0 mg/L的APS對HUVECs細(xì)胞增殖作用影響明顯；因此，后續(xù)采用8 mg/L的APS作為給藥濃度。結(jié)果見表3。

表3 不同濃度APS對LPS誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞活力的影響

3.3 APS對LPS誘導(dǎo)HUVECs模型氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 結(jié)果見表4。

表4 各組HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO含量和LDH、SOD活性比較

3.4 APS對LPS誘導(dǎo)HUVECs模型IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF mRNA表達(dá)的影響 結(jié)果見表5。

表5 各組HUVECs IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF mRNA表達(dá)的比較

3.5 APS對LPS誘導(dǎo)HUVECs模型IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF 含量的影響 結(jié)果見表6。

表6 各組HUVECs培養(yǎng)上清液IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF含量比較

3.6 APS對LPS誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響 結(jié)果見表7。

表7 各組HUVECs凋亡率的比較

4 討論

腦梗死又稱為缺血性卒中，中醫(yī)又名卒中或中風(fēng)，是由于局部腦組織血液供應(yīng)障礙，致腦組織缺血缺氧性壞死[5]。腦組織局部缺血，腦血管循環(huán)障礙，引起炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損[7]。本研究采用LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的的體外模型，探討黃芪多糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎及促進(jìn)新生血管生成的機(jī)制。

IL-6、IL-1β的產(chǎn)生可以反映炎癥程度，也可加劇炎癥反應(yīng)[7-8]。有研究表明，腦卒中的病人血清及實(shí)驗(yàn)動物的血管內(nèi)皮細(xì)胞中IL-6、IL-1β明顯上調(diào)[9]。本研究結(jié)果提示LPS刺激使血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、IL-1β明顯上調(diào)，而經(jīng)黃芪多糖作用后IL-6、IL-1β明顯下調(diào)。

體內(nèi)氧化應(yīng)激是指氧化與抗氧化作用失衡，最后會導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇[10]。在炎癥環(huán)境下，NO、LDH可持續(xù)上升，形成細(xì)胞毒性，直至底物耗竭或細(xì)胞死亡[11]。SOD作為一種抗氧化酶在動物體內(nèi)普遍存在，可以清除細(xì)胞生命活動中產(chǎn)生的超氧陰離子，修復(fù)氧化引起的損傷，對細(xì)胞起保護(hù)作用[12]。本研究表明，在LPS誘導(dǎo)的體外血管內(nèi)皮細(xì)損傷模型中，氧化應(yīng)激指標(biāo)NO、LDH表達(dá)明顯上調(diào)，SOD表達(dá)則明顯下調(diào)。APS組氧化應(yīng)激指標(biāo)NO、LDH出現(xiàn)一定程度下調(diào)，SOD表達(dá)則呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。提示黃芪多糖可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激指標(biāo)NO、LDH、SOD表達(dá)而起到減輕細(xì)胞氧化作用。

血管內(nèi)皮生長因子VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(PGF)[3]。在內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGF與其受體VEGFR結(jié)合后啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活下游信號分子參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、生存，而內(nèi)皮細(xì)胞的生長、遷移在血管新生、血管脈絡(luò)形成中起著關(guān)鍵的作用，對組織修復(fù)具有重要作用[13]。bFGF與細(xì)胞膜上的成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFRs)結(jié)合后具有生物學(xué)效應(yīng)。作為一種氨酸激酶受體，F(xiàn)GFRs的亞基包括FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4[14-15]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中，bFGF可激活其亞基，起到促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和保護(hù)血腦屏障等作用[16]。在本研究中，LPS誘導(dǎo)的體外血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，LPS組中VEGF、bFGF表達(dá)明顯下調(diào)，APS組VEGF、bFGF表達(dá)則呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)LPS組細(xì)胞凋亡率明顯上調(diào)，APS組細(xì)胞凋亡率明顯回落。提示APS可能通過調(diào)節(jié)VEGF、bFGF而達(dá)到促進(jìn)血管內(nèi)皮新生、修復(fù)神經(jīng)功能的作用。

綜上所述，APS可減少LPS誘導(dǎo)HUVECs炎癥因子的過度分泌，同時在一定程度上調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡；APS通過抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管新生，從而達(dá)到修復(fù)神經(jīng)損傷的作用，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。