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      基于肺胃同治法探討肅肺和胃湯對(duì)反流性胃肺疾病大鼠肺胃組織PKA、cAMP、SP及TRPV1蛋白表達(dá)的影響

      2023-01-12 12:13:30崔金瑜汝觸會(huì)陳愛(ài)鳳晏露寧韓佳穎
      中國(guó)中醫(yī)藥科技 2023年1期
      關(guān)鍵詞:反流孵育肺泡

      崔金瑜,汝觸會(huì),陳愛(ài)鳳,陳 曄,晏露寧,韓佳穎,何 飛

      (1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科·浙江 杭州 310003;2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科·浙江 杭州 310005)

      臟腑相關(guān)理論是中醫(yī)藏象學(xué)說(shuō)的重要內(nèi)容,其在肺系疾病中應(yīng)用尤為突出[1],肺胃同治、肺腸同治等一系列臟腑同治方法應(yīng)用廣泛。肺胃在人體生命活動(dòng)中有重要作用,肺胃相關(guān)理論已廣泛應(yīng)用于臨床,采用肺胃同治法治療胃食管反流性肺系疾病的臨床實(shí)踐行之有效[2-4],但其作用機(jī)制尚不完全明確,需要進(jìn)一步深入闡釋其內(nèi)在的本質(zhì)聯(lián)系。胃食管返流病機(jī)為胃失和降,肺氣上逆,治以肅肺和胃降逆, 肅肺和胃湯是本院呼吸科中藥協(xié)定方,治療胃食管反流性咳嗽具有一定療效。在前期研究中,筆者發(fā)現(xiàn)在反流性胃食管肺黏膜慢性炎癥與大鼠模型肺胃組織P 物質(zhì)(SP)表達(dá)呈相關(guān)性,SP可能是中醫(yī)肺胃相關(guān)理論的物質(zhì)基礎(chǔ),但缺乏進(jìn)一步的分子機(jī)制研究[5]。本研究觀察肅肺和胃湯對(duì)反流性胃肺疾病大鼠肺與胃組織 PKA、 cAMP、 SP 表達(dá)及肺組織磷酸化 PKA、TRPV1 表達(dá)的影響,進(jìn)一步研究肺胃同治法治療胃食管反流性肺系疾病的作用機(jī)制。

      1 材料

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性健康成年SD大鼠30只,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,合格證編號(hào):20170005028404,許可證編號(hào):SCXK(滬)2017-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

      1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 肅肺和胃湯(旋復(fù)花、蘇子、半夏、黃芩、干姜、黨參、黃連、大棗、甘草)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院中藥制劑室制成流浸膏,生藥含量1 g/mL,飲片采購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司。雷尼替丁膠囊:瑞陽(yáng)制藥有限公司,藥品批號(hào):19061902,規(guī)格:150 mg/粒。DAB kit:MDL公司; Anti-PKA beta(catalytic subunit)抗體:美國(guó)Abcam公司;Anti-cAMP蛋白Kinase Catalytic subunit抗體:美國(guó)Abcam公司;Anti-Substance P抗體:美國(guó)Abcam公司;Anti-GAPDH抗體:美國(guó)Abcam公司;PKA alpha/beta/gamma CAT 抗體:美國(guó)Affinity公司。

      1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 ASP200S全自動(dòng)脫水機(jī):德國(guó)Leica公司;EPS300電泳儀:中國(guó)天能公司;VE180C電泳槽:中國(guó)天能公司;VE186轉(zhuǎn)膜儀:中國(guó)天能公司;G1150 H加熱石蠟包埋系統(tǒng):德國(guó)Leica公司;GL-5250A加熱磁力攪拌器:KyLin-Bell Lab Instruments公司;DM3000正置熒光顯微鏡:德國(guó)Leica公司;NIKON DS-U3成像系統(tǒng):日本尼康公司。

      2 實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 動(dòng)物分組及造模 將30只大鼠隨機(jī)分為5組,即正常對(duì)照組、模型組、中藥組、西藥組、中西醫(yī)結(jié)合組,每組6只。采用慢性食管內(nèi)灌注鹽酸(含蛋白酶)方法建立反流性胃肺黏膜慢性炎癥大鼠模型[6]。將2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔麻醉大鼠,經(jīng)口插入胃管至食管中、下段,除正常對(duì)照組外,以8滴/min的速率緩慢灌注0.1 mmol/L鹽酸(含0.5%胃蛋白酶)溶液,每次20 min,每天1次,連續(xù)14 d。正常對(duì)照組用PBS液代替鹽酸,方法與模型組相同。中藥組和西藥組從造模第15天開(kāi)始分別予肅肺和胃湯流浸膏(6.7 g/kg)和雷尼替丁(27 mg/kg),中西醫(yī)結(jié)合組同時(shí)給予同劑量肅肺和胃湯流浸膏和雷尼替丁藥物,正常對(duì)照組及胃食管反流模型組給予同劑量生理鹽水,直到第21天。給藥途徑均采用灌胃,每日1次。

      2.2 標(biāo)本采集 腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉大鼠,心臟穿刺放血處死動(dòng)物。立即在冰塊上取出肺及胃食管組織,分離右下肺及胃竇部(0.5 cm×1cm),取兩者其中部分組織作病理學(xué)檢查。兩者的剩余部分放入容器保存于-80 ℃冰箱備用。

      2.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定

      2.3.1 光鏡下觀察肺、胃組織病理學(xué)變化 對(duì)標(biāo)本取材、脫水、包埋和切片后,進(jìn)行HE染色,通過(guò)顯微鏡拍照(100倍和200倍),采集分析樣本相關(guān)部位,并進(jìn)行HE半定量分析。肺部炎癥病理分級(jí)采取半定量方法評(píng)估其炎癥嚴(yán)重度[7],0分:無(wú)炎癥細(xì)胞;1分:少許炎癥細(xì)胞,肺泡壁正常;2分:炎癥細(xì)胞成環(huán)狀,層厚為1個(gè)細(xì)胞,肺泡壁輕度增厚,肺泡腔內(nèi)及較多巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞;3分:炎癥細(xì)胞成環(huán)狀,層厚為2~4個(gè)細(xì)胞,肺泡壁顯著增厚,肺泡內(nèi)可及30%~50%巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞;4分:炎癥細(xì)胞成環(huán)狀,層厚>4個(gè)細(xì)胞,肺泡壁顯著增厚,肺泡內(nèi)>50%巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);5分:完全實(shí)變。胃黏膜炎癥程度根據(jù)黏膜中慢性炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)分[8]。

      2.3.2 免疫組織化學(xué)方法測(cè)定大鼠肺、胃組織PKA、cAMP、SP表達(dá) 大鼠肺與胃組織分別放入10%中性甲醛中固定,取材包埋,石蠟包埋切片。經(jīng)抗原修復(fù)后行免疫雜交:切片經(jīng) PBS 沖洗,滴封閉液(5%BSA),室溫孵育30 min。用濾紙擦去封閉液,滴加適宜濃度的PKA、cAMP與SP一抗(均1∶50)置濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜,再用PBS 洗去一抗,用濾紙擦去PBS。滴加生物素化二抗,室溫孵育20 min,用PBS洗去二抗,用濾紙擦去PBS。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素,室溫孵育20 min,用PBS洗去,用濾紙擦去PBS。DAB顯色劑顯色,自來(lái)水沖洗。蘇木素復(fù)染,脫水,透明,中性樹(shù)膠封片。10×40倍顯微鏡選取各組大鼠肺與胃組織切片各6張,觀察陽(yáng)性反應(yīng)(鏡下棕黃色表現(xiàn)),測(cè)定平均光密度值(AOD)。

      2.3.3 Western blot檢測(cè)大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1蛋白表達(dá) 各取100 mg大鼠肺、胃組織樣品,剪碎,組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿,冰上靜置裂解15~30 min。將勻漿液離心,取上清,測(cè)濃度。BCA法測(cè)出濃度后,進(jìn)行蛋白變性,沸水煮 5 min,室溫冷卻,-20 ℃保存。進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,取出PVDF膜并作好標(biāo)記,用TBST洗膜。免疫印跡:將PVDF膜放入孵育盒中,加入含5%脫脂奶粉的封閉液,搖床振蕩1.5~2 h進(jìn)行封閉;封閉結(jié)束后,用TBST洗膜,將膜放入含一抗稀釋液的孵育盒中,4 ℃搖床振蕩孵育過(guò)夜后取出,室溫振蕩30 min,吸棄一抗,TBST洗10 min×3次;用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗,室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1~2 h;二抗反應(yīng)結(jié)束后,回收二抗。然后用TBST洗膜5~10 min×3次。使用ECL化學(xué)發(fā)光儀顯影拍攝,保存圖像。用酶標(biāo)儀測(cè)定各標(biāo)本吸光度。

      3 結(jié)果

      3.1 各組大鼠肺、胃組織病理形態(tài)學(xué)變化 模型組大鼠肺組織可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),胃組織胃黏膜上皮出現(xiàn)胃黏膜下間質(zhì)水腫、黏膜下可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。各給藥組大鼠肺、胃組織病理?yè)p傷程度較模型組為輕。見(jiàn)圖1,表1。

      圖1 各組大鼠肺胃組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE,×200)

      表1 各組大鼠肺、胃組織炎癥病理半定量積分比較分)

      3.2 各組大鼠肺、胃組織PKA、cAMP與SP表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖2~圖4,表2。

      圖2 各組大鼠肺、胃組織PKA表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

      圖3 各組大鼠肺、胃組織cAMP表達(dá)的免疫組化接測(cè)結(jié)果(×400)

      圖4 各組大鼠肺、胃組織SP表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

      表2 各組大鼠肺、胃組織PKA、cAMP、SP表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果比較值)

      3.3 各組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖5。

      注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01(動(dòng)物數(shù):6 只)圖5 各組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1蛋白表達(dá)的Western Blot檢測(cè)結(jié)果及比較

      與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1的蛋白表達(dá)水平均極顯著升高(P<0.01);與模型組比較,中藥組、西藥組和中西醫(yī)結(jié)合組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01),其中,中西醫(yī)結(jié)合組蛋白降低程度最明顯。

      4 討論

      反流性胃肺疾病是指胃食管反流性疾病并發(fā)肺部病變,最常見(jiàn)的是胃食管反流性咳嗽。肺胃相關(guān)理論在此類疾病中有著重要體現(xiàn),前期研究表明SP可能是中醫(yī)肺胃相關(guān)理論的物質(zhì)基礎(chǔ)[5],為該理論提供了現(xiàn)代研究的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)中指出,蛋白激酶 A(PKA)、環(huán)腺苷酸(cAMP)、P 物質(zhì)(SP)對(duì)上述信號(hào)傳遞可能存在主要的影響[9]。cAMP 由腺苷酸環(huán)化酶催化 ATP 反應(yīng)生成,而cAMP 對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能主要是通過(guò)激活依賴 cAMP 的 PKA 來(lái)實(shí)現(xiàn)。瞬時(shí)感受器電位香草酸受體 1(TRPV1)是瞬時(shí)受體感受器電位通道的成員之一。最早是由Caterina等[10]發(fā)現(xiàn),可被辣椒素激活,是一種非選擇性陽(yáng)離子通道,廣泛分布于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等。在呼吸系統(tǒng)主要分布于氣管、支氣管及肺泡的神經(jīng)軸突,咳嗽患者的TPRV1表達(dá)增加,TPRV1通道有可能成為治療咳嗽的有效靶向藥物[11]。筆者推測(cè)激活后的PKA/cAMP信號(hào)通路,促使下游靶蛋白磷酸化,使TRPV1通道開(kāi)放,Na+、Ca2+等陽(yáng)離子內(nèi)流增加,從而使肺胃組織釋放神經(jīng)肽類SP,可能介導(dǎo)了反流性胃肺疾病的病理生理過(guò)程。本課題研究發(fā)現(xiàn):與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠肺、胃組織PKA、cAMP與SP的蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.01),而Western blot檢測(cè)結(jié)果表明大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01或<0.05)。說(shuō)明PKA/cAMP信號(hào)通路及TRPV1、SP參與了反流性胃肺疾病病理生理過(guò)程。

      中醫(yī)認(rèn)為五臟六腑皆令人咳,非獨(dú)肺也,胃失和降,則肺不布津,水濕停胃而為痰為飲,又可上逆犯肺而為咳變。中醫(yī)從肺胃同治法入手治療胃食管反流咳嗽臨床取得了較好的臨床療效。肅肺和胃湯是本院科室制劑,由半夏瀉心湯化裁而來(lái),主要藥物有旋復(fù)花、蘇子、半夏、黃芩、干姜、黨參、黃連、大棗、甘草。方中蘇子降氣止咳;旋復(fù)花、半夏降逆止嘔、化痰散結(jié);干姜溫中散寒,其溫中之功可助半夏溫化寒痰;黃芩、黃連清熱燥濕,苦寒泄降,善清泄肺胃之熱;黨參、大棗健脾益氣,甘草調(diào)和諸藥。該方辛開(kāi)苦降,寒溫并用,肺胃同治。本研究結(jié)果表明:與模型組比較,中西醫(yī)結(jié)合組和西藥組大鼠肺組織PKA、cAMP與SP的蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05或P<0.01),中藥組、西藥組及中西醫(yī)結(jié)合組大鼠胃組織PKA、cAMP和SP蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05或P<0.01),中西醫(yī)結(jié)合組較中藥組PKA、cAMP和SP蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。中西醫(yī)結(jié)合組和西藥組3 個(gè)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí),與模型組比較,中藥組、西藥組和中西醫(yī)結(jié)合組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。提示各給藥組治療反流性胃肺疾病能更好地阻斷PKA/cAMP 信號(hào)通路,減少TRPV1和SP的激活釋放,從而降低咳嗽的敏感性。雖然中西醫(yī)結(jié)合組和西醫(yī)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但中西醫(yī)結(jié)合組各類指標(biāo)下降程度更明顯,后續(xù)研究過(guò)程中可適當(dāng)提高各組樣本量,同時(shí)分組過(guò)程中可增加西藥半量聯(lián)合中醫(yī)組,更能體現(xiàn)中醫(yī)增效作用及中西醫(yī)結(jié)合治療的優(yōu)勢(shì)。

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