俞 燕,鄭艷輝,田海軍
(1.南京中醫(yī)藥大學,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院,江蘇 南京 210001)
糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的慢性微血管并發(fā)癥之一,是一種慢性進行性腎臟疾病,最終將導致終末期腎損傷的發(fā)生[1]。在全球范圍內,DM的患病率約為9.3%,我國DM患者約1.16億,其中可能發(fā)展為DN的概率約為40%[2]。有研究[3]表明,我國DN的發(fā)病率逐年上升,現(xiàn)已成為慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)的最主要病因?,F(xiàn)代醫(yī)學方面,DN的治療措施主要有控制血壓及血糖、調節(jié)血脂、減少尿蛋白等[4],但臨床療效有限,且有一定的使用限制及不良反應,而中醫(yī)藥在腎臟疾病的治療方面有更加廣泛的應用范圍,極有可能成為更有效的治療手段,也是中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢。中草藥六月雪[Serissa serissoides (DC.) Druce,SSD]在臨床上可應用于多種腎臟病,包括慢性腎功能衰竭、慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病、腎病綜合征等。本研究以Sprague-Dawley(SD)大鼠建立DN模型,探討六月雪對糖尿病腎病的作用和可能機制。
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物:雄性SD大鼠30只,SPF級,4~6周齡,購自南通大學[許可證號:SCXK(蘇)2019-0001]。
1.1.2 實驗藥物:中藥六月雪,購自南京市中醫(yī)院中草藥房,制成0.27 g/ml的藥液后濃縮10倍。鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司)。
1.1.3 主要實驗試劑與儀器:鹽酸、過碘酸、二甲苯、醋酸鈉、無水乙醇、中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)。蘇木素染液、0.5%伊紅液、Schiff氏液、哈瑞蘇木精(南京恩晶生物科技有限公司)。尿蛋白定量測試盒、肌酐(Scr)測試盒、尿素氮(BUN)測試盒(南京建成生物工程研究所)。HEA-230血糖儀、血糖試紙(日本OMRON公司)。5415R型離心機(德國 Eppendorf公司)。日立 OLYMPUS生化分析儀(南京三和公司)。Multiskan Mk酶標儀(美國Thermo公司)。生物組織自動脫水機(Leica ASP6025,上海三威醫(yī)療設備有限公司)。病理取材臺(博科QCT-1500) 、烤片機(博科BH-1)(濟南來寶醫(yī)療器械有限公司)。組織包埋機(LEICA Arcadia)、石蠟切片機(LEICA RM22235)、多功能染色機(Autostainer XL Leica)(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司)。顯微鏡(ZEISS AX110,廣州市高明生物技術有限公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 大鼠分組與模型制備:將30只4~6周齡、雄性、健康SD大鼠隨機分成三組,分別為正常組、模型組和六月雪組,每組10只。按55 mg/kg的劑量在大鼠左側腹腔一次性注射1%STZ溶液,正常組大鼠則用等劑量的0.9%氯化鈉溶液以同種方法進行腹腔注射。大鼠進行STZ注射后,連續(xù)測3 d隨機血糖,血糖>16.7 mmol/L為 DM 模型制備成功。造模成功后的DM模型大鼠喂養(yǎng)1周,測隨機血糖>16.7 mmol/L,尿量為正常組的1.5倍及以上,24 h尿蛋白定量(24 h-UP)為正常組的1.5倍及以上,則為DN模型制備成功。
1.2.2 給藥方法:以灌胃的方式進行給藥,給藥體積為0.1 ml/10 g,每天給藥1次,連續(xù)給藥6周。給藥期間,給予各組大鼠標準飲食,定期更換墊料及消毒籠具。
1.2.3 生化指標檢測:藥物干預6周后,檢測各組大鼠的空腹血糖(FBG),收集24 h尿液,檢測24 h尿蛋白(24 h-UP)含量。大鼠脫頸椎處死,腹主動脈取血,離心后收集血清,使用生化分析儀測定血清中BUN及Scr的水平。
1.2.4 腎臟病理組織觀察:大鼠處死后,取兩側腎臟,去除被膜,0.9%氯化鈉溶液灌洗腎臟血管,清除殘留血液,濾紙干燥。取一半腎組織,經(jīng)固定、脫水、包埋、切片等步驟制作組織切片,進行HE染色和PAS染色,光鏡下觀察腎組織病理,并進行病理評分[5],將分數(shù)累加,計算每組每只動物的均分。
1.2.5 大鼠腎臟組織TGF-β1、IL-6表達水平測定:取另一半腎組織,-20 ℃低溫保存,采用ELISA法檢測腎組織中轉化生長因子-β1(Transforming growth factor β1,TGF-β1)及炎性細胞因子白介素-6 (Interleukin-6,IL-6)的水平。
1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,符合正態(tài)分布和方差齊性的,采用方差分析,不符合正態(tài)分布和方差齊性則采用非參數(shù)秩和檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 六月雪對各組大鼠FBG及腎功能的影響 與正常組比較,模型組大鼠FBG、Scr、BUN及24 h-UP升高 (P<0.01);與模型組比較,六月雪組大鼠FBG、Scr、BUN及24 h-UP有所降低 (P<0.01),見表1。
表1 六月雪對各組大鼠FBG、腎功能及尿蛋白的影響
2.2 六月雪對各組大鼠腎臟病理組織形態(tài)的影響
2.2.1 HE染色結果:①正常組:腎小球內細胞數(shù)無增多,毛細血管無淤血,系膜基質無增生,球囊腔明顯可見,腎小管上皮細胞無明顯變性、壞死、管型,間質無炎細胞浸潤,無結締組織增生。②模型組:腎小球內細胞數(shù)增多,毛細血管擴張,系膜基質增生,球囊腔擴大,腎小管上皮細胞重度變性壞死,腔增大,腔內見大量透明管型,間質少量炎性細胞浸潤,無纖維組織增生。③六月雪組:腎臟組織形態(tài)學改變基本同模型組,間質有少量單個核炎細胞浸潤,病變程度輕于模型組。各組病理評分的比較:與正常組比較,模型組的病理評分顯著升高(P<0.01);與模型組比較,六月雪組的病理評分顯著降低(P<0.01)。見圖1(表2)。
圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學改變(HE染色,×400;PAS染色,×400)
表2 六月雪對各組大鼠腎臟組織病理評分的影響(分)
2.2.2 PAS染色結果:①正常組:腎小球毛細血管基底膜,系膜基質和腎小管基底膜著玫瑰紅色,基底膜未見增厚,系膜基質未見增多。②模型組:腎小球毛細血管基底膜,系膜基質和腎小管基底膜著玫瑰紅色,基底膜增厚,系膜基質增多。③六月雪組:腎小球毛細血管基底膜,系膜基質和腎小管基底膜著玫瑰紅色,基底膜增厚,系膜基質增多。見圖1。
綜上,結合各組病理組織形態(tài)的差異和病理評分的變化,認為六月雪對糖尿病腎病大鼠的腎臟損傷具有一定保護和修復作用。
2.3 六月雪對糖尿病腎病大鼠TGF-β1及IL-6含量的影響 見表3。與正常組比較,模型組TGF-β1及IL-6水平均顯著提高(P<0.01);與模型組比較,六月雪組TGF-β1及IL-6水平均有所降低(P<0.05)。
表3 六月雪對糖尿病腎病大鼠TGF-β1及IL-6表達水平的影響
糖尿病腎病是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥,臨床上常見且發(fā)病率逐年增高,與糖尿病相關的腎小球損傷和蛋白尿導致了腎小管間質病變,常見持續(xù)性蛋白尿、水腫、高血壓、腎功能損害等癥狀,最終可發(fā)展為終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)[6],預后較差。早期DN的主要病理表現(xiàn)是以腎小球肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚以及系膜區(qū)細胞外基質的進行性積聚為特征,后期則表現(xiàn)為腎小球及腎小管間質纖維化[7]。
DN的致病機制是復雜且多樣的,涉及多種途徑和介質,氧化應激是DN重要的發(fā)病機制之一。高血糖狀態(tài)會導致活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和氧化自由基的產(chǎn)生增加,而ROS 的增加又會引發(fā)炎癥、血管內皮異常、TGF-β1表達增加,從而誘導腎纖維化的發(fā)生[8]。TGF-β1是一種多功能細胞因子,參與了DN的發(fā)病與發(fā)展[9]。TGF-β的表達上調可能是發(fā)生腎小球硬化及腎纖維化的重要因素[10-11],它主要是通過磷酸化和激活Smad2和Smad3,介導了腎小球和小管間質纖維化[12]。另外,TGF-β促進了腎細胞及成纖維細胞外基質蛋白分子的合成,細胞外基質池不斷積聚,最終導致腎小球硬化[11]。江丹等[13]研究發(fā)現(xiàn),減少TGF-β1的mRNA及蛋白表達,可改善DM大鼠的早期腎臟病理改變,減輕腎臟損害,保護腎功能。段穎等[14]通過動物實驗得出,腎組織中TGF-β1蛋白表達的下調能夠改善db/db小鼠糖尿病腎病的腎臟纖維化,從而達到保護腎臟的目的。
炎癥反應在DN的疾病演變中起著至關重要的作用,炎癥可改變組織穩(wěn)態(tài),刺激多種細胞炎癥因子的釋放,這些細胞因子更促進了炎癥免疫反應的進展[15-16]。IL-6是機體的免疫炎癥反應的重要環(huán)節(jié),與腎臟損傷關系密切。相關研究[17]表明,腎小球基底膜增厚、腎小球系膜細胞增殖、腎小球上皮細胞通透性異常增高及間質纖維化均與IL-6有關。有臨床研究發(fā)現(xiàn),DN患者腎組織中有IL-6相關mRNA的表達,在系膜增生區(qū)和腎小管萎縮區(qū)最為明顯,這證實了IL-6與DN的系膜增生和間質損傷程度有關[18]。高大紅[19]對服用血府逐瘀膠囊的糖尿病腎病患者進行觀察,發(fā)現(xiàn)治療組IL-6、TGF-β1等炎癥因子水平明顯降低,患者的實驗室指標有改善,臨床癥狀也得到緩解。
根據(jù)DN的疾病特點,可將其歸屬于中醫(yī)學的 “腎消” “消渴腎病”“水腫”“癃閉”“關格”等范疇。中醫(yī)學認為,DN由消渴病發(fā)展而來,病性為本虛標實、虛實夾雜,大多以消渴之陰虛燥熱為基礎,隨疾病進展,累及到脾腎,致使脾失健運,腎失氣化,氣血不足,濕濁內生,進而產(chǎn)生血瘀、濁毒、濕熱等病理產(chǎn)物,并使病情進一步加重[20]。
六月雪是茜草科植物六月雪的干燥全草[21],有白馬骨、滿天星等別稱,《本草拾遺》中記載:味苦、微甘,性涼,具有健脾除濕、清熱解毒、消腫止痛、涼血活血等功效[22]。針對DN的病因病機,六月雪既可活血通絡消癥,又可引導濕濁之邪從小便而解,清利濕熱、化濁解毒?,F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),六月雪有抗氧化、抗菌解熱、抗肝炎、抗腫瘤、保護胃黏膜等作用[23]。孫響波等[24]通過總結后發(fā)現(xiàn),六月雪有降低Scr、BUN、減少蛋白尿的作用。齊墩果酸是六月雪的有效成分,是一種五環(huán)三萜類化合物。有研究表明齊墩果酸可能通過調節(jié)TGF-β/Smad途徑抑制了腎臟纖維化,達到保護腎臟的作用。另一種有效成分熊果酸,也被證明有保護腎功能、降低尿蛋白、減輕腎損害等作用[26]。但是六月雪對DN的作用及可能機制仍需進一步探索。
本研究以STZ誘導DN大鼠模型的建立,觀察六月雪對DN大鼠的多項指標及腎臟組織的影響。采用STZ腹腔注射SD大鼠后,大鼠出現(xiàn)血糖升高、蛋白尿及腎功能異常,這些表現(xiàn)是DN的典型臨床癥狀,光鏡下觀察腎臟病理切片示腎小球毛細血管基底膜增厚等病理變化,依據(jù)Mogensen標準,該病理表現(xiàn)符合DN早期診斷,表明造模成功,進行后續(xù)實驗步驟。藥物干預結束后,與模型組比較,六月雪組大鼠的FBG、Scr、BUN及24 h-UP均得到改善,腎組織病變程度也有所減輕,病理評分下降,腎臟組織中TGF-β1及IL-6的水平降低。因此,本實驗證實了六月雪對DN的腎臟損傷有保護作用,并推測,六月雪可能通過抑制TGF-β1及IL-6的表達,減輕腎臟炎癥反應及氧化應激,抑制腎臟的基底膜增厚、系膜增生及纖維化等病理改變,進而發(fā)揮對腎臟的保護作用,改善腎功能,減少蛋白尿,并在一定程度上可修復腎組織,延緩DN的持續(xù)發(fā)展。
本次實驗結果為六月雪應用于腎臟病的臨床治療提供了一定依據(jù),但也存在一些不足,一是在臨床使用上,六月雪常與多種藥物配伍成方,而本實驗以六月雪單味藥進行研究,較為局限。二是本次實驗選用的指標有限,未對六月雪藥理作用的信號通路進行更深入的研究。這些不足需要進一步的實驗以彌補。
綜上所述,六月雪對DN模型大鼠的腎臟有保護作用,能夠改善腎功能、減少蛋白尿,減輕腎臟的病理改變,其作用機制可能與腎組織中TGF-β1、IL-6表達的降低相關,從而抑制了腎臟炎癥反應及氧化應激,達到了保護腎臟的作用,延緩DN進展至ESRD。