擬南芥酪氨酸蛋白磷酸酶PTP135基因克隆及功能分析

劉靜

擬南芥酪氨酸蛋白磷酸酶基因克隆及功能分析

劉靜

廣東職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 廣東 佛山 528041

擬南芥T-DNA插入突變體ptp135具有與phyB突變體相似的特征，萌發(fā)時下胚軸伸長、子葉張開角度小、展開慢，后期表現(xiàn)為開花早、葉色淺、葉柄長、葉面積增大。采用PCR法從擬南芥葉片中克隆啟動子基因，啟動子連接到載體pCAMBIA1391，構(gòu)建植物雙元表達載體pCAMBIA1391-135p，構(gòu)建的載體經(jīng)過鑒定后，運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的沾花法將啟動子轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，用潮霉素篩選轉(zhuǎn)化陽性株，對陽性株進行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果表明基因定位在維管束、柱頭和花絲。采用PCR方法從擬南芥葉片中克隆基因，連接到載體pEZS-NL，構(gòu)建瞬時表達載體pEZS-NL-135e，采用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮，結(jié)果表明編碼的蛋白定位在細胞核和細胞膜。擬南芥野生型、ptp135和phyB，待即開花時取樣，做光周期特異性基因、的RT-PCR表達分析，結(jié)果表明和基因在ptp135突變體中表達時間延長，表達量增加，證明可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控和，參與植物開花調(diào)控途徑，作用位點在上游。

擬南芥; 酪氨酸蛋白磷酸酶; 基因克隆

高等植物的生活史包括種子萌發(fā)、營養(yǎng)生長、開花等一系列發(fā)育階段，其中開花過程直接影響作物生育期，與作物產(chǎn)量品質(zhì)密切相關(guān)，該領(lǐng)域相關(guān)研究對農(nóng)業(yè)和園藝生產(chǎn)具有重要的意義。

高等植物花的形成是由一系列環(huán)境和內(nèi)部因子調(diào)控的。20世紀(jì)90年代，擬南芥作為模式植物得到了廣泛研究，通過擬南芥早花或晚花突變體，鑒定分離出相關(guān)開花時程基因。相關(guān)研究表明調(diào)控擬南芥開花時程的途徑至少有4種，即光周期途徑，春化途徑，自主途徑和赤霉素途徑，這四條途徑通過，，，，等調(diào)控開花的基因相互作用而聯(lián)系在一起。

影響高等植物開花最重要的環(huán)境因子之一是光周期（Photoperiod），植物通過光受體感受光周期信號后，作用于生物鐘，調(diào)控某些促進開花基因的表達，降解某些抑制開花因子的表達。光周期對高等植物開花的調(diào)控是通過相關(guān)基因間的相互作用來實現(xiàn)的，光敏色素(Phytochrome, Phy)是光周期反應(yīng)中一種重要的光受體，擬南芥中包含有4～5個不同生理功能的光敏色素基因，分別為，其中、在光周期途徑種發(fā)揮不同的功能，在一定條件下促進開花，而則抑制開花。光受體接收光周期信號后，由光信號傳導(dǎo)分子將光信號傳遞到內(nèi)源的控時器——“生物鐘”，生物鐘將檢測的光周期信號傳輸給主要信號分子，進而誘導(dǎo)其靶位基因的表達，從而實現(xiàn)了光周期對開花時間的調(diào)控。

實驗中發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體ptp135（T-DNA插入突變體）表現(xiàn)為早花，ptp135具有與phyB突變體相似的形態(tài)特征，編碼酪氨酸蛋白磷酸酶，PTPases作為一種開關(guān)調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育等很多方面發(fā)揮著重要的作用，推測可能參與開花信息傳遞。本研究就是在此基礎(chǔ)上，通過分子操縱等多種手段，深入探討基因的克隆及表達特性分析，揭示其信息傳遞的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料 擬南芥野生型種子，ptp135T-DNA插入突變體種子。在室溫18～25 ℃，相對濕度80%，光照時間12 h條件下，將不同種類的擬南芥種子直接播種于營養(yǎng)土、蛭石和沙子（2:1:1）的混合基質(zhì)中。

1.1.2 質(zhì)粒及菌株 pCAMBIA1391，pCAMBIA1300-Super載體，pEZS-NL載體，pMD18-T simple載體，農(nóng)桿菌菌株GV3101，大腸桿菌DH5α菌株由本實驗室保存。

1.1.3 酶及試劑 所用的各種Taq酶，限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶，Rnase抑制劑購于Promega公司，植物總RNA提取試劑盒購于OMEGA公司。潮霉素、利福平等抗生素購自鼎國生物公司。其他無機鹽類試劑均為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 突變體ptp135表型觀察分析

1.2.1 發(fā)育形態(tài)分析 將ptp135phyB和野生型擬南芥的種子，分別表面滅菌，播種于1/2MS培養(yǎng)基上（1/2MS＋1％蔗糖＋0.7％瓊脂），待種子萌發(fā)后觀察植株發(fā)育形態(tài)。

1.2.2 開花時間分析 將ptp135phyB和野生型擬南芥的種子，分別直接播種于營養(yǎng)土：蛭石：砂土（2:1:1）的基質(zhì)中，短日照（12 h），觀察植株開花時間。

1.3 PTP135基因定位分析

1.3.1 DNA提取 取野生型擬南芥新鮮葉片100 mg，液氮中研磨成粉末，CTAB法小提擬南芥基因組DNA。

1.3.2 基因克隆 以野生型擬南芥基因組DNA為模板，PCR擴增啟動子基因序列，上游引物引入BamHI酶切位點，下游引物引入NcoI酶切位點。PCR引物：5’－GCGGATCCAATGGGCAACGGTATGG－3’，5’－ATCCATGGGCTTCATCTCTGAATTGGGA－3’。PCR體系為：2.5 μL 10×buffer，0.5 μL dNTP，1 μL引物，0.5 μL DNA，0.25 μL LA Taq酶，加ddH2O至25 μL。PCR程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)次數(shù)30，72 ℃延伸7 min。

1.3.3∷GUS植物雙元表達載體構(gòu)建啟動子基因克隆片段電泳純化回收，連接pMD18T-Simple載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑選陽性克隆進行測序檢測。用限制性內(nèi)切酶BamHI和NcoI進行雙酶切pMD18T-Simple載體和pCAMBIA1391載體，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌,篩選出陽性克隆,得到啟動子啟動GUS基因的植物雙元表達載體∷GUS（pCAMBIA1391-135p）。

1.3.4 凍溶熱擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 把1 μL pCAMBIA1391-135p質(zhì)粒加入50 μL農(nóng)桿菌感受態(tài)菌液中，冰凍20～30 min，菌液液氮中冷凍1 min，然后37 ℃水浴融化，加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，28 ℃溫育4 h，6000 rpm離心5 min，剩余200 μL涂板（LB固體培養(yǎng)基加相應(yīng)抗生素）。

1.3.5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的沾花法轉(zhuǎn)化擬南芥植株 取分離單菌落置于含卡那霉素（50 μg/mL）、慶大霉素（40 μg/mL）、四環(huán)素（2 μg/mL）、利福平的10 mL LB液體培養(yǎng)基中，搖菌培養(yǎng)18 h。取搖好的菌液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到含有相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，收集菌體，用滲透緩沖液重懸，調(diào)節(jié)OD600＝0.8。當(dāng)野生型擬南芥的花序露白時，對生長狀態(tài)良好的植株進行農(nóng)桿菌侵染，并將侵染的植株密閉暗培養(yǎng)24 h，后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。共重復(fù)轉(zhuǎn)化3次，每隔6 d1次。

1.3.6 轉(zhuǎn)化陽性株的篩選 轉(zhuǎn)化后的擬南芥種子在1/2MS (+潮霉素50 μg/mL）培養(yǎng)基播種，4 ℃培養(yǎng)3 d，溫室條件繼續(xù)培養(yǎng)。種子萌發(fā)后，選擇2片綠色子葉、生長良好的轉(zhuǎn)基因陽性株，移栽至營養(yǎng)土、蛭石和沙子比例為2:1:1的混合基質(zhì)中，進行常規(guī)溫室管理。

1.3.7 GUS組織化學(xué)染色 配制新鮮染色液，取20 μL X-gluc（5 mg X-gluc溶于410 μL DMF），加入760 μL 0.05 mol·mL-1磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，10 μL 50 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]，10 μL 50 mmol·L-1K4[Fe(CN)6]，10 μL 0.5 mol·L-1EDTA，1 μL Triton X-100，200 μL甲醇。將材料放入染色液中染色，低齡小苗子不需加負壓，染色0.5 h；苗齡較大或成株需加負壓2 min，染色5～6 h。染色后用70%酒精脫色數(shù)小時，并在顯微鏡下觀察染色情況。

1.4 PTP135蛋白表達定位分析

1.4.1基因序列克隆 以野生型擬南芥基因組cDNA為模板，PCR擴增基因序列（全長631 bp），上游引物引入EcoRI酶切位點，下游引物引入SalI酶切位點。PCR引物：5’－ATGAATTCATGAAGCTTGTGGAGAAGACGAC－3’，5’－ATGTCGACCGCCTGATGGAACAAGAG－3’。PCR體系同上。PCR程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)30，72 ℃延伸7 min。

1.4.2 35S∷∷GFP瞬時表達載體構(gòu)建 載體構(gòu)建程序同上，基因序列連接到載體pEZS-NL，得到瞬時表達載體載體35S∷∷GFP（pEZS-NL-135e）。

1.4.3 基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮 取潔凈洋蔥內(nèi)表皮1 cm2，放置于1/2MS培養(yǎng)基上。用8.5 μL金粉懸浮液（60 mg金粉懸濁于1 mL無菌水中），3.5 μL 0.1 mol·L-1亞精胺，8.5 μL 2.5 mol·L-1CaCl2，1～5 μg DNA（pEZS-NL-135e），加10 μL無水乙醇，制備DNA－金粉復(fù)合體微粒載體。用DNA－金粉復(fù)合體微粒轟擊洋蔥表皮，在黑暗中培養(yǎng)20 h左右，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.5 突變體ptp135的基因表達分析

1.5.1 表達半定量 RT-PCR Plant RNA Kit提取擬南芥野生型總RNA，M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。具體方法為:1.3 μg RNA，加2 μL Oligo(dT)15，70 ℃變性5 min；之后加入5 μL M-MLVbuffer，1.25 μL dNTPMix，1 μL M-MLV，0.6 μLRNaseinhibitor，補充DEPC水至25 μL，37 ℃反應(yīng)1 h。PCR相關(guān)引物為克隆基因片段引物，PCR程序為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

1.5.2，光周期基因的表達分析 短日照（12 h）條件下種植擬南芥野生型、ptp135和phyB，待即開花時采集樣品，從早上8時到凌晨4時，每隔4 h取一次樣，上午8時(光照前1 h)、上午12時(光照前3 h)、下午16時(光照后7 h)、晚上午20時(光照后11 h)、凌晨24時（黑暗3 h），凌晨4時（黑暗7 h）采，采集擬南芥葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，做，基因的RT-PCR，檢測，的基因表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體ptp135表型觀察分析

2.1.1 發(fā)育形態(tài)分析 突變體ptp135萌發(fā)時呈現(xiàn)與phyB非常相似的形態(tài)特征，具體表現(xiàn)為下胚軸伸長、子葉展開慢、張開角度小（如圖1所示）。

圖1 擬南芥野生型，phyB，ptp135胚軸伸長比較

1: 野生型 2: phyB 3: ptp135

2.1.2 開花時間分析ptp135、phyB與野生型在12 h短日照下開花時間具有明顯差異 ptp135突變體發(fā)芽后約3～4周，蓮座葉數(shù)為8～9片時即抽苔開花（如圖2所示），ptp135開花時間與phyB相一致，遠遠早于野生型。

圖2 擬南芥野生型，phyB，ptp135開花時間的比較

1: 野生型 2: phyB3: ptp135

2.2 PTP135基因定位分析

2.2.1啟動子基因克隆 如圖3所示，以野生型擬南芥基因組DNA為模板，在2000 bp的位置上擴增出啟動子基因PTP135p目的條帶。

圖3 PTP135啟動子基因PCR擴增片段的電泳檢測

1.啟動子

2.2.2 植物雙元表達載體pCAMBIA1391-135p構(gòu)建 把PTP135p連接到表達載體pCAMBIA1391，酶切和PCR驗證結(jié)果如圖4所示，證明載體pCAMBIA1391-135p構(gòu)建成功。

圖4 酶切、PCR驗證pCAMBIA1391-135p

1. pCAMBIA1391-135p的酶切驗證 2. pCAMBIA1391-135p的PCR驗證

2.2.3 擬南芥的轉(zhuǎn)化和陽性株的篩選 構(gòu)建的pCAMBIA1391-135p載體采用沾花法用于野生型擬南芥的轉(zhuǎn)化?？剐院Y選結(jié)果如圖5所示，種子萌發(fā)后可以繼續(xù)生長，且葉子為綠色的是陽性株，每皿可篩選出3～10株陽性株。進一步對篩選植株株進行PCR鑒定，取生長期10 d左右的植株葉片，用玻片磨碎，加入100 μl ddH2O稀釋，取3 μL作為PCR擴增模板進行檢測。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的篩選

箭頭所指為轉(zhuǎn)基因陽性株

2.2.4基因定位分析 對轉(zhuǎn)啟動子基因的T3代陽性植株，分別在兩片子葉、四片真葉和花期時進行GUS染色。幼苗時整株進行染色；開花后對花序進行染色。染色如圖6所示，幼苗時期葉片、莖和根系維管束表現(xiàn)為藍色；花期花柱和花絲表現(xiàn)為藍色，表明基因定位在維管束和葉肉細胞，花柱以及花絲、花托。

圖6 轉(zhuǎn)PTP135啟動子植株的GUS染色

1. stage2整株; 2. stage2葉片; 3. stage4整株; 4.stage4根系局部; 5. stage13花序; 6. stage13雄蕊雌蕊; 7. stage13雄蕊; 8. stage13后期花序; 9. stage13后期雄蕊雌蕊

2.3 PTP135蛋白表達定位分析

2.3.1基因克隆 以野生型擬南芥基因組cDNA為模板，在600 bp左右的位置上擴增出基因序列PTP135e，如圖7所示。

圖7 PTP135基因PCR擴增片段的電泳檢測

1.基因

2.3.2 瞬時表達載體pEZS-NL-135e構(gòu)建 將克隆的基因連接到pEZS-NL載體，限制性內(nèi)切酶酶切和PCR方法驗證結(jié)果如圖8所示，證明載體pEZS-NL-135e構(gòu)建正確。

圖8 酶切、PCR驗證pEZS-NL-135e

1. pEZS-NL-135e的酶切驗證 2. pEZS-NL-135e的PCR驗證

2.3.3基因亞細胞定位分析 DNA（pEZS-NL-135e）－金粉復(fù)合體微粒，利用基因槍轟擊洋蔥表皮，暗培養(yǎng)后熒光顯微鏡下觀察，洋蔥細胞的細胞質(zhì)發(fā)出綠色熒光(如圖9所示)，說明基因編碼的蛋白定位在細胞核和細胞膜。

圖9 PTP135：GFP在細胞質(zhì)的特異分布

Fig.9Subcellular localization of：GFP

1. 20倍放大; 2. 20倍放大下細胞立體圖; 3. 60倍放大

2.4 突變體ptp135的基因表達分析

在光周期途徑中，基因在表達水平上受到的調(diào)控，基因的表達在光照下受到的抑制，而的靶基因基因相應(yīng)的受到的誘導(dǎo)。野生型中正常存在，使蛋白降解，phyB中由于的缺失，喪失了對調(diào)控的能力，致使蛋白過量表達，造成植株早開花。實驗檢測了野生型、ptp135和phyB中、基因的表達，實驗結(jié)果如圖10所示，植株中基因在光照開始前有表達，光照開始后表達量非常低，在光照7 h后有少量表達，而后表達量逐漸增加，黑暗條件下表達量最大。光照前1 h，照光3 h，照光7 h，照光11 h，黑暗3 h，表達量在ptp135、phyB突變體中強于野生型，基因的表達也呈現(xiàn)類似特征。實驗結(jié)果表明突變體ptp135中和表達時間延長，表達量增加，導(dǎo)致突變體植株早開花。證明可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控和，參與了植物開花調(diào)控途徑，作用位點在上游。

圖10 不同基因型擬南芥中CO、FT基因的表達分析

Fig.10Expression ofin different genotypes

1. 野生型; 2. ptp135; 4. phyB

A.光照前1 h; B.照光3 h; C.照光7 h; D.照光11 h; E.黑暗3 h; F.黑暗7 h

3 結(jié)論與討論

高等植物在進化發(fā)展過程中形成了一套光信號接受和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。擬南芥中重要的光受體參與了一系列重要的光形態(tài)建成反應(yīng)。在正常栽培條件下，缺失基因的phyB突變體植株，幼苗出現(xiàn)胚軸伸長，葉片變小變黃，展開緩慢等形態(tài)特征，成年植株表現(xiàn)出葉片葉柄伸長，葉片表面積增大，早開花等特征。有研究表明在光周期途徑中，植株中基因的轉(zhuǎn)錄豐度和蛋白的穩(wěn)定性最終決定了植株的開花時間。而蛋白的表達水平受到光照在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，這種調(diào)控主要通過，等光受體實現(xiàn)。和隱花色素在白天促進蛋白的穩(wěn)定，促進植物開花，而在清晨時被激活，抑制和隱花色素的活性，使蛋白降解，抑制植物開花。在不同條件下表達的差異，最終決定了植物開花時間的差異。

我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在短日照(12 h)條件下，ptp135突變體萌發(fā)時下胚軸伸長，葉柄伸長，葉片變小變黃，ptp135開花時間明顯早于野生型，出現(xiàn)了與phyB突變體相似的表型特征，表明基因可能參與了介導(dǎo)的光周期信號傳遞系統(tǒng)。

為了更好的研究的功能和作用機理，首先研究了的基因定位和蛋白定位。實驗結(jié)果證明基因定位在維管束，葉肉細胞，花柱和柱頭的連接處，花絲和花托，基因編碼的蛋白定位在細胞質(zhì)。

在光周期途徑中，及其直接作用基因已被廣泛認(rèn)同是擬南芥開花的特異性基因，野生型擬南芥中、基因的表達受光周期的影響呈現(xiàn)一定的規(guī)律。我們對ptp135突變體中的、基因表達進行分析，并與野生型擬南芥和phyB中進行比較，表明ptp135中和表達時間延長，表達量增加，ptp135中的缺失促進了植株，的表達，導(dǎo)致突變體植株早開花。這一結(jié)果初步證明可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控和，參與了植物開花調(diào)控途徑，作用位點在上游。

綜上所述，基因參與了光周期途徑，其作用位點是在的上游還是下游，是如何與起作用，是否與有相互作用，這些都需要進一步的分子生物學(xué)和蛋白相關(guān)的實驗來闡釋。

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Expression and Function Analysis onGene of Protein Tyrosine Phosphatase in

LIU Jing

528041,

The characteristics of ptp135 mutant of Arabidopsis thaliana was similar to phyB mutant. The young seeding had a higher hypocotyl, opening cotyledon with a smaller angle, and slower expansion. At the later stage, it showed early flowering, lighter leaf color. We cloned thepromoter gene from typeleaves by PCR. Thepromoter gene was connected to the vector pcambia1391, and the vector pcambia1391-135p was constructed. Then the vecter was transformed into wild type A. thaliana by Agrobacterium-mediated flower dipping method. The results showed that ptp135 gene was located in vascular bundle, stigma and filament. We cloned the PTP135 gene from Arabidopsis thaliana leaves by PCR. Thegene was connected to the vector pEZS-NL, and the vector pEZS-NL-135e was constructed and transformed into onion epidermis by particle bombardment. The results showed that the protein of ptp135 was localized in the nucleus and cell membrane. The RT-PCR results showed that the expression time ofandin ptp135 was longer and the expression level was more than in the wild. It was proved thatcould regulateandat the transcriptional level.worked in the flowering regulation pathway, and the action site was in the upstream ofgene.

; protein tyrosine phosphatase; gene cloning

Q943.2

A

1000-2324(2022)05-0803-08

2022-03-28

2022-04-10

廣東省2021年度教育科學(xué)規(guī)劃課題(2021GXJK144)

劉靜(1981-),女,碩士研究生,講師,研究方向:植物信號傳導(dǎo). E-mail:444875816@qq.com