Dickkopf相關蛋白3調控上皮細胞間質轉化相關蛋白表達對前列腺癌PC3細胞凋亡、遷移和侵襲的影響

蔣 焜，杜 洋，許立哲，寧金卓

(武漢大學人民醫(yī)院 泌尿外科,湖北 武漢 430060)

Dickkopf相關蛋白3(dickkopf 3,DKK3)是一種分泌性糖蛋白，屬DKK蛋白家族成員，其定位于染色體11p15.1上的長47.1kb的DKK3基因編碼，由350個氨基酸組成，分子量為38 000 ku，具有N端信號肽以及包含兩個被可變的接頭區(qū)分開保守的富含半胱氨酸結構域，分別是Cys-1和Cys-2[1]。目前DKK3已經被證實在人腎上腺皮質中表達，此外在部分動物腦(主要是嚙齒類)和成纖維細胞中亦有表達[2]。與此同時，DKK3被證實在人類多種腫瘤中差異化表達，大部分腫瘤為低表達，包括前列腺癌[3]、肝癌[4]、結腸癌[5]、胃癌[6]、宮頸癌[7]、肺癌[8]、腎細胞癌[9]等。另有研究也表明DKK3具有代謝及免疫相關功能，如免疫調節(jié)作用、代謝調節(jié)及心臟功能保護等[1]。上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)已在多種惡性腫瘤中被證實參與了腫瘤的侵襲和轉移，同時現有的研究也證實了DKK3在部分惡性腫瘤中參與并調控EMT這一過程[10]。然而對于DKK3在前列腺癌細胞系中的功能研究較少，本研究通過上調DKK3在PC3中的表達以探討其對PC3細胞凋亡、侵襲以及EMT相關蛋白表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019年6月～2020年6月于武漢大學人民醫(yī)院泌尿外科確診并接受前列腺癌根治手術患者標本24例為研究對象，所有患者在接受手術前均未接受化療及免疫治療；收集同期確診良性前列腺增生并接受前列腺電切術患者標本24例為對照組。本研究經武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2 主要試劑與儀器 前列腺癌細胞系PC3及人正常前列腺上皮細胞系RWPE-1購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；用于細胞培養(yǎng)的DMEM培養(yǎng)基、EMT相關蛋白孵育抗體、10%的胎牛血清、細胞凋亡相關試劑盒和SYBR Green real time PCR試劑分別購自Gibco Life Technologies公司、Abcam公司、碧云天公司以及Takara公司。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染 PC3細胞培養(yǎng)在適當條件的培養(yǎng)箱環(huán)境(5%CO2，37℃)中進行，并且每隔1～2 d更換新鮮的培養(yǎng)基，1周傳代2次。細胞進行常規(guī)消化之后，將其接種于6孔板中，當鏡下觀察到細胞總體密度達到80%的時候，換成無血清培養(yǎng)基進行轉染操作。實驗組轉染ov-DKK3,NC組轉染空載質粒(陰性對照)，Ctrl組為對照組。在轉染后6 h再將舊培養(yǎng)基換新鮮的完全培養(yǎng)基，細胞轉染48 h后再進行相關實驗分析。

1.4 免疫組化法檢測組織中DKK3表達情況 按免疫組化檢測試劑盒說明書對組織標本進行免疫組化染色，隨后DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分色，在光學顯微鏡下觀察DKK3在組織中的表達情況。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 細胞中所有RNA的提取按照Trizol詳細步驟進行操作,通過反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，用SYBR Green做熒光染料，檢測E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和DKK3的水平。內參基因為U6 RNA。在92℃下進行反應3 min預變性，接著在94℃下變性30 s，再于55℃退火30 s，72℃延長1 min，循環(huán)40次。根據待測標本Ct值，通過2-△△Ct法算出相對表達量。

1.6 細胞凋亡實驗 對轉染48 h后的各組細胞進行胰酶消化，在胰酶作用后進行離心(3 000 r/min，半徑80 nm，12 min)，用無菌PBS液對細胞進行3次充分洗滌，70%預冷乙醇重懸。依照Annexin V-FITC試劑盒操作說明配制溶液，再用250 μL結合緩沖液將其重新懸浮。將10 μL 20 mg/L的碘化丙啶(PI)加至懸液內并于37℃避光條件下孵育1 h，通過流式細胞儀進行檢測并進行數據解析。

1.7 細胞增殖實驗 收集對數生長期PC3細胞，加入胰蛋白酶消化，制成細胞懸液后調整細胞密度，按照每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板，分別于轉染24、48、72 h時每孔中加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37℃孵育4 h，棄上清，每孔分別加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床孵育后檢測各孔在490 nm波長的吸光度(OD)值。

1.8 Transwell實驗 前列腺癌PC3細胞系轉染ov-DKK3及空白對照24 h后，消化酶作用下收集細胞，以每孔5×104個接種到Transwell小室。小室上層加入100 μL無血清培養(yǎng)基，下層加入600 μL含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)時間到后即刻在熒光倒置顯微鏡下觀察各組細胞侵襲和遷移情況。

1.9 Western blot 各組細胞進行收集后接著將RIPA裂解溶液(PMSF)加至其中，在裂解30 min后采取超聲勻漿，再進行細胞總蛋白提取。集其上清后以BCA法測定蛋白濃度。電泳后將凝膠放入電傳輸槽中進行電轉，并轉移到硝酸纖維素膜上再密封1.5 h，TBST液充分洗膜后加1∶1 000對抗E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白抗體進行稀釋并于4℃冰箱孵育過夜。GAPDH為內參對照。加入二抗后室溫孵育1 h后進行曝光顯影。

2 結果

2.1 DKK3在前列腺癌組織中表達降低 免疫組化檢測顯示，DKK3在前列腺增生組織表達明顯高于前列腺癌組織(圖1)。

圖1 DKK3在前列腺癌組織中的表達

2.2 DKK3在PC3細胞中表達水平降低 qRT-PCR法檢測顯示，與正常前列腺上皮細胞(1.00±0.08)相比，前列腺癌PC3細胞中DKK3表達(0.53±0.06)減少，差異有統(tǒng)計學意義(t=-8.14，P<0.01)。

2.3 過表達DKK3促進PC3細胞凋亡 細胞凋亡實驗結果顯示，ctrl組、NC組以及ov-DKK3組凋亡率分別為(16.27±1.82)%、(15.80±1.78)%、(28.72±2.56)%。ov-DKK3組凋亡能力較ctrl組及NC組表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(F=37.07，P<0.01)，見圖2。

圖2 過表達DKK3促進PC3細胞凋亡

2.4 過表達DKK3抑制PC3細胞增殖MTT增殖 PC3細胞中ctrl、NC及ov-DKK3組的24、48、72 h細胞增殖率分別為[(53.52±3.64)%、(52.18±3.52)%、(44.53±3.01)%]，[(73.25±4.02)%、(72.15±3.86)%、(60.28±4.18)%]，[(88.56±5.18)%、(84.43±4.92)%、(71.62±4.30)%]。ov-DKK3組增殖能力較ctrl組及NC組表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.10，P<0.05；F=9.59，P<0.05;F=10.10，P<0.05)。

2.5 過表達DKK3抑制PC3細胞遷移 Transwell細胞遷移實驗結果顯示，與ctrl組[(86.28±6.23)個]、NC組[(88.16±5.69)個]相比，ov-DKK3組[(48.52±4.37)個]細胞遷移能力減弱，差異有統(tǒng)計學意義(F=49.85，P<0.01)。見圖3。

2.6 過表達DKK3抑制PC3細胞侵襲 Transwell細胞侵襲實驗結果顯示，與ctrl組[(36.28±2.86)個]、NC組[(35.19±2.98)個]相比，ov-DKK3組[(19.88±2.13)個]細胞侵襲能力減弱，差異有統(tǒng)計學意義(F=35.04，P<0.01)。見圖4。

圖3 過表達DKK3抑制PC3細胞遷移

圖4 過表達DKK3抑制PC3細胞侵襲

2.7 過表達DKK3對PC3細胞中EMT相關蛋白表達水平的影響 Western blot實驗結果顯示,ov-DKK3組中E-cadherin蛋白水平(0.71±0.05)比ctrl組(0.46±0.04)和NC組(0.40±0.04)升高，差異具有統(tǒng)計學意義(F=42.68，P<0.01);與ctrl組(0.42±0.03、0.40±0.03)和NC組(0.32±0.03、0.41±0.03)相比，ov-DKK3組中Vimentin和N-cadherin蛋白(0.18±0.02、0.25±0.02)水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=59.45，P<0.01;F=32.86，P<0.01)。qRT-PCR實驗結果顯示,ov-DKK3組中E-cadherin mRNA水平(3.56±0.25)比ctrl組(1.00±0.18)和NC組(0.98±0.16)升高，差異具有統(tǒng)計學意義(F=164.40，P<0.01);與ctrl組(1.00±0.07、1.00±0.07)和NC組(1.03±0.08、1.02±0.07)相比，ov-DKK3組中Vimentin和N-cadherin mRNA(0.56±0.06、0.45±0.05)水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=41.82，P<0.01;F=76.56，P<0.01)。見圖5。

圖5 過表達DKK3對PC3細胞EMT相關蛋白表達的影響

3 討論

前列腺癌是男性最常見腫瘤之一，全球范圍內發(fā)病率約占成人惡性腫瘤的7.3%[11]。在我國前列腺癌確診患者大多數分期偏晚，尤其是進展至轉移性去勢抵抗前列腺癌(mCRPC)后治療效果不佳，治療靶點少，預后極差。DKK3是一種分泌性糖蛋白，屬DKK蛋白家族成員，多篇文獻報道DKK3在多種惡性腫瘤組織中有異常表達[12]。研究表明EMT相關蛋白在前列腺癌侵襲和轉移中扮演重要角色，且這一作用與患者預后密切相關，其機制可能與前列腺癌細胞發(fā)生EMT轉化后獲得更強的侵襲和轉移能力有關[13]。已有文獻證實DKK3在部分腫瘤中與上皮細胞間質轉化過程相關[10]，但其在前列腺癌中與EMT的關系以及對細胞凋亡以及腫瘤生物學行為(如遷移和侵襲)的影響仍不明確。

為進一步探究DKK3在前列腺癌中與上皮細胞間質轉化的關系以及其對凋亡、遷移和侵襲的影響。本研究結果顯示前列腺癌組織和細胞中DKK3表達明顯減少，這一結果與DKK3在大部分腫瘤中的低表達相符。在此基礎上，本研究通過上調DKK3在PC3中的表達以探討其對PC3細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲以及EMT相關蛋白的影響。結果顯示，過表達DKK3可以促進PC3細胞凋亡，同時抑制PC3細胞的增殖、遷移及侵襲能力。與此同時，過表達DKK3后E-cadherin蛋白表達水平升高，而另外兩種EMT相關蛋白Vimentin和N-cadherin的表達水平下降，這也可以從分子水平揭示DKK3能夠通過調控EMT相關蛋白表達水平降低前列腺癌侵襲和轉移的風險。

綜上所述，DKK3可能作為一種抑癌基因在前列腺癌發(fā)生與發(fā)展的一系列過程中扮演了重要的角色，其通過靶向調控EMT相關蛋白從而影響前列腺癌的侵襲和遷移，并最終抑制前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。