一株Triton X-100降解菌的分離鑒定及降解條件優(yōu)化

王寶任，蘇婷婷，王戰(zhàn)勇

（1.遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

表面活性劑是一種在低濃度下能夠顯著降低界面張力的物質(zhì)，具有增溶、分散、乳化的作用，由于其獨(dú)特的性質(zhì)和多樣的功能，廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、日化等領(lǐng)域[1-2]。但是，若大量使用表面活性劑，則會(huì)在環(huán)境中積累，造成一定的生態(tài)問(wèn)題。例如，水體中的表面活性劑在魚(yú)的內(nèi)臟和鰓積累，可導(dǎo)致魚(yú)類窒息死亡[1]；土壤中的表面活性劑會(huì)損傷植物根系，抑制植物的光合作用[3-5]；過(guò)量的表面活性劑對(duì)人體也有害，可能會(huì)導(dǎo)致皮炎和口腔潰瘍等疾病[6-7]。因此，有效清除環(huán)境中的表面活性劑，維持生態(tài)環(huán)境的平衡，保護(hù)人體健康，已成為環(huán)境工程領(lǐng)域亟待解決的重要任務(wù)。治理表面活性劑廢水的方法眾多，但生物降解法是最為高效和安全環(huán)保的處理方法[8-9]。

本研究從某化工廠污水處理車(chē)間好氧曝氣池的活性污泥中篩選了對(duì)非離子表面活性劑TritonX-100具有降解能力的菌株ISB5，對(duì)其降解Triton X-100的能力進(jìn)行了考察。研究結(jié)果對(duì)表面活性劑造成的環(huán)境污染問(wèn)題的修復(fù)和處理具有重要的實(shí)際意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器及設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Triton X-100非離子表面活性劑，福州飛凈生物科技有限公司；六水硝酸鈷、硫氰酸銨，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英國(guó)OXOID公司；核酸提取純化試劑盒，江蘇達(dá)伯藥業(yè)有限公司；硫氰酸鈷銨溶 液、三 氯 甲 烷、NaCl、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 AR124CN電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；XL30 ESEM-FEG掃描電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；SHP-1500生化培養(yǎng)箱、TSQ-280恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Mikro 200R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hettich公司；Model 680酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-QX全溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.2 培養(yǎng)基的制備

MSM培養(yǎng)基：向500 mL燒杯中加入（NH4）2SO4（2.00 g）、MgSO4·7H2O（0.20 g）、CaCl2·2H2O（0.01 g）、FeSO4·7H2O（0.001 g）、Na2HPO4·12H2O（1.50 g）、KH2PO4（1.50 g）并混合，加適量去離子水溶解，用玻璃棒攪拌促溶，倒入1 000 mL容量瓶中并用去離子水定容至刻度，置1 000 mL肖特瓶中保存。

富集培養(yǎng)基：在MSM培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的酵母提取物，用玻璃棒攪拌促溶。

LB培養(yǎng)基：向500 mL燒杯中加入蛋白胨（10.00 g）、酵母提取物（5.00 g）、NaCl（5.00 g）并混合，加適量去離子水溶解，用玻璃棒攪拌促溶，倒入1 000 mL容量瓶中并用去離子水定容至刻度（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.3 菌株的分離與篩選

取適量某化工廠污水處理車(chē)間的活性污泥，接入100.00 mL富集培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4 d后，取1 mL菌液再次加入100.00 mL富集培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min的條件下再次振蕩培養(yǎng)4 d，重復(fù)3次。

將上述經(jīng)過(guò)多次富集培養(yǎng)的菌液適當(dāng)稀釋后，接種于以Triton X-100為唯一碳源的MSM平板上，涂布均勻，在30℃的溫度下培養(yǎng)3～4 d。選取生長(zhǎng)狀況較好的單菌落再次接種于Triton X-100/MSM平板進(jìn)行復(fù)篩，劃線培養(yǎng)。

觀察復(fù)篩平板上菌落的顏色和形狀等特征，選取生長(zhǎng)狀況良好的單菌落繼續(xù)于平板上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)多次培養(yǎng)后，根據(jù)菌落顏色和形狀等特征確定純培養(yǎng)菌株。

1.4 菌株的形態(tài)特征觀察

將純培養(yǎng)菌株在LB培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)（30℃）2 d后，使用掃描電鏡觀察菌體形態(tài)。

1.5 菌株的16S r DNA鑒定

使用16S rDNA測(cè)序?qū)赀M(jìn)行鑒定[10]。16S rDNA擴(kuò)增引物為通用引物：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（TACGGTTACCTTACGACTT）。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 降解條件的考察

1.6.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌株ISB5按1.00%（菌株ISB5與培養(yǎng)基的體積比，下同）的接種量接種于含Triton X-100（質(zhì)量濃度為2 g/L）的100.00 mL MSM培養(yǎng)基中，在不同培養(yǎng)溫度、150 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h，在12 000 r/min的條件下對(duì)培養(yǎng)物離心15 min后，取上清液測(cè)定Triton X-100的質(zhì)量濃度。

1.6.2 振蕩速率對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌株ISB5按1.00%的接種量接種于含Triton X-100（質(zhì)量濃度為2 g/L）的100.00 mL MSM培養(yǎng)基中，在不同振蕩速率、30℃的溫度下振蕩培養(yǎng)48 h后，測(cè)定培養(yǎng)物上清液中Triton X-100的質(zhì)量濃度。

1.6.3 裝液體積（裝液量，下同）對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌株ISB5按1.00%的接種量接種于含Triton X-100（質(zhì)量濃度為2 g/L）的不同體積的MSM培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，測(cè)定培養(yǎng)物上清液中Triton X-100的質(zhì)量濃度。

1.6.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌株ISB5按1.00%的接種量接種于含Triton X-100（質(zhì)量濃度為2 g/L）的100.00 mL MSM培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)不同時(shí)間后，測(cè)定培養(yǎng)物上清液Triton X-100的質(zhì)量濃度。

1.6.5培養(yǎng)基Triton X-100初始質(zhì)量濃度對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌 株ISB5按1.00%的接種量接種于含不同質(zhì)量濃度Triton X-100的100.00 mL MSM培 養(yǎng) 基 中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，測(cè)定培養(yǎng)物上清液中Triton X-100的質(zhì)量濃度。

1.6.6 接種量對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響將菌株ISB5按不同的接種量接種于含Triton X-100（質(zhì)量濃度為2 g/L）的100.00 mL MSM培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，測(cè)定培養(yǎng)物上清中Triton X-100的質(zhì)量濃度。

1.7 非離子表面活性劑的測(cè)定方法

通過(guò)硫氰酸鈷法（CTAS法）[11]測(cè)定Triton X-100的質(zhì)量濃度。1.00 mL上清液中加入1.25 mL硫氰酸鈷銨溶液和1.50 mL氯仿，充分混勻?qū)⒘蚯杷徕?乙氧基鈷絡(luò)合物萃取到氯仿層中，進(jìn)一步離心分層后，使用酶標(biāo)儀在630 nm下測(cè)量氯仿提取物的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Triton X-100的質(zhì)量濃度，并計(jì)算降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

經(jīng)數(shù)次分離純化，得到了一株對(duì)Triton X-100具有降解能力的菌株，命名為ISB5。對(duì)菌株ISB5菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)菌落較小，呈淡黃色，中間微微隆起，黏滑透明。

2.2 菌株的掃描電鏡形態(tài)分析

菌株ISB5的掃描電鏡顯微照片如圖1所示。由圖1可以看出，菌株ISB5個(gè)體呈桿狀或略彎曲的桿狀，兩端尖銳，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，菌體尺寸為（1.3～2.1）μm×（0.38～0.52）μm。

圖1 菌株ISB5的掃描電鏡顯微照片

2.3 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

把菌株ISB5的16S rDNA序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為MW741885。根據(jù)菌株ISB5的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖2），結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)特征，將菌株初步鑒定為Pseudomonassp.（假單胞菌屬）。

圖2 菌株ISB5的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.4 降解條件的優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖3所示。由圖3可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，Triton X-100的降解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，Triton X-100的降解率最高；當(dāng)培養(yǎng)溫度大于30℃時(shí)，Triton X-100降解率呈下降趨勢(shì)，尤其是當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到35℃后，下降趨勢(shì)非常明顯；當(dāng)降解溫度為45℃時(shí)，Triton X-100的降解率僅為10.6%，說(shuō)明菌株ISB5不適應(yīng)偏高溫的生長(zhǎng)環(huán)境。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響

2.4.2 溶解氧含量對(duì)菌株降解Triton X-100的影響 溶解氧含量是影響需氧微生物生長(zhǎng)的重要條件，搖床培養(yǎng)過(guò)程中影響溶解氧含量的主要因素有搖床振蕩速率（振蕩速率，下同）和裝液量。

（1）振蕩速率對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響。振蕩速率對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖4所示。

圖4 振蕩速率對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響

由圖4可以看出，隨著振蕩速率的增加，Triton X-100降解率呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)振蕩速率為110～170 r/min時(shí)，Triton X-100的降解率較高；當(dāng)振蕩速率大于170 r/min時(shí)，隨著振蕩速率的增加，Triton X-100的降解率反而下降。其原因是：雖然振蕩速率的增加有助于液體培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧含量升高，但液體培養(yǎng)基內(nèi)的剪切應(yīng)力也會(huì)變大，而菌株所能承受的剪切應(yīng)力是有限的，當(dāng)剪切應(yīng)力高于菌株承受能力的上限時(shí)，會(huì)抑制菌株生長(zhǎng)甚至破壞菌株，使菌株的降解能力降低[12]。綜合考慮，選取150 r/min作為最適振蕩速率。

（2）裝液量對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響。裝液量是液體微生物培養(yǎng)的重要影響因素，通過(guò)調(diào)整裝液量可控制培養(yǎng)基中的溶解氧和氧氣的傳遞效率。裝液量對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖5所示。由圖5可以看出，當(dāng)裝液量為60.00～100.00 mL時(shí)，隨著裝液量的增加，Triton X-100的降解率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；當(dāng)裝液量為100.00 mL時(shí)，Triton X-100的降解率最高；繼續(xù)增加裝液量，Triton X-100的降解率不再提高。

圖5 裝液量對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響

2.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響 適宜的培養(yǎng)時(shí)間可使微生物有效地利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)揮其降解作用。培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響

由圖6可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，Triton X-100的降解率呈上升趨勢(shì)；培養(yǎng)時(shí)間為0～12 h時(shí)，Triton X-100的降解速度增加緩慢，這與菌株ISB5在此階段處于生長(zhǎng)延滯期有關(guān)，此時(shí)菌株ISB5需要適應(yīng)高質(zhì)量濃度Triton X-100的存在；此后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，Triton X-100的降解率明顯提高，在32 h時(shí)降解率達(dá)到最大。但是，培養(yǎng)時(shí)間為28～32 h時(shí)，Triton X-100的降解率效變化不大。因此，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇28 h為最適培養(yǎng)時(shí)間。

2.4.4 培養(yǎng)基Triton X-100初始質(zhì)量濃度對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響 培養(yǎng)基Triton X-100初始質(zhì)量濃度對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖7所示。

圖7 培養(yǎng)基Triton X-100初始質(zhì)量濃度對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響

由圖7可知，當(dāng)Triton X-100初始質(zhì)量濃度為1～4 g/L時(shí)，降解率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)；當(dāng)Triton X-100初始質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，Triton X-100的降解率最高，降解率達(dá)到93.0%；當(dāng)Triton X-100初始質(zhì)量濃度大于4 g/L時(shí)，Triton X-100的降解率隨著Triton X-100初始質(zhì)量濃度的增加而降低，這可能是高質(zhì)量濃度Triton X-100在一定程度上抑制菌體生長(zhǎng)有關(guān)。2.4.5接種量對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響 接種量對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖8所示。由圖8可以看出，當(dāng)接種量小于1.00%時(shí)，Triton X-100的降解率隨著接種量的增加呈上升趨勢(shì)；當(dāng)接種量大于1.00%時(shí)，菌株ISB5的降解率并無(wú)明顯的增加。

圖8 接種量對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的影響

3 結(jié)論

從某化工廠污水處理車(chē)間好氧曝氣池的活性污泥中篩選了一株對(duì)Triton X-100具有降解能力的菌株，對(duì)菌株ISB5的16S rDNA進(jìn)行了測(cè)序和比對(duì)分析，將菌株ISB5鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）。對(duì)菌株ISB5降解Triton X-100的條件進(jìn)行了考察，確定了菌株ISB5的適宜降解條件：培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)基Triton X-100的初始質(zhì)量濃度為4 g/L，培養(yǎng)時(shí)間為28 h，搖床的振蕩速率為150 r/min，裝液量為100.00 mL，接種量為1.00%。在此條件下，菌株ISB5對(duì)TritonX-100的降解率可達(dá)93.0%以上。