乳酸菌合成細(xì)菌素的細(xì)胞通訊機(jī)制研究進(jìn)展

孔令譽(yù)，夏超然，沈淇元，曾小群*，郭宇星，吳振，潘道東

（1 寧波大學(xué) 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江寧波315800 2 南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院 南京 210097）

細(xì)菌素是某些細(xì)菌在生長代謝過程中由核糖體合成的，具有抑菌作用的多肽或蛋白質(zhì)[1]，廣泛應(yīng)用于食品加工貯藏及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。細(xì)菌素作為一種生物防腐劑，比化學(xué)防腐劑更有效和更利于人體健康[2]?？股貫E用引起多數(shù)致病菌產(chǎn)生耐藥性，已成為重大公共衛(wèi)生安全問題，而細(xì)菌素具備更好的抑菌性、靶向性、變化性和可組合性，使其成為抗生素的有效替代物[3]。其中，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）細(xì)菌素因無毒、非免疫原性、耐熱性和廣譜抑菌等特性[4]而成為細(xì)菌素研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。已報(bào)道的產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）等[5]。

乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素，是乳酸菌對抗自然界復(fù)雜的生存條件，適應(yīng)進(jìn)化所形成的競爭和防御機(jī)制[6-8]，尤其在種內(nèi)競爭中表現(xiàn)出更明顯的抑菌特性[9]。乳酸菌細(xì)菌素表現(xiàn)出以下多樣性，早期研究根據(jù)細(xì)菌素分子結(jié)構(gòu)中是否含有羊毛硫氨基酸，可以將細(xì)菌素分為羊毛硫抗生素和非羊毛硫抗生素，而近幾年的研究對乳酸菌細(xì)菌素的分類有新的改動，即而根據(jù)細(xì)菌素翻譯后是否經(jīng)過明顯修飾過程，將其劃分為翻譯后修飾細(xì)菌素（posttranslationally modified bacteriocins）和非修飾細(xì)菌素（unmodified/slight-modified bacteriocins）[10]。根據(jù)是否經(jīng)過明顯翻譯后修飾，可將乳酸菌細(xì)菌素分為[11-13]：Ⅰ類，為經(jīng)過明顯翻譯后修飾的小分子多肽（分子質(zhì)量小于10 ku），如羊毛硫菌素、含硫碳鍵修飾細(xì)菌素、噻唑/惡唑修飾肽等；Ⅱ類，也是小分子多肽，為非修飾肽或非顯著修飾肽，熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)與活性不同，又被分為4 個子類（Ⅱa：片球菌素樣細(xì)菌素；Ⅱb：雙肽細(xì)菌素；Ⅱc：無前導(dǎo)序列細(xì)菌素；Ⅱd：線性非片球菌素樣細(xì)菌素）；以及溶菌素（bacteriolysins），是一類熱敏大分子蛋白質(zhì)（分子質(zhì)量大于10 ku），早期被分類為Ⅲ類細(xì)菌素，但該類細(xì)菌素完全不同于Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)菌素，因此它作為一類特殊細(xì)菌素被分支出來。Ⅰ類細(xì)菌素Nisin，是目前唯一被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證為公認(rèn)安全產(chǎn)品（Generally Recognized As Safe，GRAS），且被廣泛作為天然防腐劑而投入到商業(yè)化生產(chǎn)中[14]。其它乳酸菌細(xì)菌素因產(chǎn)量低、活性低等問題而無法用于實(shí)際生產(chǎn)，使乳酸菌細(xì)菌素的使用存在較大的局限性。為了拓寬細(xì)菌素的應(yīng)用，研究者通過開展蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因工程、毒理學(xué)等多方面研究[15-16]，以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌素的高效表達(dá)與生產(chǎn)，并揭示乳酸菌細(xì)菌素的形成及作用機(jī)制。同時，人們根據(jù)Nisin 的多肽結(jié)構(gòu)，著手人工合成穩(wěn)定的抗菌肽[17]。雖然細(xì)菌素的特征結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在如套索結(jié)構(gòu)、糖基化側(cè)鏈、復(fù)雜的肽基序等，給化學(xué)合成細(xì)菌素帶來了巨大的困難和挑戰(zhàn)[18]，但是這一舉措若成功，足以保證未來對細(xì)菌素的供應(yīng)。

細(xì)胞通訊（cell communication）普遍存在于生物中，如神經(jīng)元之間化學(xué)信號與電信號的傳遞和轉(zhuǎn)化、成肌過程以及細(xì)菌細(xì)胞間的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）等[19-20]。QS 是分子介導(dǎo)的細(xì)胞通訊方式，即細(xì)胞產(chǎn)生擴(kuò)散性小分子信號（又稱自誘導(dǎo)物質(zhì)，autoinducer，AI）并積累達(dá)到一定閾值，這時細(xì)胞之間開始接收這些信號，被誘導(dǎo)并啟動相關(guān)基因表達(dá)，因此是一種群密度依賴性調(diào)控機(jī)制。QS 的完整信號通路，除了AI 外，還需要信號感受器和反應(yīng)器，即雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（two-component regulatory system），由組氨酸激酶（histidine kinase，HK）和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（response regulator，RR）組成[21]，這2 種蛋白是細(xì)菌細(xì)胞的固定構(gòu)成成分，其基因表達(dá)與細(xì)胞生長同步進(jìn)行。以上3 部分（AI，HK，RR）構(gòu)成“信號發(fā)出、接收信號和反應(yīng)刺激”這一基本的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。乳酸菌細(xì)菌素的產(chǎn)生多受控于QS[22-23]。由于不同乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素類型可能不同，因此所誘導(dǎo)的信號分子類型也不同，主要涉及細(xì)菌素的誘導(dǎo)信號主要是由核糖體合成的寡肽類物質(zhì)，也稱為自誘導(dǎo)肽（autoinducing peptides，AIP），其次是微生物中普遍存在的非核糖體合成誘導(dǎo)信號AI-2[24]。其中，AI-2 還調(diào)控細(xì)菌生物發(fā)光、生物膜的形成、分泌毒力因子和遺傳轉(zhuǎn)化等能力[25]。目前關(guān)于Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)菌素受信號分子誘導(dǎo)的研究相對于Ⅲ類細(xì)菌素更成熟。本文主要針對Ⅰ類和Ⅱ類乳酸菌細(xì)菌素，綜述誘導(dǎo)乳酸菌細(xì)菌素形成的細(xì)胞通訊機(jī)制。

1 誘導(dǎo)型乳酸菌細(xì)菌素形成概述

乳酸菌細(xì)菌素一般在細(xì)菌的指數(shù)期開始形成[26]，主要是受誘導(dǎo)產(chǎn)生的誘導(dǎo)型細(xì)菌素，也有組成型細(xì)菌素（自然低水平表達(dá)），誘導(dǎo)型細(xì)菌素在乳酸菌生長競爭中更占據(jù)優(yōu)勢[22]。并非所有誘導(dǎo)型乳酸菌細(xì)菌素均依賴于HPK-RR。Noda 等[27]報(bào)道，在短乳桿菌174A 中并未發(fā)現(xiàn)編碼HPK 和RR的基因，而發(fā)現(xiàn)與正調(diào)控其產(chǎn)生細(xì)菌素的2 種調(diào)控蛋白（BreD 和BreE）。一般單一乳酸菌菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，細(xì)菌素的抑菌活性無法被檢測到[28]，這是由于信號分子在液體中的擴(kuò)散能力強(qiáng)于在固體介質(zhì)中的，導(dǎo)致液體中細(xì)胞周圍的信號分子濃度遠(yuǎn)低于在固體中的，達(dá)不到誘導(dǎo)細(xì)菌素產(chǎn)生所要求的閾值[29]。

2 誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的方式

2.1 AIP 誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素

2.1.1 AIP 來源及形成 AIP 誘導(dǎo)是乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的主要誘導(dǎo)調(diào)控形式，屬于種內(nèi)信號傳遞，具有特異性[30]。AIP 信號一般分為2 類：i 類AIP 是乳酸菌自身產(chǎn)生的少量細(xì)菌素；ii 類AIP 是類細(xì)菌素肽，這2 類AIP 與同基因簇內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均為組成型[31]。

Nisin 是乳酸菌細(xì)菌素中最典型的i 類AIP[32]。研究表明乳酸乳球菌轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)環(huán)境時，其細(xì)胞表面已附著少量Nisin[33]，說明在細(xì)胞培養(yǎng)初期，這些附著的Nisin 能夠刺激細(xì)胞持續(xù)分泌Nisin，并隨胞外Nisin 達(dá)到一定濃度，最終其能夠誘導(dǎo)自身細(xì)菌素的大量表達(dá)。也有研究證明，在亞抑制濃度（即未達(dá)到抑菌效果的濃度）下，細(xì)菌素起誘導(dǎo)信號的作用[34]。添加一定量的外源Nisin，可以促進(jìn)Nisin 的誘導(dǎo)形成。另外，不利生長條件[35]、光刺激[36]等因素，也能刺激乳酸菌產(chǎn)生少量的細(xì)菌素作為AIP，進(jìn)而啟動細(xì)菌素大量表達(dá)。除Nisin 外，副干酪乳桿菌J23 表達(dá)的 Lac-B23[37]，戊糖乳桿菌CS2 表達(dá)的戊糖乳桿菌素MQ1[38]和唾液乳桿菌SPW1 表達(dá)的唾液乳桿菌素Mmaye1[39]均被發(fā)現(xiàn)作為i 類AIP 的能力；也有同一細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)菌素受同一AIP 誘導(dǎo)的報(bào)道，如屎腸球菌NKR-5-3 產(chǎn)5 種細(xì)菌素（腸球菌素NKR-5-3A、B、C、D和Z）的，其中NKR-5-3D 可誘導(dǎo)自身與NKR-5-3A、C、Z 的表達(dá)[40-41]，這類乳酸菌，其不同細(xì)菌素基因分別位于染色體和質(zhì)粒上，因此其AIP 并不能誘導(dǎo)表達(dá)所有的細(xì)菌素。

ii 類AIP 通常是由細(xì)菌素基因簇上的調(diào)控基因表達(dá)的不具備抑菌活性的類細(xì)菌素寡肽。如清酒乳桿菌Lb706[42]、嗜酸乳桿菌NCFM[43]、鳥腸球菌XA83[44]、嗜熱鏈球菌LMD-9[45]、加氏乳桿菌EV1461[46]等，均含有編碼ii 類AIP 的基因序列。其中，植物乳桿菌產(chǎn)Ⅱb 類細(xì)菌素受plNC8IF 或plnA 編碼的寡肽誘導(dǎo)已被熟知[47]。ii 類AIP 通常由產(chǎn)Ⅱ類細(xì)菌素乳酸菌產(chǎn)生，在胞內(nèi)時，其結(jié)構(gòu)中多含有雙甘氨酸前導(dǎo)序列，需經(jīng)過與自身細(xì)菌素相同的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，從胞內(nèi)運(yùn)至胞外發(fā)揮作用[48]（圖1 中途徑（1）所示）。

2.1.2 AIP 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 乳酸菌合成細(xì)菌素相關(guān)的HK-RR 雙組分系統(tǒng)，由細(xì)菌素基因簇內(nèi)的調(diào)控基因表達(dá)合成，如研究最多的乳酸鏈球菌，其細(xì)菌素基因簇中nisK 和nisR 分別表達(dá)HK 和RR[49]；又如植物乳桿菌內(nèi)調(diào)控子plnABCD，plnB表達(dá)HK，plnC 和plnD 表達(dá)RR[50]。在結(jié)構(gòu)上，雙組分系統(tǒng)包含特異性結(jié)構(gòu)與非特異性結(jié)構(gòu)，特異性結(jié)構(gòu)包括HK 的N-端信號識別結(jié)構(gòu)域和RR 的C-端效應(yīng)輸出結(jié)構(gòu)域（DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，啟動特定基因表達(dá)）；非特異性結(jié)構(gòu)包括HK 和RR 參與磷酸化和去磷酸化反應(yīng)結(jié)構(gòu)域（高度保守）[51]。乳酸菌在生長繁殖過程中向胞外分泌AIP，胞外AIP濃度達(dá)到閾值后，會與特定的HK 特異性結(jié)合并激活其活性，并進(jìn)一步使細(xì)胞質(zhì)中相應(yīng)的RR 磷酸化，磷酸化的RR 與細(xì)菌素基因簇中的啟動子結(jié)合，進(jìn)而開始合成、分泌細(xì)菌素，如圖1 途徑（2）所示。當(dāng)乳酸菌培養(yǎng)至一定階段，胞外AIP 被水解導(dǎo)致信號刺激消失，該過程也會終止[52]。

如圖1 所示，信號通路的末端由磷酸化的RR特異性地結(jié)合細(xì)菌素基因簇（包括編碼細(xì)菌素前體肽、修飾蛋白、免疫蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白和輔助蛋白等的序列）的各啟動子（這些啟動子中均含有特定的半保守序列，與RR 和DNA 結(jié)合有關(guān)）來開啟轉(zhuǎn)錄，并使該基因簇的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高[53-54]。以含有調(diào)控子plnCD 的植物乳桿菌為例，RRplnC和RRplnD分別起到激活和抑制的作用，在細(xì)胞生長初期，AIP 在胞外積累到一定范圍，RRplnC被激活并正調(diào)控細(xì)菌素表達(dá)；當(dāng)細(xì)胞密度過高，胞外AIP 過多時，會激活RRplnD開啟負(fù)調(diào)控[21]。Risùen 等[55]較早發(fā)現(xiàn)RRplnD需要達(dá)到RRplnC的10倍，才具有與RRplnD同樣的DNA 結(jié)合能力。這些說明RRplnD需要在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)到一定量，才會阻礙RRplnC與DNA 的結(jié)合，其機(jī)理可能是RRplnD開始磷酸化并導(dǎo)致RRplnC去磷酸化。另外，這2 類RR 與細(xì)菌素基因簇內(nèi)各啟動子的結(jié)合能力也各有差異，RRplnC與plnA 啟動子結(jié)合能力較強(qiáng)，而RRplnD與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因plnG 的啟動子的結(jié)合能力較強(qiáng)[56]。對于僅含有一種RR 的乳酸菌，AIP在高濃度下，RR 被去磷酸化而無法與啟動子結(jié)合。

當(dāng)磷酸化的RR 激活細(xì)菌素基因簇內(nèi)各啟動子后，乳酸菌便開始細(xì)菌素的轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌過程。Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)菌素，由結(jié)構(gòu)基因編碼其前體，該前體除了含有具抑菌活性的結(jié)構(gòu)外，還包括協(xié)助細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外的前導(dǎo)序列，以保證Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)菌素前體在胞內(nèi)無抑菌活性（除Ⅱc 類細(xì)菌素，在胞內(nèi)合成便具有抑菌活性，以不同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)分泌和自身免疫）[58]。前體在短時間內(nèi)再通過修飾酶對氨基酸殘基進(jìn)行修飾，如絲氨酸或蘇氨酸經(jīng)脫水酶產(chǎn)生羊毛硫氨基酸或甲基羊毛硫氨基酸[59]、分子內(nèi)環(huán)化（最終形成球狀肽結(jié)構(gòu)，像Ⅱ類細(xì)菌素內(nèi)常見的二硫鍵等穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，可以賦予細(xì)菌素較好的耐熱性）[60-61]、半胱氨酸S-糖基化[62]等；接著，由ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和輔助蛋白協(xié)同作用，切除細(xì)菌素前體的前導(dǎo)序列并轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，以成熟并具抑菌活性形式的存在[63-64]，由水解酶水解被切除的前導(dǎo)序列。而菌株自身免疫產(chǎn)生的細(xì)菌素，是由細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因相鄰的免疫基因表達(dá)的免疫蛋白引起的。免疫蛋白直接與穿過細(xì)胞膜的細(xì)菌素相互作用，或間接形成“細(xì)菌素-受體-免疫蛋白”復(fù)合物，從而以這2 種方式阻斷了細(xì)菌素引起細(xì)胞死亡的后續(xù)途徑[65]。

圖2 細(xì)菌素的誘導(dǎo)、合成、運(yùn)輸及自身免疫[57]Fig.2 The induction，synthesis，processing，transportation and self-immunity of bacteriocin[57]

2.2 AI-2 誘導(dǎo)乳酸菌細(xì)菌素合成

2.2.1 AI-2 來源及形成 與AIP 不同，AI-2 作為種間細(xì)胞交流的通用信號，由S-核糖同型半胱氨酸裂解酶（S -ribosylhomocysteine lyase，SRL/LuxS）催化合成[66-67]。如圖3 所示，有2 條循環(huán)途徑，均以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）作為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移給其它底物后，轉(zhuǎn)化為S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl-homocysteine，SAH），然后，由途徑Ⅰ和途徑Ⅱ?qū)τ卸局虚g產(chǎn)物SAH 進(jìn)行回收。途徑Ⅱ下的SAH 經(jīng)S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶（S-adenosylhomocysteine nucleosidase，SAN/Pfs）水解生成S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosyl-homocysteine，SRH），SRH再經(jīng)LuxS 催化生成4，5-二羥基-2，3-戊二酮（4，5-Dihydroxy-2，3-pentandione，DPD）和同型半胱氨酸，由于DPD 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定發(fā)生分子重排，轉(zhuǎn)化為信號分子AI-2[68]。而途徑Ⅰ為甲硫氨酸循環(huán)（methionine cycle），不產(chǎn)生AI-2，因此Pfs 和LuxS 同為合成AI-2 的關(guān)鍵酶和限速酶。最后，同型半胱氨酸依次經(jīng)MetH/ MetE 和SAM 合成酶合成SAM。目前關(guān)于乳桿菌屬分泌AI-2 的報(bào)道較多，主要是植物乳桿菌[21]。孫思睿等[69]發(fā)現(xiàn)含有LuxS 基因的植物乳桿菌KLDS1.0391 在缺失該基因片段的情況下，菌株產(chǎn)細(xì)菌素能力和鹽脅迫下的生長代謝能力均顯著降低。張騰[70]從HE-1 中擴(kuò)增出LuxS 基因，并與其它植物乳桿菌的該基因序列比較，同源性達(dá)到99%。此外，Jenabian 等[71]報(bào)道了鼠李糖乳桿菌GG、嗜酸乳桿菌NCFM、唾液乳桿菌UCC118、約氏乳桿菌NCC 533 這4 株乳桿菌均可分泌AI-2 信號。AI-2 與AIP 相似，外界因子在一定程度上刺激細(xì)胞而引起LuxS 基因表達(dá)上調(diào)，使AI-2 的產(chǎn)量增加。田甜等[72]從枯草芽孢桿菌分離出對副干酪乳桿菌HD1.7（含LusX 基因）合成AI-2 有增強(qiáng)作用的肽類刺激因子。

圖3 AI-2 的合成途徑[73]Fig.3 The synthetic pathway of AI-2[73]

2.2.2 AI-2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 雖然目前AI-2 誘導(dǎo)細(xì)菌素的機(jī)制尚不明確，但是在其基因調(diào)控方面有較詳細(xì)的報(bào)道。LuxS/AI-2 QS 系統(tǒng)在哈維氏弧菌中被首次發(fā)現(xiàn)，并且其與調(diào)控生物發(fā)光有關(guān)[74]。之后，陸續(xù)在許多革蘭氏陰性菌和陽性菌中發(fā)現(xiàn)[75]。在哈維氏弧菌的生物發(fā)光機(jī)制中，LuxP 和LuxQ 分別負(fù)責(zé)識別AI-2 和基因調(diào)控[76]。LuxS/AI-2 QS 系統(tǒng)與AIP QS 系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相似，而胞內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制稍有差異。當(dāng)胞外無AI-2 或AI-2 處于較低濃度時，LuxP 未識別到AI-2，胞內(nèi)LuxQ 仍與LuxP 結(jié)合并處于激酶的狀態(tài)，將磷酸基團(tuán)通過磷酸轉(zhuǎn)移酶LuxU 和σ54轉(zhuǎn)移給LuxO，隨后LuxO-P 與伴侶蛋白Hfq 一起激活產(chǎn)生具調(diào)節(jié)作用的sRNAs，這些sRNAs 通過破壞LuxR 的mRNA 的穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制LuxR，而LuxR 負(fù)責(zé)激活熒光基因及其它靶基因的轉(zhuǎn)錄，因此，此時細(xì)胞不會產(chǎn)生熒光；當(dāng)AI-2 處于較高濃度并與LuxP相結(jié)合時，這會使LuxP/Q 由激酶轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿崦福琇uxU-P 和LuxO-P 則被去磷酸化而失去活性，此時LuxR 能夠被正常表達(dá)，從而激活熒光基因使細(xì)胞發(fā)出熒光[77-78]。因?yàn)锳I-2 可能調(diào)控某一細(xì)胞的多種表型，所以一個細(xì)胞存在多種不同的雙組分系統(tǒng)，表現(xiàn)出不同的特性以適應(yīng)外界環(huán)境變化。

雖然沒有報(bào)道指出AI-2 直接參與乳酸菌細(xì)菌素的表達(dá)，但是研究表明，AI-2 確實(shí)在細(xì)菌素的表達(dá)上起重要作用，如：張?bào)薜萚79]在培養(yǎng)植物乳桿菌KLDS1.0391 時，外源添加AI-2 并觀察PlnEF 表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)AI-2 對細(xì)菌素的表達(dá)起正向調(diào)控作用。對于擁有LuxS/AI-2 QS 系統(tǒng)的植物乳桿菌KLDS1.0391，Man 等[80]利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析比對植物乳桿菌KLDS1.0391 的LuxS 突變型菌株與野生型菌株的蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)LuxS缺失引起AIP 誘導(dǎo)的雙組分系統(tǒng)中HK 蛋白表達(dá)水平下調(diào)，以及在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂肪酸合成代謝中蛋白表達(dá)水平也發(fā)生變化，并證明植物乳桿菌KLDS1.0391 產(chǎn)生細(xì)菌素的能力與AI-2 活性呈正相關(guān)。這些說明AI-2 可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞其它生理代謝活動，來提供合成細(xì)菌素所需的底物和能量。也有研究指出，同一乳酸菌中LuxS/AI-2 QS 系統(tǒng)與AIP QS 系統(tǒng)的雙組分系統(tǒng)是一致的[81]，說明AI-2 與AIP 受體之間具備一定特異性結(jié)合能力，可能是由于HK 識別AIP后，其蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成可與AI-2 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致AI-2 與AIP 共同作用于細(xì)菌素的誘導(dǎo)調(diào)控。

2.3 共培養(yǎng)誘導(dǎo)

共培養(yǎng)是更復(fù)雜的培養(yǎng)體系，可能是多種信號誘導(dǎo)和細(xì)胞刺激共同作用的過程（如圖1 途徑（4）所示）。不論是AIP 還是AI-2 誘導(dǎo)，在單獨(dú)培養(yǎng)乳酸菌時，其細(xì)菌素產(chǎn)量很低，以致無法檢測到細(xì)菌素活性，分離純化更是十分困難。然而，乳酸菌在與誘導(dǎo)菌（如靶細(xì)菌、產(chǎn)誘導(dǎo)信號細(xì)菌等）共培養(yǎng)或在多菌培養(yǎng)環(huán)境中，都能產(chǎn)生細(xì)菌素。某一乳酸菌與其它乳酸菌共培養(yǎng)[82-83]，或與沙門氏菌、大腸桿菌、哈維氏弧菌等致病菌共培養(yǎng)[84-86]，乳酸菌均可以利用其它菌種產(chǎn)生的更充足的特定誘導(dǎo)信號或細(xì)胞之間的接觸刺激，增強(qiáng)其產(chǎn)細(xì)菌素的能力。Di Cagno 等[87]將舊金山乳桿菌DPPMA174和戊糖片球菌2XA3 與植物乳桿菌DC400 共培養(yǎng)，檢測到2 種菌均使植物乳桿菌DC400 中誘導(dǎo)肽PlnA 的含量不同程度地提高。Maldonado-Barragán 等[47]發(fā)現(xiàn)，同一誘導(dǎo)菌可以誘導(dǎo)分別含有plNC8IF 和plnA 2 種調(diào)控子的不同植物乳桿菌菌株，表明誘導(dǎo)菌的作用方式與乳酸菌產(chǎn)生AIP 無關(guān)。而雙組分系統(tǒng)是誘導(dǎo)型細(xì)菌素的必需部分，在共培養(yǎng)條件下，細(xì)胞之間的競爭會促進(jìn)或抑制HK-RR 雙組分系統(tǒng)介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的細(xì)菌素合成途徑。同時，某些誘導(dǎo)菌的代謝活動可以形成更適宜于乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的環(huán)境。酸的積累使pH值降低是產(chǎn)細(xì)菌素的一個限制因素，乳酸菌與酵母菌共培養(yǎng)時，酵母菌能夠利用乳酸菌生長中產(chǎn)生的乳酸、乙酸和丙酸等有機(jī)酸，使pH 值恢復(fù)回接近中性并保持恒定，有利于乳酸菌細(xì)菌素的合成[88]。在“熱滅活誘導(dǎo)菌或活誘導(dǎo)菌”[89]和“只有活誘導(dǎo)菌”[90]的存在下，能檢測到乳酸菌被誘導(dǎo)并產(chǎn)生細(xì)菌素，而以無誘導(dǎo)菌細(xì)胞上清液作為誘導(dǎo)劑，均無法檢測出細(xì)菌素活性，說明只有乳酸菌及其它菌種活細(xì)胞共同存在，才是共培養(yǎng)下誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素的必要條件之一。然而，乳酸菌也存在與某些細(xì)菌共培養(yǎng)，其產(chǎn)細(xì)菌素被抑制的情況。Domínguez-Manzano 等[91]將植物乳桿菌NC8C 和屎腸球菌6T1a 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這2 株菌的產(chǎn)細(xì)菌素能力相互抑制，在其它發(fā)酵食品中分離的乳酸菌之間也有此現(xiàn)象。

3 復(fù)雜環(huán)境下的QS 信號識別網(wǎng)絡(luò)

乳酸菌在識別細(xì)菌素誘導(dǎo)信號時，會受到復(fù)雜環(huán)境因素的干擾。第一，受體識別QS 信號分子受阻。存在某些小分子抑制物質(zhì)或大分子抗體或水解酶，會阻礙AI 的產(chǎn)生或轉(zhuǎn)導(dǎo)，該現(xiàn)象被稱為群體猝滅（quorum quenching，QQ）[92]。在QS 系統(tǒng)中，人們利用某種拮抗劑對QS 信號進(jìn)行降解或阻斷其信號通路，從而抑制細(xì)胞生長這一手段常被用來控制病原菌，如抑制生物膜和毒性的形成[93-94]。研究證明，生物膜是致病菌形成耐藥性和產(chǎn)生毒性的主要原因之一，與游離的致病菌相比，在生物膜下致病菌的組織傳播能力和致病性更突出，因此阻斷AI-2 的合成途徑成為抑制這類致病菌的重要治療手段[75，95]。Weiland-Br?uer 等[96]從宏基因組中篩選出一種氧化還原酶QQ-2，能有效抑制肺炎鏈球菌的生物膜形成。另外，Santamaría 等[97]利用全基因組轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)豆科植物中的橄欖苦苷（oleuropein）具備QS 拮抗劑的潛力，使與其共存的植物乳桿菌WCFS1 的QS 誘導(dǎo)調(diào)控基因和細(xì)菌素基因表達(dá)下調(diào)，說明QS 拮抗劑也可以促進(jìn)宿主與有益菌之間的共生。第二，菌體微生物間還存在信號分子錯配，即串?dāng)_（crosstalk）和竊聽（eavesdrop）[98]：串?dāng)_常出現(xiàn)在2 種及以上菌種細(xì)胞之間的信號識別，它們可以相互識別對方產(chǎn)生的自誘導(dǎo)信號，能被抑制或激活；而竊聽是某一菌種雖不產(chǎn)生信號但能對非己信號作出響應(yīng)。例如，肺炎鏈球菌產(chǎn)細(xì)菌素的誘導(dǎo)機(jī)制中的Blp QS 系統(tǒng)會頻繁出現(xiàn)信號的錯配，信號BlpC 會被親和力較弱的非同源受體BlpH 識別，表現(xiàn)出單一信號對應(yīng)一個特定的受體集群，從而導(dǎo)致自誘導(dǎo)被弱化或無效化，而相應(yīng)的肺炎鏈球菌內(nèi)Com QS 系統(tǒng)幾乎不存在信號錯配現(xiàn)象[99]。Silva 等[100]借這種錯配現(xiàn)象，以5 株不同枯草芽孢桿菌菌株為研究對象，構(gòu)建QS 網(wǎng)絡(luò)模型，通過設(shè)定這5 株菌共培養(yǎng)中所產(chǎn)生的5 種不同信號的混合濃度，可以定向串?dāng)_細(xì)菌群落中的某一菌種被QS 激活。而AI-2作為通用信號，在細(xì)胞通訊間因交叉反應(yīng)引起錯配的現(xiàn)象也更為常見。第三，培養(yǎng)基質(zhì)也會影響QS 信號網(wǎng)絡(luò)。Turgis 等[101]報(bào)道了pH、溫度、碳源、氮源對乳酸乳球菌MM19 和乳酸片球菌MM33產(chǎn)細(xì)菌素的影響，適宜的產(chǎn)細(xì)菌素條件取決于菌種自身的生長特性。培養(yǎng)條件的不同會改變代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)化速率或方向，從而影響誘導(dǎo)信號的表達(dá)及細(xì)菌素合成所需成分的獲取。Caballero-Guerrero 等[102]在外源添加AIP 的條件下液體培養(yǎng)植物乳桿菌，調(diào)節(jié)NaCl 含量并觀察產(chǎn)細(xì)菌素情況，發(fā)現(xiàn)NaCl 含量提升到2%以上時，在液體培養(yǎng)基中檢測不到細(xì)菌素活性，說明較高NaCl 離子濃度抑制了細(xì)菌素的誘導(dǎo)產(chǎn)生，而在無外源AIP 共培養(yǎng)時，NaCl 含量提升到4%后，仍能在培養(yǎng)基中檢測出細(xì)菌素活性，這可能是由于在同一生長環(huán)境下，菌種之間可以相互削弱環(huán)境壓力；而且，由其它細(xì)胞分泌的酶、次級代謝產(chǎn)物，也會引起競爭干擾的作用[103]。

4 展望

目前，為應(yīng)對應(yīng)用型細(xì)菌素種類少，成本高，新型細(xì)菌素產(chǎn)量低等問題，不斷發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌素，研究其誘導(dǎo)機(jī)制、合成機(jī)制以及高效表達(dá)方法，成為解決這些問題的重要手段。乳酸菌細(xì)菌素為有效對抗有害菌的生物活性物質(zhì)，通過深入分析其產(chǎn)生的細(xì)胞通訊機(jī)制，建立特定的QS 調(diào)控系統(tǒng)（如已知的Nisin 生產(chǎn)中應(yīng)用的NICE 系統(tǒng)）[104]，以誘導(dǎo)機(jī)理為理念進(jìn)行生產(chǎn)設(shè)計(jì)[105]，異源表達(dá)[106]等方法來提高細(xì)菌素基因的表達(dá)或獲取誘導(dǎo)信號。也可以利用QS 系統(tǒng)高度靈敏的感知能力、生物相容性和可再生性，構(gòu)建監(jiān)測和控制有害微生物的生長狀況的一類生物傳感器，如通過對革蘭氏陰性菌特有的AHL 信號檢測并利用QS 拮抗劑，達(dá)到快速、及時抑制某些致病菌的目的[107]；還可以建立檢測誘導(dǎo)信號閾值的生物傳感器，這有利于人為添加準(zhǔn)確的信號濃度來控制乳酸菌快速表達(dá)細(xì)菌素。對于作用更廣泛的LuxS/AI-2 QS 系統(tǒng)，利用AI-2 和AIP 的協(xié)同作用，可有效提高乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)量。綜上，深入了解乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)生的細(xì)胞通訊機(jī)制，對于促進(jìn)乳酸菌細(xì)菌素的研究和應(yīng)用具有重要意義。