接種外生菌根真菌對(duì)不同種源栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)和生理特征的影響

高曉磊，張麗仔，唐 窈，鄒 鋒，熊 歡，朱景樂(lè)，唐 駿

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所，河南 鄭州，450003；3.國(guó)有信陽(yáng)市平橋區(qū)天目山林場(chǎng)，河南 信陽(yáng) 464194）

栓皮櫟Quercus variabilis是殼斗科Fagaceae櫟屬Q(mào)uercus落葉喬木，是重要的珍貴用材樹(shù)種，是我國(guó)軟木、栲膠的重要來(lái)源[1]。栓皮櫟在我國(guó)分布廣泛，北起遼寧省南至云南省均有分布，在涵養(yǎng)水源、保持水土和維持生態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要作用[2]。然而由于長(zhǎng)期的亂砍濫伐和生境破壞，栓皮櫟林的數(shù)量和質(zhì)量不斷下降，嚴(yán)重影響到我國(guó)軟木、栲膠等產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益受損嚴(yán)重[3]。栓皮櫟育苗方式為圃地播種，移栽造林過(guò)程中起苗易傷根，在丘陵山地造林實(shí)踐中，存在苗木側(cè)根稀少造成的苗木成活率低、生長(zhǎng)不良等問(wèn)題，嚴(yán)重阻礙了栓皮櫟的造林進(jìn)程。栓皮櫟是外生菌根（Ectomycorrhiza,ECM）宿主植物，目前菌根化育苗技術(shù)被認(rèn)為是提高苗木造林成活率的有效措施，在苗木培育、植樹(shù)造林等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

植物激素調(diào)控著根系發(fā)育，其中生長(zhǎng)素起主導(dǎo)作用[4]，生長(zhǎng)素等內(nèi)源激素在根尖的積累和梯度分布誘導(dǎo)了宿主植物菌根的發(fā)育，從而改變了宿主植物的根系構(gòu)型[5]。在經(jīng)過(guò)接菌處理的福鼎大白茶Camellia sinensis ‘Fudingdabaicha’、蘋(píng)果Malus pumila、番茄Lycopersicon esculentum等植株根系內(nèi)均出現(xiàn)了IAA 和GA3等激素含量的增加以及根系的擴(kuò)張[6-8]。接菌增強(qiáng)了植株對(duì)水分及養(yǎng)分的吸收能力，進(jìn)而對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)有著良好的促進(jìn)作用[9,10]，Segnitz 等[11]也報(bào)道了ECM 對(duì)植物根系吸收土壤養(yǎng)分及生長(zhǎng)的積極影響。Makita 等[12]對(duì)日本枹櫟Q.serrata進(jìn)行接菌處理，研究結(jié)果顯示，ECM 可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收來(lái)改變植物的形態(tài)特征，使枹櫟的比根長(zhǎng)增大，擴(kuò)大根系的吸收范圍。

光合作用是綠色植物重要的生理過(guò)程，植物的光合特性一定程度上能夠反映植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)情況[13]，植物葉片發(fā)出的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)反映了植株的光合作用信息，可以利用葉綠素?zé)晒鈪?shù)研究植株光合作用的真實(shí)狀況[14]。在對(duì)接菌植物光合特性的研究中發(fā)現(xiàn)，ECM 真菌接種能夠顯著提高葉片的凈光合速率和水分利用效率，Martins 等[15]報(bào)道稱(chēng)菌根真菌促進(jìn)了歐洲栗Castanea sativa葉片的凈光合速率提升；高悅等[16]也對(duì)華美牛肝菌Boletus speciosus、彩色豆馬勃Pisolithus tinctorius等外生菌根真菌接種的馬尾松Pinus massoniana、濕地松P.elliottii和黑松P.thunbergii幼苗的葉綠素含量及其主要葉綠素?zé)晒鈪?shù)（ФPS Ⅱ和ETR）進(jìn)行了研究。目前菌根化育苗技術(shù)在世界已有廣泛應(yīng)用，在栓皮櫟領(lǐng)域，劉現(xiàn)剛等[17]研究了接種綿毛絲膜菌Cortinarius sublanatus和美味牛肝菌B.edulis對(duì)北京種源栓皮櫟幼苗光合生理和氣體交換特征的影響，而關(guān)于外生菌根對(duì)不同種源栓皮櫟生長(zhǎng)及生理影響的研究尚少見(jiàn)報(bào)道。

硬皮馬勃Sclerodermasp.是一類(lèi)常見(jiàn)的菌根真菌，與殼斗科植物普遍共生。本研究以北京和河南種源的栓皮櫟為試材開(kāi)展硬皮馬勃接種盆栽試驗(yàn)，比較分析了不同處理栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、光合參數(shù)、根尖內(nèi)源激素含量的差異，旨在闡明ECM 真菌對(duì)不同種源栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)和生理特征的影響，以期為探索主要造林樹(shù)種的菌根應(yīng)用技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于湖南省長(zhǎng)沙市中南林業(yè)科技大學(xué)苗圃（112°59′32″E，28°08′12″N）。試驗(yàn)地海拔92 m，年平均氣溫17.2℃，年降水量為1 200～1 400 mm，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，氣候溫和，降水充沛，雨熱同期，該地區(qū)母巖為典型的第四紀(jì)網(wǎng)紋紅壤，風(fēng)化程度較深，區(qū)內(nèi)土壤為低酸性土壤或中性土壤，適宜植物及菌根真菌生長(zhǎng)，地帶性植被為常綠闊葉林。

1.2 試驗(yàn)材料制備

1.2.1 菌劑制備

從湖南省瀏陽(yáng)市板栗人工林采集子實(shí)體后，進(jìn)行分離純化，經(jīng)分子鑒定為硬皮馬勃，簡(jiǎn)稱(chēng)Sc[18]。于MMN 培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，然后用不含瓊脂的MMN 培養(yǎng)基做液體培養(yǎng)，最后在草炭和蛭石2∶1 混合的基質(zhì)上擴(kuò)大培養(yǎng)，得到固體菌劑[19]。

1.2.2 播種

于2019 年3 月中旬進(jìn)行播種，將黃心土∶泥炭按照體積分?jǐn)?shù)2∶1 混合作為容器育苗基質(zhì)，經(jīng)過(guò)37%的甲醛消毒處理，通風(fēng)陰干后分裝入口徑20 cm，高22 cm 的塑料容器中，將北京（BJ）和河南（HN）種源栓皮櫟種子經(jīng)0.5%的KMnO4溶液浸泡2 h，用清水洗凈陰干后進(jìn)行播種。BJ 和HN 種源各播種150 盆，每盆播種一粒種子，2 周后，發(fā)芽率分別為89.33%和92.67%，選取出苗時(shí)期、苗高、地徑相對(duì)一致的幼苗作為試驗(yàn)材料。

1.2.3 接種

本試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)置北京種源-接菌（BJ-Sc）、河南種源-接菌（HN-Sc）、北京種源-不接菌（BJ-CK）、河南種源-不接菌（HN-CK）等4 個(gè)處理，3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 株，共240 株。待栓皮櫟苗長(zhǎng)出2～3 片真葉，在幼苗周?chē)? cm 深的孔洞，將硬皮馬勃固體菌劑施入其中并覆土，每株幼苗接種5 g 固體菌劑，對(duì)照施入不含菌劑的基質(zhì)（CK）。各處理擺放間距0.5 m以上，以防止相互侵染。育苗期間正常澆水管理。

1.3 測(cè)試指標(biāo)及方法

1.3.1 苗高、地徑測(cè)量

5 月7 日至7 月7 日（每隔10 d）、9 月5 日、11 月14 日觀(guān)測(cè)栓皮櫟幼苗的生長(zhǎng)情況，使用卷尺測(cè)量苗高（cm），使用游標(biāo)卡尺測(cè)量地徑（mm）。

1.3.2 外生菌根形態(tài)觀(guān)察

每個(gè)處理隨機(jī)抽取3 株幼苗，取其根系浸泡在水中，洗去浮土，剪成5 cm 長(zhǎng)的根段，將根段放入含有少量水的表面皿中，置于OLYMPUS SZX16 體視顯微鏡下觀(guān)察其菌根形態(tài)[20]。

1.3.3 石蠟切片

將菌根根尖在Carnoy 固定液中抽氣10 h，完全排除材料中的空氣，置于70%的酒精溶液中，4℃下儲(chǔ)存。對(duì)固定的材料進(jìn)行適當(dāng)修整，并使用6 種濃度酒精進(jìn)行脫水，用二甲苯使樣品透明，嵌入石蠟中，然后用石蠟切片機(jī)（徠卡RM2235，德國(guó)海德堡）切片，厚度為10 μm。用1%番紅染色，制作封片，并使用顯微鏡（德國(guó)海德堡徠卡DM2500）獲取照片[18]。

1.3.4 細(xì)根生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

將上述根系經(jīng)掃描儀EPSON V7000 掃描成圖片，利用根系分析軟件分析直徑為0～2 mm 的細(xì)根根長(zhǎng)、根表面積、根體積等指標(biāo)[21]。

1.3.5 葉片SPAD 值測(cè)定

SPAD 值代表葉綠素相對(duì)含量，其與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)，能夠有效反映葉綠素的水平。每個(gè)處理隨機(jī)選取3 株幼苗，使用便攜式SPAD-502 Plus 葉綠素儀測(cè)定葉綠素含量，每株幼苗選擇同一葉位、無(wú)病蟲(chóng)害的成熟葉片，測(cè)定3次，記錄數(shù)據(jù)[22]。

1.3.6 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

于8 月下旬晴朗天氣的上午，每個(gè)處理隨機(jī)選取3 株幼苗，選擇生長(zhǎng)一致且受光方向相同的葉片，采用英國(guó)Hansatech 公司生產(chǎn)的FMS2 型脈沖調(diào)制熒光儀，參照馮玉龍等[23]的方法，測(cè)定光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）最大光能轉(zhuǎn)換效率（Fv/Fm）、PS Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)效率（ФPS Ⅱ）及電子傳遞速率（ETR）。

1.3.7 光合參數(shù)的測(cè)定

對(duì)于上述幼苗，于晴朗天氣上午10:00，選擇同一葉位葉片（從頂端數(shù)第5 片功能葉），使用Li-6400 便攜式光合儀測(cè)定凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）及蒸騰速率（Tr），并計(jì)算水分利用率（WUE）：水分利用率（WUE）=凈光合速率（Pn）/蒸騰速率（Tr）[17]。

1.3.8 根系內(nèi)源激素含量測(cè)定

取上述幼苗的根尖，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒測(cè)定玉米素核苷（ZR）、生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）含量[24]，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2018 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 13.0 軟件實(shí)現(xiàn)方差分析及LSD 多重比較，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種硬皮馬勃的菌根形成情況

在體視顯微鏡下可見(jiàn)接種Sc 的栓皮櫟幼苗根系出現(xiàn)黃白色短棒狀菌根，白色絮狀菌絲（圖1A—B）。對(duì)菌根橫截面進(jìn)行切片觀(guān)察，可見(jiàn)與正常根相比，菌根的表皮細(xì)胞外覆蓋有一層致密的菌套（Mantle），哈氏網(wǎng)（Hartig net）延伸至表皮和皮層細(xì)胞間（圖1C—D）。硬皮馬勃與栓皮櫟的親和性較強(qiáng)，接菌后60 d，BJ 和HN 幼苗的菌根侵染率分別為43.33%和45.00%；接菌后90 d，達(dá)到76.67%和81.33%；接菌120 d 時(shí)，兩個(gè)種源幼苗的菌根侵染率均超過(guò)90%，CK 組菌根侵染率為0（圖1E）。

圖1 栓皮櫟幼苗菌根形態(tài)特征及侵染率Fig.1 Morphological characteristics and colonization rate of mycorrhiza in Q.variabilis seedlings

2.2 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的影響

接種硬皮馬勃處理的栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)明顯優(yōu)于未接菌幼苗。如圖2 所示，5 月8 日—6 月27 日（接菌后10～60 d），幼苗生長(zhǎng)速率較高；6 月27 日接菌處理與對(duì)照間幼苗高和地徑出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；6 月27 日—7 月7 日（接菌后60～70 d），菌根苗仍維持較高生長(zhǎng)速率，對(duì)照的幼苗生長(zhǎng)速率明顯減緩；11 月4 日（接菌后190 d），接菌的BJ、HN 栓皮櫟苗高分別為37.02 和37.69 cm，與相應(yīng)對(duì)照相比，增幅分別達(dá)到19.5%和18.9%，2 個(gè)種源栓皮櫟菌根苗地徑分別為4.55 和4.60 mm，較相應(yīng)對(duì)照高14.9%和14.4%，表明接種硬皮馬勃能夠顯著促進(jìn)栓皮櫟幼苗的生長(zhǎng)。

圖2 不同處理的栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)Fig.2 Growth dynamics of the Q.variabilis seedlings under different treatments

2.3 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟幼苗根系形態(tài)的影響

由表1 可見(jiàn)，接種硬皮馬勃的BJ、HN 栓皮櫟幼苗細(xì)根根長(zhǎng)分別比相應(yīng)對(duì)照高166.9%和97.6%，根表面積高163.4%和83.5%，根體積高127.7%和64.6%，均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明接種硬皮馬勃能夠顯著促進(jìn)栓皮櫟幼苗細(xì)根的生長(zhǎng)；兩個(gè)種源間未接菌幼苗的細(xì)根根長(zhǎng)、根表面積及根體積無(wú)顯著差異，BJ 菌根苗的細(xì)根根長(zhǎng)、根表面積及根體積顯著高于HN 菌根苗。

2.4 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)和SPAD 值的影響

接種硬皮馬勃顯著提高了HN 栓皮櫟葉片的實(shí)際光化學(xué)效率（ФPS Ⅱ）和PS Ⅱ電子傳遞速率（ETR），對(duì)光能轉(zhuǎn)換效率（Fv/Fm）的影響不顯著。與對(duì)照相比，ФPS Ⅱ和ETR 分別提高了53.6%和62.3%。然而，接種硬皮馬勃對(duì)BJ 栓皮櫟幼苗的葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)無(wú)顯著影響。接種硬皮馬勃顯著提高了BJ 和HN 栓皮櫟幼苗葉片SPAD 值，增幅分別為13.9%和15.4%。BJ 和HN 間未接菌栓皮櫟幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)及SPAD 值均無(wú)顯著差異。

2.5 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟幼苗光合參數(shù)的影響

接種硬皮馬勃顯著提高了BJ 和HN 栓皮櫟幼苗葉片的凈光合速率（Pn）（表3）。兩個(gè)種源的凈光合速率分別比相應(yīng)對(duì)照高40.2%和74.5%，Pn大小順序?yàn)镠N-Sc ＞BJ-Sc ＞BJ-CK ＞HN-CK。HN 菌根苗葉片氣孔導(dǎo)度（Gs）及蒸騰速率（Tr）顯著高于CK。接菌處理對(duì)兩個(gè)種源幼苗葉片的胞間CO2濃度（Ci）及水分利用效率（WUE）均無(wú)顯著影響。兩個(gè)種源間菌根苗葉片的Pn、Gs、Ci及WUE 無(wú)顯著差異，其未接菌栓皮櫟幼苗葉片的Pn、Gs、Ci亦無(wú)顯著差異，HN 的未接菌栓皮櫟幼苗葉片的Tr值顯著低于BJ 種源。

表2 不同處理的葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)及SPAD 值比較Table 2 Comparison of the chlorophyll fluorescence parameters and SPAD values of leaves under different treatments

表3 不同處理的栓皮櫟葉片光合參數(shù)比較Table 3 Comparison of the photosynthetic parameters of the Q.variabilis leaves under different treatments

2.6 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟根尖內(nèi)源激素含量影響

BJ-Sc 的根尖IAA 含量為99.8 ng·g-1，較CK顯著提升12.1%，ABA 含量為96.64 ng·g-1，較CK顯著增加12.2%。HN-Sc 的根尖IAA 和ABA 的含量也顯著高于相應(yīng)的未接菌苗，增幅分別為15.3%和17.4%（P＜0.05）（表4）。接種硬皮馬勃對(duì)兩個(gè)種源栓皮櫟幼苗根尖的GA3及ZR 含量均無(wú)顯著影響，HN-Sc 的IAA 和ZR 含量顯著高于BJSc。兩個(gè)種源間未接菌幼苗根尖的各激素含量無(wú)顯著差異。

表4 不同處理的栓皮櫟根尖內(nèi)源激素含量比較Table 4 Comparison of the endogenous hormone content of Q.variabilis root tips under different treatments

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

植物內(nèi)源激素在調(diào)節(jié)根系生理活動(dòng)方面起著非常重要的作用，報(bào)道顯示，外生菌根真菌能夠誘導(dǎo)植物根尖激素的積累進(jìn)而促進(jìn)細(xì)根的形成[25]。本研究中，Sc 接種處理的BJ 及HN 栓皮櫟幼苗根系內(nèi)IAA 及ABA 含量顯著高于未接種處理。細(xì)根是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官[22]，試驗(yàn)中接種Sc 能夠增加栓皮櫟幼苗的細(xì)根長(zhǎng)度、表面積和體積，擴(kuò)大根系的吸收范圍，且對(duì)北京種源栓皮櫟幼苗根系的促生效果更好。祁金玉等[26]亦研究證明，接種外生菌根真菌褐環(huán)乳牛肝菌（Suillus luteus）能促進(jìn)油松（P.tabuliformis）根系構(gòu)型擴(kuò)張。說(shuō)明ECM 真菌侵染宿主植物根系后，能夠影響宿主植物內(nèi)源激素含量并改變其平衡狀況，促進(jìn)細(xì)根生長(zhǎng)，進(jìn)而能夠更好地適應(yīng)環(huán)境，增強(qiáng)抗逆能力。

更進(jìn)一步而言，根系的擴(kuò)張促進(jìn)了植株對(duì)土壤水分、養(yǎng)分及礦質(zhì)元素的吸收，進(jìn)而影響葉片光合作用[27]。植物葉片的SPAD 值與葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量間均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系[28]，本研究中，菌根苗葉片SPAD 值較對(duì)照高14%以上，反映了接菌能夠增加栓皮櫟葉片的葉綠素含量，這一結(jié)論與徐洪文等[29]證實(shí)接種菌根真菌能夠顯著提高玉米（Zea mays）葉片SPAD 值的結(jié)果一致，這可能是由于接菌促進(jìn)了根系對(duì)N、Mg 等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[30]，為葉綠素的合成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，硬皮馬勃的接種顯著提高了HN栓皮櫟的實(shí)際光化學(xué)效率和PS Ⅱ電子傳遞速率，顯著提升了BJ 和HN 栓皮櫟葉片的凈光合速率，HN-Sc 處理的Pn值最高，達(dá)到7.17 μmol·m-2·s-1，氣孔導(dǎo)度也顯著大于對(duì)照，而細(xì)胞間CO2濃度無(wú)顯著差異，說(shuō)明接菌導(dǎo)致凈光合速率的提升是由非氣孔因素引起的。綜合SPAD、ФPS Ⅱ、ETR、Pn的變化，可以認(rèn)為，接種Sc 能夠提升葉綠素含量，光合色素吸收光能的增加進(jìn)而促進(jìn)了光合電子的傳遞，增強(qiáng)了PS Ⅱ反應(yīng)中心光化學(xué)活性，提高了葉片凈光合速率。

植株根系吸收能力及葉片光合速率的增強(qiáng)，共同促進(jìn)了植株地上部分的生長(zhǎng)[31]。栓皮櫟接種Sc 后，苗高、地徑得到了顯著提高，接種后190d，接菌的BJ 和HN 栓皮櫟苗高分別較對(duì)照提高19.5%和18.9%，地徑分別較對(duì)照提高14.9%和14.4%，表明ECM 真菌能極大促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，與閻秀峰等[32]發(fā)現(xiàn)接種鉚釘菇（Gomphidius viscidus）和臭紅菇（Russula foetens）能夠促進(jìn)遼東櫟（Q.wutaishanica）生長(zhǎng)的結(jié)果相似。7 月，接菌處理和對(duì)照的栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)速率均有不同程度的減緩（圖2），可能是由于夏季高溫，栓皮櫟幼苗正值種子供給營(yíng)養(yǎng)與葉片光合供給營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)換期，在夏季生長(zhǎng)緩慢[33]。BJ 和HN 栓皮櫟未接菌幼苗的蒸騰速率（Tr）及水分利用效率（WUE）出現(xiàn)顯著差異，且Sc 對(duì)兩個(gè)種源栓皮櫟幼苗的根系和光合作用促進(jìn)程度不同，可能是由于不同種源栓皮櫟在不同生境下的適應(yīng)性及對(duì)硬皮馬勃的親和性不同。

3.2 結(jié) 論

綜上研究結(jié)果，接種硬皮馬勃能夠顯著增加北京及河南種源栓皮櫟幼苗根尖內(nèi)IAA 及ABA 含量，促進(jìn)細(xì)根生長(zhǎng)，并進(jìn)一步提高栓皮櫟葉片的SPAD 值，改善葉片光能利用效率，顯著提高幼苗葉片凈光合速率，促進(jìn)栓皮櫟幼苗的生長(zhǎng)。接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟生長(zhǎng)促進(jìn)作用顯著，且對(duì)北京栓皮櫟的根系促生作用優(yōu)于河南，對(duì)河南栓皮櫟的光合作用促進(jìn)效果優(yōu)于北京。