10-羥基-12-十八碳烯酸的靜息細(xì)胞合成

郭前婉，彭舒悅，王晨晨，趙萌*，Michael G.Gaenzle，2

（1 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北工業(yè)大學(xué) 武漢430068 2 阿爾伯塔大學(xué)農(nóng)業(yè)、食品與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)系 加拿大埃德蒙頓 T6G 2P5）

10-HOE 是一種典型的微生物源羥基不飽和脂肪酸，主要通過(guò)亞油酸水合酶催化亞油酸，對(duì)其順9 位雙鍵進(jìn)行羥基化而合成[1-2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，10-HOE 具有良好的真菌抑制效果[3-5]，添加在發(fā)酵面包中其抑菌效果堪比商業(yè)防腐劑[6-7]；對(duì)大腦炎癥有潛在的調(diào)節(jié)和控制作用[8-10]；通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10-HOE 還可有效預(yù)防過(guò)敏性皮炎[11]。10-HOE 在食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用潛力巨大，其高效制備具有重要意義[1，12]。

10-HOE 是微生物合成共軛亞油酸的中間產(chǎn)物，主要是由含有10-亞油酸水合酶的野生菌或重組菌等進(jìn)行生物合成[13-14]，因而可通過(guò)靜息細(xì)胞法進(jìn)行生物合成。靜息細(xì)胞法生物合成的影響因素主要有pH、溫度、輔酶及其濃度、底物及菌體濃度等[15-17]。目前，有研究發(fā)現(xiàn)化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）[18]，短雙歧桿菌（Bifidobacteium breve）[19]，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）[20]，植物乳桿菌（L.plantarum）[20]，嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）[20]，動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalis subsp.Lactis）[20]，漢氏乳桿菌（L.hammesii）[21]，羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）[21]，穗狀左乳桿菌（Levilactobacillus spicheri）[21]等菌具備合成10-HOE 的能力。而與一般的野生菌相比，基因工程菌含有高活性、高特異性的胞內(nèi)酶，可大量表達(dá)目標(biāo)酶，應(yīng)用到靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，不僅可以有效發(fā)揮酶的作用，維持酶的穩(wěn)定性，而且其細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高，產(chǎn)物雜質(zhì)少，處理更簡(jiǎn)單[22-23]，是產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)10-HOE 的有效途徑。

目前，10-HOE 生物合成研究較少[24]，尚未有重組靜息細(xì)胞大量合成10-HOE 的研究報(bào)道。10-HOE 是近年來(lái)研究的一種新型功能性脂肪酸，為探索其各種生物活性，有必要大量生產(chǎn)10-HOE，而靜息細(xì)胞法是10-HOE 生物合成的有效途徑。本文利用含有10-亞油酸水合酶的重組大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）/ pET28a-ZS2058-mcra 對(duì)底物亞油酸進(jìn)行靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成10-HOE，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化pH 值、FAD 濃度、氯化鈉濃度、甘油濃度、酶濃度、底物濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立可高效合成10-HOE 的混合體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘油、乙酸、乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、十五烷酸，Sigma-Aldrich 公司；甲醇、正己烷、異丙醇、2-丙醇，F(xiàn)isher Scientific 公司；卡那霉素，廣州賽國(guó)生物科技有限公司；FAD，上海麥克林生化科技有限公司；亞油酸、三甲基硅重氮甲烷，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C GC/MS 聯(lián)用儀，日本Agilent公司；TS-2102C 型恒溫?fù)u床，常州金壇良友儀器有限公司；BOXUN 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠；AIRTECH 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；XW-80A 旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建、培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌的構(gòu)建：質(zhì)粒來(lái)源于江南大學(xué)，質(zhì)粒名稱為 pET28a -ZS2058 -MCRA（GenBank：JF747255.1）[25]。通過(guò)大腸桿菌 DH5α 和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終獲得可成功表達(dá)10-亞油酸水合酶的大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a-ZS2058-mcra[24]。

LB 液體培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，酵母浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH 7.4～7.6。LB 固體培養(yǎng)基：在上述LB 液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g/L。

將在-80 ℃冷凍保藏的2 mL 大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a-ZS2058-mcra 接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，加入50 mg/L 卡那霉素，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h；按4.0%的接種量轉(zhuǎn)接到新的LB液體培養(yǎng)基中，加入50 mg/L 卡那霉素，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)100 min（OD600nm0.6～0.8），加入0.5 mmol/L IPTG（IPTG 溶液為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)重組細(xì)胞對(duì)10-亞油酸水合酶基因的表達(dá)），繼續(xù)放入搖床中18 ℃、120 r/min 培養(yǎng)24 h。將誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束的重組細(xì)胞培養(yǎng)液在4 ℃、6 000 r/min 離心30 min，倒掉上清液，獲得菌泥，將菌泥分裝在2 mL 離心管中，于-20 ℃下冷凍保藏。

1.3.2 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 在8 mL 白蓋瓶瓶?jī)?nèi)滴加3 mg 亞油酸液體作為反應(yīng)底物，沿瓶壁加入50 mg 菌泥，再加入1 mL 磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5，20 mmol/L），用旋渦混合器震蕩至菌泥混合均勻后，分別在30，35，37，40，45，50 ℃，200 r/min 搖床中培養(yǎng)6 h，研究溫度對(duì)10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響。在確定溫度的基礎(chǔ)上，研究pH 值（pH=5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的磷酸鹽緩沖溶液）對(duì)10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響，其余條件不變。在確定溫度、pH 值的基礎(chǔ)上，加入（0，0.01，0.025，0.05，0.1，0.25 mmol/L）FAD，研究FAD 濃度對(duì)10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響，其余條件不變。在確定溫度、pH、FAD濃度的基礎(chǔ)上，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%，5%，10%）的甲醇、乙醇、正己烷、異丙醇、乙酸乙酯，研究有機(jī)溶劑種類及濃度對(duì)10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響，其余條件不變。在確定溫度、pH 值、FAD 濃度、有機(jī)溶劑種類及濃度的基礎(chǔ)上，加入0，2%，5%，10%，15%，20%甘油，研究甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響，其余條件不變。在確定溫度、pH 值、FAD 濃度、有機(jī)溶劑種類及濃度、甘油的基礎(chǔ) 上，加入0，15，50，100，150，200 mmol/L氯化鈉，研究氯化鈉濃度對(duì)10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響，其余條件不變。在確定溫度、pH 值、FAD 濃度、有機(jī)溶劑種類及濃度、甘油、氯化鈉濃度的基礎(chǔ)上，改變菌質(zhì)量濃度（0，20，50，100，150，200，250 g/L），研究菌濃度對(duì)10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響，其余條件不變。在確定溫度、pH 值、FAD 濃度、有機(jī)溶劑種類及濃度、甘油、氯化鈉、菌濃度的基礎(chǔ)上，改變亞油酸質(zhì)量濃度（4，10，20，30，40，50 g/L），研究亞油酸濃度對(duì)10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響，其余條件不變。在確定最優(yōu)條件后，在該條件下轉(zhuǎn)化6，12，24，72 h，研究10-HOE 轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化。

1.3.3 10-HOE 的提取和甲酯化處理 脂肪酸的提取：培養(yǎng)結(jié)束后，在轉(zhuǎn)化樣品中加入2 mg 十五烷酸作內(nèi)標(biāo)，充分混勻，加入1 mL 異丙醇，旋渦震蕩儀充分震蕩30 s，再加入1 mL 正己烷，充分震蕩30 s，在4 ℃、6 000 g 條件下離心30 min，吸取正己烷層氮?dú)獯蹈?，獲得脂肪酸樣品。

甲酯化：在脂肪酸樣品中加入0.2 mL 重氮甲烷，劇烈振蕩后，在室溫反應(yīng)30 min，加入50 μL乙酸，2 mL 正己烷，2 mL 超純 水和100 μL 0.5 mol/L NaOH 溶液，離心取正己烷層，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后裝入2 mL 氣質(zhì)瓶中。

1.3.4 氣-質(zhì)譜檢測(cè)10-HOE 含量 氣-質(zhì)譜檢測(cè)：安捷倫7890A-5975C。柱型：Agilent 19091S-433，0.25 μm×250 μm×30 m。初始150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升溫至200 ℃，保持10 min，再以4 ℃/min 升溫至240 ℃，保持10 min，分流比10∶1，溶劑延遲3 min，進(jìn)樣器和檢測(cè)器溫度均為240℃，載氣為高純氦氣。

內(nèi)標(biāo)法定量：稱取10 mg 十五烷酸標(biāo)樣（內(nèi)標(biāo)物）、10 mg 亞油酸標(biāo)樣、10 mg 10-HOE，加入1 mL 磷酸鹽緩沖溶液（20 mmol/L，pH 6.5），用上述脂肪酸提取，甲酯化的方法處理，然后進(jìn)行氣-質(zhì)譜檢測(cè)。

1.4 轉(zhuǎn)化率和相對(duì)轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

響應(yīng)因子f 的計(jì)算：

式中，As——內(nèi)標(biāo)物十五烷酸的峰面積（mV×min）；ms——內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量（mg）；Ar——對(duì)照物的峰面積（mV×min）；mr——對(duì)照物的質(zhì)量（mg）。

根據(jù)含內(nèi)標(biāo)物待測(cè)物的色譜峰響應(yīng)值，計(jì)算其含量mi（mg）：

式中，f——校正因子；Ai——待測(cè)物質(zhì)的峰面積（mV×min）；As——內(nèi)標(biāo)物十五烷酸的峰面積（mV×min）；ms——加入內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量（mg）。

10-HOE 轉(zhuǎn)化率αi的計(jì)算：

式中，mi——試樣i 中10-HOE 的甲酯衍生物的質(zhì)量（mg）；m0——試樣i 中所含的亞油酸質(zhì)量（mg）。

相對(duì)轉(zhuǎn)化率αri的計(jì)算：

式中，α1——每組試驗(yàn)中第1 個(gè)試樣（對(duì)照組）中亞油酸的轉(zhuǎn)化率（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 10-HOE 的氣-質(zhì)譜鑒定結(jié)果

靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的氣-質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果如圖1a 所示。通過(guò)譜庫(kù)匹配，除內(nèi)標(biāo)十五烷酸及底物亞油酸外，有新物質(zhì)的生成，新物質(zhì)的質(zhì)譜圖如圖1b 所示。其特征碎片169 m/z 及201 m/z 同文獻(xiàn)[24]，[26]中報(bào)道的10-HOE 質(zhì)譜圖結(jié)果相同，與理論碎片值一致。因而，可以確定該新物質(zhì)為10-HOE。在圖1a 中，10-HOE 的色譜峰很高，說(shuō)明大腸桿菌重組細(xì)胞對(duì)亞油酸有很好的轉(zhuǎn)化能力，可高效合成10-HOE。

圖1 重組大腸桿菌生物合成產(chǎn)物的鑒定Fig.1 Identification of the biosynthesis products of the recombinant E.coli

2.2 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

圖2 顯示不同溫度下靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成10-HOE 的相對(duì)轉(zhuǎn)化率。以30 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化率為100%，當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度37 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，其轉(zhuǎn)化率是30℃的1.5 倍。35，37，40 ℃下的轉(zhuǎn)化率無(wú)明顯差異。當(dāng)溫度大于45 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率急劇下降，僅為最高轉(zhuǎn)化率的10%左右。最適溫度的選擇對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，含有13-亞油酸水合酶的重組菌在40 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化率最高[27]，而對(duì)于含有油酸水合酶的重組菌則在30 ℃時(shí)達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率[28]。溫度對(duì)生物合成具有重要意義，可以通過(guò)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝而影響產(chǎn)物合成[15]，也可直接影響產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化合成。最終選擇37 ℃進(jìn)行后續(xù)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)相對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 The effect of temperature on the conversion yield

2.3 pH 值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

靜息細(xì)胞合成10-HOE 的轉(zhuǎn)化率隨pH 值變化如圖3 所示。隨著pH 值偏向中性，轉(zhuǎn)化率逐漸升高，當(dāng)pH 6.5，7.0 時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值。pH 值繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)化率明顯降低，這有可能是由于10-亞油酸水合酶的活性受到抑制，使轉(zhuǎn)化率降低。不同pH 值條件下酶的活性會(huì)有所差異，pH 值直接影響重組菌的生長(zhǎng)及酶的催化活性、穩(wěn)定性。當(dāng)pH 7.0 時(shí)，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化仍保持高活性，這是由于重組菌的最適生長(zhǎng)pH 范圍為7.4～7.6。與本試驗(yàn)結(jié)果相似的：含有油酸水合酶的重組菌轉(zhuǎn)化油酸合成10-羥基硬脂酸的最適pH 值為7.5[29]，接近大腸桿菌的最適生長(zhǎng)pH 值。最終靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最適pH 值為7.0。

圖3 pH 值對(duì)相對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 The effect of pH on the conversion yield

2.4 優(yōu)化的輔酶因子FAD 濃度

如圖4 所示，隨著FAD 濃度的增加，菌體對(duì)亞油酸的轉(zhuǎn)化率增加，當(dāng)FAD 濃度達(dá)0.25 mmol/L后轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定，相比于未添加FAD 時(shí)轉(zhuǎn)化率增加了5 倍。這是因?yàn)?0-亞油酸水合酶具有輔酶因子依賴性，在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中，添加輔酶因子FAD 有利于10-HOE 的合成。來(lái)源于溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）的油酸水合酶具有更明顯的FAD 依賴性，當(dāng)轉(zhuǎn)化體系不含F(xiàn)AD時(shí)，含油酸水合酶的重組菌不具有催化活性，隨著FAD 濃度的增加，其催化活性增加，當(dāng)FAD 濃度在0.2 mmol/L 以上時(shí)含油酸水合酶的重組菌催化活性達(dá)到穩(wěn)定[30]。輔酶因子可與酶結(jié)合，刺激酶的活性，促進(jìn)酶對(duì)產(chǎn)物的催化合成，參與電子、基團(tuán)等的傳遞，合適的輔酶因子濃度可以增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率[17]。最終最適FAD 濃度為0.25 mmol/L。

圖4 FAD 濃度對(duì)相對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 The effect of the FAD concentration on the conversion yield

2.5 優(yōu)化的有機(jī)溶劑及其濃度

圖5 顯示不同有機(jī)試劑對(duì)菌體轉(zhuǎn)化的影響。在2%添加量的情況下，添加甲醇、乙醇對(duì)轉(zhuǎn)化有抑制作用，而添加乙酸乙酯、異丙醇及正己烷有利于菌體轉(zhuǎn)化，且正己烷效果最好，其轉(zhuǎn)化率約為未添加有機(jī)試劑的3.8 倍。然而，有機(jī)試劑濃度增加到一定值后，菌體的轉(zhuǎn)化率明顯降低。對(duì)于靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化而言，有機(jī)溶劑不僅作為助溶劑提高底物的溶解度，還對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透性化處理來(lái)促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[27]。細(xì)胞透性化處理主要是在改變細(xì)胞膜通透性的同時(shí)，不破壞細(xì)胞整體有機(jī)體系，使得一些小分子和較大分子物質(zhì)能夠自由進(jìn)出細(xì)胞，使胞內(nèi)酶在相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞環(huán)境中充分發(fā)揮作用，提高菌體的催化效率[31]。與趙偉睿等[32]的研究結(jié)果相同，正己烷具有低介電系數(shù)，且疏水性較高，對(duì)酶分子的穩(wěn)定性影響較小，有助于提高酶的催化活性，從而提高了轉(zhuǎn)化率。最終選擇2%的正己烷添加到菌體轉(zhuǎn)化體系。

圖5 有機(jī)試劑對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 The effect of organic reagent on the conversion yield

2.6 優(yōu)化的甘油濃度

據(jù)報(bào)道，有機(jī)溶劑存在時(shí)，甘油對(duì)生物細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，還可為生物細(xì)胞提供一定的熱穩(wěn)定性[33-34]。甘油濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響如圖6 所示。隨著甘油含量的增加，轉(zhuǎn)化率均略有降低，未有明顯的抑制作用。甘油的作用是在冷凍過(guò)程中保護(hù)菌體，不一定有利于菌體的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化率降低可能是由于甘油增加了轉(zhuǎn)化體系的黏度，阻礙了振蕩過(guò)程中菌體與底物的結(jié)合。另一個(gè)原因可能是甘油濃度升高造成高滲透壓環(huán)境，抑制細(xì)胞內(nèi)10-亞油酸水合酶的活性，從而降低菌體合成10-HOE 的轉(zhuǎn)化率。選擇不添加甘油做后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 甘油濃度對(duì)相對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 The effect of the glycerol concentration on the conversion yield

2.7 優(yōu)化的氯化鈉濃度

不同濃度的氯化鈉對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響如圖7 所示。當(dāng)氯化鈉濃度為15 mmol/L 時(shí)，能夠增加轉(zhuǎn)化率，當(dāng)其濃度過(guò)高時(shí)，轉(zhuǎn)化率無(wú)明顯變化。Gandhi 等[35]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)臨界值2.5%時(shí)，會(huì)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，從而影響其催化活性。添加適量的氯化鈉可以維持細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓，滲透壓過(guò)高或過(guò)低均不利于菌的存活及內(nèi)、外物質(zhì)交換[36]。在后續(xù)試驗(yàn)中選擇氯化鈉最適濃度15 mmol/L。

圖7 氯化鈉濃度對(duì)相對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 The effect of the NaCl concentration on the conversion yield

2.8 優(yōu)化的菌濃度

菌濃度對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成10-HOE 轉(zhuǎn)化率的影響如圖8 所示。轉(zhuǎn)化率隨菌濃度的增加而增加，當(dāng)菌質(zhì)量濃度達(dá)200 g/L 后，轉(zhuǎn)化率無(wú)明顯變化。這是由于參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化的菌濃度越高，含有10-亞油酸水合酶越多，合成10-HOE 的能力越強(qiáng)，而當(dāng)菌濃度與底物達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，轉(zhuǎn)化率不再明顯上升。這與13-LHT 全細(xì)胞催化亞油酸合成13-HOE 的結(jié)果相似，13-HOE 濃度隨細(xì)胞濃度的增加而增加，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)量濃度在25 g/L 以上時(shí)趨于穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率約為70.0%[27]。選擇菌質(zhì)量濃度為200 g/L 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖8 菌濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 The effect of the E.coli concentration on the conversion yield

2.9 優(yōu)化底物濃度

細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖9 所示。隨著亞油酸濃度的增加，10-HOE 的轉(zhuǎn)化率呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)亞油酸質(zhì)量濃度為10 g/L 時(shí)，10-HOE 轉(zhuǎn)化率為（68.3±3.9）%；當(dāng)亞油酸濃度增加至20 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率迅速降低，說(shuō)明此時(shí)亞油酸達(dá)到飽和。與13-LHT 細(xì)胞轉(zhuǎn)化亞油酸的結(jié)果類似，產(chǎn)物13-HOE 的濃度隨底物亞油酸濃度的增加而增加，當(dāng)亞油酸質(zhì)量濃度為250 g/L 時(shí)達(dá)到飽和，13-HOE轉(zhuǎn)化率隨亞油酸濃度的增加而慢速減小[27]。據(jù)報(bào)道，底物和產(chǎn)物濃度對(duì)全細(xì)胞催化合成脂肪酸有很大的影響，胞內(nèi)、外的濃度過(guò)高，對(duì)合成有一定的抑制作用[17]。以10 g/L 的亞油酸為底物時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，而以20 g/L 的亞油酸為底物時(shí)，其轉(zhuǎn)化率仍有（50.7±1.6）%。為了提高生產(chǎn)效率，選擇20 g/L亞油酸為底物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖9 亞油酸質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 The effect of linoleic acid concentration on the conversion yield

2.10 轉(zhuǎn)化進(jìn)程曲線

混合體系靜息細(xì)胞合成10-HOE 的轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化如圖10 所示。以20 g/L 亞油酸為底物，加入的細(xì)胞質(zhì)量濃度為200 g/L，隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)化率增加，而轉(zhuǎn)化速率先增大后減小。催化反應(yīng)12 h 內(nèi)轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)最快，轉(zhuǎn)化12 h時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)（62.2±1.7）%，此后轉(zhuǎn)化速率增加速度明顯減小；24 h 時(shí)轉(zhuǎn)化率為（73.1±0.9）%，10-HOE 質(zhì)量濃度為（16.3±0.2）g/L；轉(zhuǎn)化72 h 時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)（81.5±1.3）%。Kishimoto 等[37]利用野生菌副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei JCM 1111），以2 g/L 亞油酸為底物，在pH 6.5、30 ℃條件下轉(zhuǎn)化148 h，10-HOE 的合成轉(zhuǎn)化率達(dá)91%，是目前生物合成10-HOE 產(chǎn)量最高的報(bào)道。本研究利用重組大腸桿菌以20g/L 的底物質(zhì)量濃度在24h 內(nèi)合成率達(dá)73.1%，極大地提升了10-HOE 的生物合成效率。

圖10 最優(yōu)條件下大腸桿菌靜息細(xì)胞法合成10-HOE 的時(shí)間曲線Fig.10 Time-course reaction of 10-HOE biosynthesis using E.coli resting cell system under optimal conditions

3 結(jié)論

通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)混合體系靜息細(xì)胞合成10-HOE 的條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)單因素優(yōu)化，得到混合體系靜息細(xì)胞合成10-HOE 的最佳條件為：20 g/L 亞油酸、pH 7.0 的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液、200 g/L 菌泥、0.25 mmol/L FAD、2%正己烷、15 mmol/L 氯化鈉，恒溫?fù)u床37 ℃、200 r/min 轉(zhuǎn)化24 h，最優(yōu)轉(zhuǎn)化率為（73.1±0.9）%。與初始條件相比，優(yōu)化的靜息細(xì)胞合成10-HOE 的轉(zhuǎn)化率得到很大提升。本文基于混合體系的重組菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法合成10-HOE，方法操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率高，10-HOE 的純度高，為靜息細(xì)胞合成10-HOE 的工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)參考。