LiaX 家族表面蛋白LPL9_0968 在副干酪乳桿菌L9 膽鹽脅迫應激中的作用

王艷美，劉永樂，鄧凱，瑪依熱·奧斯曼，馬夏吟

（長沙理工大學食品與生物工程學院 長沙 410114）

副干酪乳桿菌屬于干酪乳桿菌群，是一種在人類和動物腸道內(nèi)常見的革蘭氏陽性益生菌，被廣泛用于乳制品發(fā)酵中，在干酪發(fā)酵過程中對風味的形成起關鍵性作用[1]。此外，副干酪乳桿菌具有增強人體免疫力，維持腸道微生態(tài)平衡等諸多益生特性[2]。然而，益生乳酸菌在進入人體消化道后會遇到各種各樣的環(huán)境脅迫，如胃酸、胰消化酶及腸道中的膽鹽等[3]，此時益生菌存活率顯著降低。副干酪乳桿菌隨發(fā)酵食品進入人體內(nèi)并最終定植于腸道系統(tǒng)，能否耐受一定程度的膽鹽脅迫是其發(fā)揮益生作用的關鍵。

膽鹽是膽酸形成的不同鈉鹽或鉀鹽的混合物，首先由膽固醇經(jīng)過一系列反應形成初級膽鹽，后轉(zhuǎn)化為次級膽鹽，最后次級膽鹽與甘氨酸或?；撬嵝纬山Y(jié)合型膽鹽，人體中甘氨酸結(jié)合型膽鹽與?；撬峤Y(jié)合型膽鹽的比例約為3∶1[4]。結(jié)合型膽鹽比游離型膽鹽的溶解度更高，兩親性更強，是膽汁中發(fā)揮功能的主要成分。膽鹽作為一種具有較強抗菌活性的物質(zhì)，可通過破壞微生物細胞膜，誘導胞內(nèi)蛋白質(zhì)錯誤折疊及引發(fā)DNA 損傷等途徑發(fā)揮抑菌作用[5-7]，而細胞膜是膽鹽攻擊細菌的首要靶點，低濃度膽鹽會影響細胞膜上蛋白和酶的活性[8]，同時還會改變菌體的表面性質(zhì)，如疏水性和表面電位[9-10]；而高濃度的膽鹽會直接溶解微生物細胞膜，致細胞破裂菌體死亡[11]。腸道益生菌在長期膽鹽脅迫環(huán)境下形成一系列復雜的細胞表面蛋白抗性機制：一些膜轉(zhuǎn)運蛋白能夠?qū)麅?nèi)膽鹽轉(zhuǎn)運到胞外，減輕其對菌體的毒性[12-13]；另有一些膜蛋白，如唾液乳桿菌OppA 蛋白、艱難梭菌跨膜蛋白激酶PrkC、丙二酸桿菌tolC 編碼蛋白具有維持細胞膜結(jié)構(gòu)，減少膽鹽進入，提高細菌耐受能力的功能[14-16]。此外，一些膜蛋白還具有感受膽鹽脅迫，調(diào)控胞內(nèi)膽鹽應激機制的功能，如雙歧桿菌中SenX3-RegX3 雙組分調(diào)控系統(tǒng)[17]。目前大部分關于膽鹽脅迫下表面蛋白的研究僅限于組學推測階段[18-19]，且乳酸菌抵抗膽鹽的機制存在菌株特異性，例如：在膽鹽應激下，唾液乳桿菌（Lacticaseibacillus salivarius）FWXBH36M1 中LSL_1568、LSL_1716 和LSL_1709 的相對表達與LSL_0951相比有顯著變化，這些功能基因在唾液乳桿菌FJLHD9M1 中的相對表達水平呈相反趨勢，其中LSL_0951 表現(xiàn)出比其它基因更高的表達水平[20]。探究乳酸菌表面蛋白在膽鹽脅迫下的抗性機制，對于推動乳酸菌腸道適應機制研究具有十分重要的作用。

副干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）L9（CGMCC No.9800）分離自廣西巴馬長壽老人腸道[21]，具有維持腸道菌群平衡，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，緩解過敏癥狀等益生作用[22-23]。在前期膽鹽脅迫研究中，副干酪乳桿菌 L9 中假定表面蛋白LPL9_0968 所在操縱子基因均顯著上調(diào)（9.67～23.75 倍），為所有差異表達基因中上調(diào)倍數(shù)最高[24]。本試驗通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，LPL9_0968編碼一個屬于LiaX 家族的表面蛋白，目前該家族蛋白僅在糞腸球菌的達托霉素抗性機制中有表述，研究顯示這種表面蛋白可與抗生素結(jié)合，通過調(diào)控胞內(nèi)LiaFSR 系統(tǒng)引起細胞膜結(jié)構(gòu)變化，從而提升糞腸球菌的耐藥性[25-26]。本文通過構(gòu)建突變體及膽鹽脅迫試驗，驗證LPL9_0968 蛋白在L9 膽鹽脅迫抗性機制中的重要作用，探究失去該表面蛋白后，突變菌株對4 種組分膽鹽的敏感性，以及細胞膜表面產(chǎn)生的電位、形態(tài)變化，通過生物信息學分析及模擬分子對接佐證該表面蛋白與膽鹽組分之間結(jié)合方式及作用位點。本文首次探究了LiaX家族的表面蛋白在乳酸菌中的功能，對乳酸菌膽鹽脅迫機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培養(yǎng)基、LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；紅霉素、氨芐西林、FastPurebacterium DNA 試劑 盒、FastPureEndoFree Plasmid 試劑盒、T4 DNA 連接試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；混合牛膽鹽，上海麥克林生化科技有限公司；?；撬崮扄}、?；撬崦撗跄扄}、甘氨酸膽鹽、甘氨酸脫氧膽鹽，美國Sigma 公司；E.coli DH5α，北京擎科生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶，賽默飛世爾科技公司。

電穿孔儀，美國BIO-RAD；納米粒度分析儀，NanoBrook 90plus，美國Bookhaven；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8220），日本JEOL。

1.2 菌株和載體

本研究用菌株和質(zhì)粒列于表1 中。將副干酪乳桿菌L9 在MRS 培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)，大腸桿菌DH5α 在LB 培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中添加10 μg/mL 紅霉素用于篩選副干酪乳桿菌L9 突變株，添加100 μg/mL 氨芐西林用于大腸桿菌DH5α 重組菌株篩選。加入不同濃度的牛混合膽鹽（Ox-bile）和單一組分膽鹽——?；撬崮扄}（TCA）、牛磺酸脫氧膽鹽（TDCA）、甘氨酸膽鹽（GCA）、甘氨酸脫氧膽鹽（GDCA）。

表1 本試驗所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.3 DNA 操作技術(shù)

試驗所用引物均為軟件primer 5 設計（表2）。采用FastPurebacterium DNA 試劑盒提取副干酪乳桿菌L9 的基因組；采用FastPureEndoFree Plasmid 試劑盒提取大腸桿菌的質(zhì)粒；采用Green Taq Mix DNA 聚合酶擴增DNA 片段；采用限制性內(nèi)切酶進行DNA 酶切；用T4 DNA 連接試劑盒進行載體和片段的連接。采用熱休克轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒引入大腸桿菌DH5α[28]，采用電穿孔法將重組質(zhì)粒引入副干酪乳桿菌L9[29]。所有重組菌株均通過DNA 測序（生工生物工程），并用DNAMAN 軟件對測序結(jié)果進行比對分析。

表2 引物序列Table 2 Sequences of oligonucleotide primers

1.4 突變體菌株構(gòu)建

利用同源重組單交換的方法構(gòu)建LPL9_0968基因并插入失活突變體。首先用引物LPL9_0968-F 和LPL9_0968-R 擴增LPL9_0968 基因內(nèi)部長度為400 bp（50～450 bp）的片段作為同源臂，該同源臂片段兩側(cè)包含Xba I 和EcoR I 限制性內(nèi)切酶位點。然后，將所得同源臂片段和質(zhì)粒pUC19E 均用Xba I 和EcoR I 酶切連接，并將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 中，通過氨芐霉素篩選獲得重組菌株，將提取獲得的重組質(zhì)粒命名為pUC19E0968。最后，利用電穿孔法將重組質(zhì)粒pUC19E0968 電轉(zhuǎn)入副干酪乳桿菌L9 中，自殺載體pUC19E0968 在乳酸菌中無法復制，在紅霉素的篩選壓下只能通過同源重組插入LPL9_0968 基因內(nèi)部，導致該基因失活，產(chǎn)生的突變體被命名為LPL9_0968-。在紅霉素耐藥基因內(nèi)部及LPL9_0968 基因組序列下游設計引物（總長2 396 bp），PCR 擴增后測序驗證突變株LPL9_0968-是否構(gòu)建成功。

同時，為了消除培養(yǎng)中紅霉素對突變株菌株后續(xù)膽鹽脅迫試驗產(chǎn)生的影響，選擇構(gòu)建副干酪乳桿菌 L9 菌株α-半乳糖苷酶基因（melA，LPL9_2172）突變株作為對照菌株（LPL9_melA-）。

1.5 膽鹽脅迫試驗

將活化3 代后的LPL9_melA-和LPL9_0968-接種于含紅霉素的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm=0.6，于常溫下8 000×g 離心4 min，收集菌體，棄培養(yǎng)基后將菌體重懸于同體積新鮮MRS 液體培養(yǎng)基中，添加不同濃度的膽鹽。繼續(xù)培養(yǎng)2 h，通過梯度稀釋法進行菌落計數(shù)，以不添加膽鹽組為對照，計算膽鹽脅迫下菌株的存活率。本試驗中添加的膽鹽組分及含量為：混合牛膽鹽（Oxbile；0%，0.025%，0.05%，0.075%）、?；撬崮扄}（TCA；0%，1.0%，2.0%，3.0%）、牛磺酸脫氧膽鹽（TDCA；0%，0.2%，0.4%，0.6%）、甘氨酸膽鹽（GCA；1.0%，2.0%，3.0%）和甘氨酸脫氧膽鹽（GDCA；0%，0.025%，0.05%，0.075%）。所有試驗至少進行3 個生物學重復，每個生物學重復均做3 份技術(shù)平行試驗，用單因素方差分析（ANOVA）來評估數(shù)據(jù)。

1.6 Zeta 電位試驗

Zeta 電位依照Giaouris 等[30]的方法進行測定：將LPL9_melA-和LPL9_0968-在含有紅霉素的MRS 中培養(yǎng)12 h，收集菌體（6 000×g，10 min，4℃），用1.5 mmol/L 的NaCl 清洗菌體兩遍并重懸至OD400nm=0.3。用納米粒度分析儀測量其Zeta 電位數(shù)值。所有試驗至少進行3 個生物學重復，每個生物學重復均進行3 份技術(shù)平行試驗，使用單因素方差分析（ANOVA）來評估數(shù)據(jù)。

1.7 掃描電鏡

將LPL9_melA-和LPL9_0968-培養(yǎng)至OD600nm=0.6，收集菌體，用0.85%的生理鹽水洗滌2 次后，重懸于含膽鹽（0.4% TDCA）的MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h。離心收集菌體，用4%戊二醛在4 ℃下過夜固定。用雙蒸水洗滌3 次，然后，依次用30%，50%，70%，85%，95%，100%的乙醇浸泡13 min，6 000×g 離心5 min，棄上清，再用100%乙醇重復上述操作3 次，使用冷凍干燥機（寧波新芝SCIENTZ-10N）凍干成粉，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行13 萬倍和30 萬倍放大成像。

1.8 生物信息學分析

通過 GenBank 及 KEGG 等數(shù)據(jù)庫對LPL9_0968 基因進行原位分析；用TMHMM server v.2.0 工具分析相關蛋白中的跨膜區(qū)；用NCBI 中的Blast 工具進行蛋白同源序列的分析，并使用MEGA 軟件，采用鄰位相接法設置各分支的置信度，構(gòu)建N-J 系統(tǒng)進化樹。利用ClustalX 軟件對LPL9_0968 相似蛋白序列進行比對，分析其保守位點。

1.9 分子對接

利用I-TASSER（https：//zhanggroup.org//ITASSER/）服務器對LPL9_0968 進行蛋白三維結(jié)構(gòu)建模，在PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載各膽鹽組分的結(jié)構(gòu)文件。以LPL9_0968 編碼蛋白為受體，各膽鹽組分分子為配體，運用Discovery Studio（DS）軟件中CDOCKER 模塊進行分子對接。在分子對接開始前使用DS 中Preparation Protein 對蛋白進行優(yōu)化，Prepare Ligands 對配體進行優(yōu)化，執(zhí)行諸如刪除重復、枚舉異構(gòu)體和互變異構(gòu)體以及生成3D 構(gòu)象等任務。準備結(jié)束后使用CDOCKER 模塊進行對接，設置Pose Cluster Radius 為0.5 以確保對接構(gòu)象盡可能具有多樣性，其余參數(shù)默認。最終數(shù)據(jù)以-CDOCKER ENERGY為主，以-CDOCKER INTERACTION ENERGY 為輔，以Binding Energy、Ligand Energy 等數(shù)據(jù)為參考進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學分析結(jié)果

根據(jù)GenBank 和KEGG 等數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果，副干酪乳桿菌L9 中LPL9_0968 基因所在操縱子的結(jié)構(gòu)如圖1 所示：LPL9_0968、LPL9_0969和LPL9_0970 3 個基因構(gòu)成一個功能未知的操縱子。利用在線工具TMHMM server w.2.0 進行跨膜區(qū)域分析，結(jié)果（圖2），LPL9_0969 和LPL9_0970分別編碼兩個89AA 和111AA 大小的跨膜區(qū)域蛋白，LPL9_0968 編碼的493AA 蛋白則完全位于細胞外側(cè)。通過Blast 進行蛋白序列比對，發(fā)現(xiàn)LPL9_0968 編碼的蛋白屬于LiaX 家族的膜蛋白，用MEGA 7.0 中的Neighorjoining 算法構(gòu)建進化樹，系統(tǒng)發(fā)育關系分析如圖3 所示。LiaX 家族蛋白多存在于腸球菌屬和乳酸菌干酪乳桿菌群中（干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳酪桿菌），在乳酸菌中該蛋白間相似度高達93.59%，而與糞腸球菌中的LiaX 蛋白從進化上看明顯分為兩個亞組，副干酪乳桿菌L9 中LPL9_0968 蛋白與糞腸球菌中的LiaX 蛋白序列相似度高達61.96%。通過ClustalX 序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），LiaX 家族蛋白具有一些明顯的保守區(qū)域，蛋白N 端1～30序列處存在多個保守氨基酸位點。此外，蛋白200～500 序列處也屬于保守氨基酸較多的部分，其中包含多個天冬酰胺和甘氨酸（ng）保守位點。

圖1 LPL9_0968 基因所在操縱子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of the operon where the LPL9_0968 gene is located.

圖2 LPL9_0968、LPL9_0969、LPL9_0970 基因蛋白跨膜區(qū)域分析Fig.2 Analysis of the transmembrane domain in LPL9_0968，LPL9_0969 and LPL9_0970 proteins

圖3 Neighorjoining 法構(gòu)建LiaX 家族蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LiaX proteins constructed by Neighorjoining method

圖4 假定表面蛋白LPL9_0968 與其它乳酸菌和腸球菌中LiaX 蛋白氨基酸序列的多重比對分析Fig.4 Multiple alignment of LPL9_0968 with LiaX proteins from other Lacticaseibacillus and Enterococcus.

目前該家族蛋白僅在糞腸球菌中被報道參與達托霉素抗藥性機制[31]。研究發(fā)現(xiàn)，LiaX 膜蛋白存在胞外游離態(tài)和細胞膜結(jié)合態(tài)兩種狀態(tài)，能夠根據(jù)環(huán)境中的達托霉素信號改變與細胞膜上蛋白的結(jié)合狀態(tài)，從而激活菌體的達托霉素抗性相關基因[25]。推測LPL9_0968、LPL9_0969 和LPL9_0970 3個基因表達的蛋白可能共同構(gòu)成一個細胞膜表面蛋白，其中LPL9_0969 和LPL9_0970 表達的蛋白構(gòu)成跨膜錨定區(qū)域，LPL9_0968 通過與跨膜錨定區(qū)域蛋白相連而位于細胞膜表面。有研究表明，副干酪乳桿菌L9 在膽鹽脅迫下，該操縱子中的3個基因轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)9.67，10.33 倍和23.75倍[24]，表明該表面蛋白很有可能參與副干酪乳桿菌L9 膽鹽脅迫抗性機制。

2.2 突變體的構(gòu)建及膽鹽脅迫

為了研究LPL9_0968 相關基因在副干酪乳桿菌L9 膽鹽脅迫中的作用，利用同源重組單交換的方法構(gòu)建LPL9_0968 基因，插入失活突變株LPL9_0968-，試驗原理見圖5。PCR 擴增及測序結(jié)果表明（數(shù)據(jù)未顯示），自殺載體pUC19E0968 已成功插入副干酪乳桿菌L9 基因組LPL9_0968 基因內(nèi)部，整個操縱子均已失活。同理，本試驗成功構(gòu)建了α-半乳糖苷酶基因melA 突變株LPL9_melA-作為對照菌株。對突變株LPL9_melA-和LPL9_0968-進行混合牛膽鹽脅迫試驗，結(jié)果如圖6 所示：在質(zhì)量分數(shù)0.025%，0.050%和0.075%混合牛膽鹽含量下，LPL9_0968 基因突變株的膽鹽耐受能力均低于對照組，其中質(zhì)量分數(shù)0.075%下LPL9_0968-存活率為4.2%，與對照組相比降低10.17 倍，存在顯著性差異（P＜0.05）。這表明LPL9_0968 及其相關基因所構(gòu)成的表面蛋白在副干酪乳桿菌L9 膽鹽抗性機制中具有重要作用。

圖5 基于同源重組單交換原理構(gòu)建LPL9_0968-基因突變菌株Fig.5 Construction of L.paracasei mutant strain LPL9_0968- based on homologous recombination single crossover

圖6 LPL9_melA- and LPL9_0968- 在?；旌夏扄}脅迫下的存活率Fig.6 Survival rate of recombination strain LPL9_melA- and LPL9_0968- under Ox-bile stress

2.3 單一組分膽鹽脅迫試驗

為了研究該表面蛋白在膽鹽脅迫抗性機制中是否對不同膽鹽組分具有特異性，采用4 種單一膽鹽組分（TCA、TDCA、GCA、GDC）來評估突變株LPL9_melA-和LPL9_0968-的膽鹽耐受能力，結(jié)果見圖7。在4 種單一膽鹽脅迫下，LPL9_0968-存活率與LPL9_melA-相比均出現(xiàn)不同程度的下降，在質(zhì)量分數(shù)3.0%的TCA 中，LPL9_0968-存活率顯著下降1.95 倍（P＜0.05）；在質(zhì)量分數(shù)0.4%的TDCA中，LPL9_0968-存活率顯著下降2.85 倍（P＜0.05）；在質(zhì)量分數(shù)2.0%的GCA 中，LPL9_0968-存活率顯著下降2.05 倍（P＜0.05）；在質(zhì)量分數(shù)0.15%的GDCA 中，LPL9_0968-存活率顯著下降8.21 倍（P＜0.05），下降程度最高。以上結(jié)果表明，試驗菌株和對照菌株對TDCA 和GDCA 的耐受能力明顯低于TCA 和GCA，這與脫氧結(jié)合型膽鹽有更強的毒性有關[32]。此外，在4 種結(jié)合型膽鹽中，突變株對甘氨酸脫氧膽鹽更為敏感，表明LPL9_0968 表面蛋白在菌株膽鹽抗性中對甘氨酸脫氧膽鹽具有特異性。

圖7 LPL9_melA- and LPL9_0968-在單一組分膽鹽脅迫下的存活率Fig.7 Survival rate of mutant strains LPL9_melA- and LPL9_0968- under different kind of bile salt stress

2.4 Zeta 電位

為了進一步探究LPL9_0968 假定表面蛋白在副干酪乳桿菌L9 膽鹽抗性中的作用機制。通過Zeta 電位考察突變菌株表面所帶電荷量的變化，結(jié)果見圖8。LPL9_0968-的表面電位顯著低于LPL9_melA-（P＜0.05），負值增大。這表明LPL9_0968膜蛋白缺失后，菌體的雙電層吸附層的負電荷增加，從而反映菌體表面所帶的正電荷增加，這可能導致膜電位的紊亂，細胞膜穩(wěn)定性降低，菌株的膽鹽耐受能力降低。

圖8 LPL9_melA-和LPL9_0968- Zeta 電位Fig.8 Zeta potential of LPL9_melA- and LPL9_0968-

2.5 掃描電鏡結(jié)果

為了驗證LPL9_0968 蛋白缺失引起的菌體Zeta 電位下降會導致突變株更易受膽鹽的攻擊，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察膽鹽脅迫下LPL9_melA-和LPL9_0968-細胞表面的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖9 所示，經(jīng)2 h，0.4% TDC 的脅迫后，LPL9_0968-菌體表面形態(tài)的完整性明顯差于對照組LPL9_melA-，出現(xiàn)較多的粗糙和萎縮現(xiàn)象（綠色箭頭處）。這表明LPL9_0968-在相同濃度膽鹽脅迫下，細胞膜受損和細胞內(nèi)含物泄露更為嚴重。

圖9 場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察LPL9_melA-和LPL9_0968-膽鹽脅迫下菌體形態(tài)Fig.9 The morphology of LPL9_melA- and LPL9_0968- under bile stress by FESEM.

3 討論

細胞膜是膽鹽攻擊細菌的首要目標，而表面蛋白作為第1 道防線，通過多種機制抵抗膽鹽脅迫，以提高細菌的生存能力[5]。LPL9_0968，LPL9_0969 和LPL9_0970 是副干酪乳桿菌L9 基因組中一組功能未知的假定膜蛋白，在前期膽鹽脅迫相關研究中，該組基因在膽鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)為全基因組中最高。通過構(gòu)建插入失活突變體及膽鹽脅迫試驗，成功證明LPL9_0968相關的假定膜蛋白參與副干酪乳桿菌L9 的膽鹽抗性機制。然而，通過分析可知LPL9_0968 假定蛋白為膜表面蛋白，并不具有膜內(nèi)部分及跨膜轉(zhuǎn)運通道，因此不具有轉(zhuǎn)運膽鹽的能力。

經(jīng)分析比對，LPL9_0968 基因編碼的蛋白屬于LiaX 家族表面蛋白，與糞腸球菌中的LiaX 蛋白具有很高的相似性。LiaX 蛋白在糞腸球菌中是細菌抵抗達托霉素的表面響應蛋白，它能夠感受胞外抗達托霉素分子，通過與細胞表面LiaFSR 調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，激活細胞膜表面的多種蛋白響應機制來修復因外界脅迫而導致的細胞膜完整性受損[25，31，33]。推測副干酪乳桿菌L9 中的LPL9_0968蛋白很可能也通過感受膽鹽信號，調(diào)控相關膜蛋白基因的表達，從而在膽鹽脅迫下維持細胞膜的平衡，抵抗膽鹽脅迫。Zeta 電位結(jié)果反映突變體表面正電荷量增加，而結(jié)合型膽鹽在溶液中會解離成為帶負電的分子，菌體表面正電荷增加可能導致膽鹽分子吸附增多，細胞膜受到更為嚴重的破壞。通過掃描電鏡觀察膽鹽脅迫下的菌體表面，證實了這一結(jié)果，表明LPL9_0968 參與了維持細胞表面電荷穩(wěn)定與細胞膜完整性的過程。

為了進一步探討LPL9_0968 蛋白是否能感受膽鹽分子信號，通過分子對接來考察假定表面蛋白與膽鹽組分的相互作用。通過I-TASSER 網(wǎng)站建立LPL9_0968 蛋白模型（圖10），利用DS 將蛋白與4 種單一膽鹽組分對接，結(jié)果表明：蛋白與膽鹽組分之間存在以氫鍵為主的相互作用（圖11）。4 種膽鹽與LPL9_0968 蛋白對接所產(chǎn)生的結(jié)合能均為負值，說明二者間發(fā)生結(jié)合的可能性很大，且發(fā)生結(jié)合后的狀態(tài)相對穩(wěn)定。LPL9_0968 與GDCA 間還存在電荷之間的吸引力，并且膽鹽分子與LPL9_0968 相互作用的區(qū)域是LiaX 家族蛋白序列300～500 部分氨基酸保守度較高的區(qū)域，該區(qū)域可能與感受環(huán)境信號分子相關，同時也可能控制LiaX 與膜上蛋白結(jié)合或分離。通過比對發(fā)現(xiàn)，LPL9_0969 和LPL9_0970 與糞腸球菌中LiaFSR蛋白相似度并不高，且未在副干酪乳桿菌L9 中找到與之相似的同源蛋白，因此LPL9_0968 感受膽鹽脅迫參與調(diào)控機制尚待探究。

圖10 同源建模Fig.10 Homology modeling

圖11 假定表面蛋白與4 種膽鹽組分模擬分子對接的結(jié)合能及對接結(jié)果2D 示意圖Fig.11 2D schematic diagram of binding energy and docking results between hypothetical surface protein and four simulated bile salt components

4 結(jié)論

本研究首次報道乳酸菌中的LiaX 家族表面蛋白LPL9_0968，采用生物信息學分析對其基因結(jié)構(gòu)、蛋白序列保守性及其與腸球菌中LiaX 家族蛋白的關系進行初步分析，同時探究了LPL9_0968 的功能，確定其參與副干酪乳桿菌L9膽鹽脅迫抗性機制。該蛋白可能通過維持細胞膜的平衡及完整性來提高菌株的膽鹽耐受能力。通過分子對接推測該表面蛋白可能與膽鹽組分存在相互作用，可作為膽鹽脅迫的表面響應蛋白，參與胞內(nèi)未知的調(diào)控。

致謝

感謝長沙理工大學創(chuàng)新項目：假定表面蛋白LPL9_0968 在副干酪乳桿菌L9 膽鹽脅迫應激中的作用對本試驗給予的經(jīng)費支持。