線粒體異常與卵巢儲備功能減退的研究進展

沈浩玥，韓樂，包文秀，曾慧芳，趙志梅

(天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心，天津 300380)

卵巢儲備功能指卵巢內存留卵泡數(shù)量和卵母細胞質量的潛能，受年齡、遺傳、環(huán)境等因素的影響，是影響生殖結局最重要的因素[1]。卵巢儲備功能減退(DOR)是卵巢功能下降的早期階段，指卵巢產生卵母細胞數(shù)量和質量下降，伴有性激素缺乏，主要表現(xiàn)為女性潛在生育力減退、月經不調、閉經等，是女性常見內分泌疾病[2]。近年DOR發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但發(fā)病機制尚不明確，目前推測與遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素有關。

線粒體是真核細胞中的雙細胞膜細胞器，參與許多基本的細胞功能調節(jié)。線粒體功能障礙可以直接或間接影響線粒體呼吸鏈和氧化磷酸化等一系列重要的細胞功能，造成細胞衰老和凋亡，從而導致多種疾病[3]。有假說提出，線粒體活性的調節(jié)是決定生殖能力的關鍵因素[4]。研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙可造成卵母細胞及其周圍卵丘顆粒細胞的功能障礙和凋亡，導致卵泡閉鎖甚至衰竭，引起卵巢儲備功能下降，提示線粒體異常與DOR的發(fā)生和發(fā)展關系密切[5-6]。本文就卵泡發(fā)育過程中卵母細胞及其周圍顆粒細胞線粒體數(shù)量、結構、分布及功能改變導致DOR的機制及通過調控線粒體延緩卵巢衰老展開綜述。

一、線粒體異常與DOR

(一)線粒體數(shù)量減少

不同細胞中線粒體的數(shù)量不同，一般取決于細胞類型和細胞代謝水平。卵母細胞在發(fā)生過程中不斷進行減數(shù)分裂，需消耗大量腺苷三磷酸(ATP)，能量代謝活性較高，是線粒體數(shù)量最為豐富的細胞[7]。隨著卵母細胞成熟，細胞代謝水平及不同階段卵母細胞中線粒體數(shù)量也發(fā)生改變[8]。研究表明，和成熟小鼠卵母細胞中線粒體數(shù)目相比，生育力降低的老年小鼠卵母細胞中線粒體數(shù)目顯著下降。在退化的卵母細胞中，可觀察到卵母細胞線粒體的缺失[9]。另有實驗表明，高齡女性顆粒細胞功能下降伴隨線粒體數(shù)量的缺失，ATP產生能力相對較低[10]。因此，當出現(xiàn)DOR時，會伴隨線粒體數(shù)量的異常，影響線粒體功能，從而導致卵母細胞、胚胎質量下降。

(二)線粒體形態(tài)結構與空間變化

線粒體是雙層膜結構的細胞器，內膜向內褶皺形成“嵴”，線粒體嵴上存在許多線粒體基粒，這些基?？衫煤粑満铣葾TP。能量需求不同的細胞，線粒體嵴的數(shù)目和形態(tài)也不同，一般由含少量管泡狀嵴的橢圓形未成熟線粒體，向含大量板層狀嵴、具有高代謝活性的長條狀成熟線粒體轉變[11]。Liu等[12]在透視電子顯微鏡下觀察到<38歲年齡組和≥38歲年齡組女性卵巢顆粒細胞分別有明顯嵴線粒體和空泡線粒體兩種形態(tài)，與年輕女性顆粒細胞相比，高齡女性細胞中空泡、不完整嵴的線粒體占比更高。

線粒體常分布于能量需求高且代謝活躍的區(qū)域，線粒體分布不規(guī)則是卵母細胞損傷的標志[13]。Tarazona等[14]發(fā)現(xiàn)牛卵母細胞中，未成熟卵母細胞線粒體活性很低，呈彌漫性或不明顯分布；成熟卵母細胞線粒體活性較高，呈彌漫性或胞質周分布。郭虹敏等[15]發(fā)現(xiàn)了小鼠卵母細胞線粒體在卵母細胞成熟過程中經歷了重新分布，即線粒體在由顆粒分散狀分布變?yōu)樵诩毎酥車奂植?。因此，通過觀察卵母細胞及顆粒細胞線粒體的形態(tài)和動態(tài)分布，可推測卵母細胞的質量，為DOR的診斷及治療評估提供依據(jù)。

(三)線粒體遺傳異常

線粒體擁有其獨立的遺傳物質，即線粒體DNA(mtDNA)。mtDNA母系遺傳，即卵母細胞是線粒體將遺傳物質傳遞到下一代的唯一載體[16]。最近有研究發(fā)現(xiàn)了全新的跨代遺傳現(xiàn)象，即由mtDNA水平升高的母系遺傳為介導，誘導后代個體攜帶更高拷貝的mtDNA，使后代繼承母本的線粒體未折疊蛋白反應，在后代中實現(xiàn)代代遺傳[17]，提示mtDNA攜帶細胞代謝和能量產生的重要遺傳信息，是線粒體功能障礙的潛在標志物，可用來衡量卵母細胞發(fā)育潛能，評估卵巢儲備功能。有研究表明，mtDNA拷貝數(shù)變異及結構突變累積可導致線粒體功能障礙和細胞內ATP合成減少，影響卵母細胞的質量，從而影響卵巢儲備功能[18]。

1.mtDNA拷貝數(shù)異常：卵母細胞中mtDNA數(shù)量巨大，成熟卵母細胞含有超過15萬份mtDNA，在著床前沒有被復制，因此mtDNA拷貝數(shù)能較好地反映mtDNA的數(shù)量。mtDNA拷貝數(shù)減少將引起線粒體數(shù)量下降甚至卵母細胞凋亡，使線粒體功能減退，導致卵母細胞因供能不足，無法完成正常生理活動而引起DOR。Benkhalifa等[19]發(fā)現(xiàn)退化卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)與正常卵母細胞相比有顯著性差異，較正常卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)少。Dioguardi等[20]研究表明，DOR患者顆粒細胞中mtDNA拷貝數(shù)顯著降低。Wai等[21]通過在小鼠生殖系發(fā)育的不同階段刪除線粒體類核的重要組成部分線粒體轉錄因子A(Tfam)的一個拷貝，對小鼠mtDNA拷貝數(shù)進行遺傳操作，發(fā)現(xiàn)存在一個mtDNA拷貝數(shù)閾值，當線粒體拷貝數(shù)大于這一閾值時，胚胎可正常發(fā)育；而當小于這一閾值時，則會造成胚胎發(fā)育阻滯。以上結論都表明了mtDNA拷貝數(shù)在卵母細胞發(fā)育中發(fā)揮重要的作用，是評價卵母細胞質量及卵巢儲備功能的重要指標。臨床上可以通過檢測卵母細胞及顆粒細胞線粒體中mtDNA的拷貝數(shù)來評價卵母細胞質量。

2.mtDNA突變/缺失：由于缺乏組蛋白的保護和mtDNA聚合酶γ的校對能力，且鄰近產生大量活性氧(ROS)的電子傳遞鏈，處于高氧脅迫環(huán)境，相比核染色體，mtDNA更容易受到損傷，發(fā)生突變或片段缺失[22]。mtDNA發(fā)生突變或缺失的這種致病性變化可導致DNA轉錄和翻譯缺陷，線粒體呼吸鏈功能受損，從而影響線粒體功能，ATP產生減少，ROS堆積，進一步引起mtDNA的突變或缺失，進入惡性循環(huán)，造成卵母細胞與顆粒細胞的衰老和凋亡。其中，4977 bp是線粒體DNA最常見的缺失基因，趙紅翠等[23]發(fā)現(xiàn)與卵巢儲備功能正常者相比，DOR患者卵母細胞內mtDNA 4977 bp缺失率高，二者有顯著性差異，推測可能因DOR患者卵巢內環(huán)境改變，使卵泡處于相對缺氧的環(huán)境，活性氧產生增加，而導致mtRNA 4977 bp缺失。該片段控制著ATP ase6、ATP ase8、NADH脫氫酶亞基3、ND4L、ND4、ND5等線粒體基因核苷酸，可造成mtDNA編碼的氧化磷酸化相關蛋白的合成損傷[24]。另外，線粒體SIRT3蛋白能夠感知細胞代謝狀態(tài)并在翻譯后改變線粒體蛋白功能，參與壁顆粒細胞與卵丘顆粒細胞代謝。房曉歡等[25]的研究顯示，在DOR患者的顆粒細胞中，SIRT3 mRNA和活性蛋白降低。mtDNA片段的缺失與突變，也為探究DOR的分子機制提供了新的思路。

(四)線粒體自噬的異常

線粒體自噬是細胞內穩(wěn)態(tài)的一個關鍵途徑，當線粒體受損時，它們可以被自噬體選擇性吞噬并融合到溶酶體中降解，從而維持線粒體種群健康和體內平衡[26]。卵母細胞可通過線粒體自噬清除多余或受損的線粒體，因此線粒體自噬與卵母細胞質量密切相關，直接參與影響卵巢儲備功能[27]。Song等[28]研究表明，生殖細胞特異性敲除自噬誘導基因ATG7導致雌性小鼠生育能力低下。ATG7缺失女性的低生育能力是由嚴重的卵泡丟失引起的，這與人類早發(fā)性卵巢功能不全患者相似。這揭示了自噬在調節(jié)卵巢原始卵泡保留中的作用，提示自噬相關基因損傷可能是女性DOR的潛在致病因素。Delcour等[29]利用自噬的經典標志LC3將某些基因與溶酶體降解途徑連接起來，在ATG7和ATG9A變異體與早發(fā)性卵巢功能不全之間建立了功能聯(lián)系，并證明了變異體ATG7和ATG9A導致自噬體生物合成的減少，從而導致自噬的損傷，對原始卵泡保存和卵巢儲備造成了影響。綜上，因各種因素損傷的線粒體可以通過多種途徑對自身進行降解，但由于基因損傷等因素造成線粒體自噬發(fā)生異常時，自噬無法被激活，不能通過負反饋保護卵巢中的卵母細胞及顆粒細胞，影響卵母細胞發(fā)育和顆粒細胞的活力，從而使受損的細胞參與到卵巢儲備功能下降的進程中。

二、從線粒體角度干預DOR

線粒體異常是引起DOR的重要機制，藥物干預或生活方式改善線粒體功能和將功能性線粒體替換到生殖細胞中可作為DOR治療的新思路。目前的治療主要包括藥物治療、線粒體移植及生活方式干預等。

(一)藥物治療

在DOR退行性改變的進程中，從線粒體損傷的各個環(huán)節(jié)入手，用藥物改善線粒體功能，延緩卵母細胞的損傷和衰老，是近年來的研究熱點。輔酶Q10、白藜蘆醇、褪黑素、生長激素、硫酸脫氫表雄酮、α-硫辛酸等都是證實有臨床療效的線粒體營養(yǎng)劑。實驗研究表明，在老年動物模型中補充輔酶Q10可以延緩卵巢儲備的減退，恢復卵母細胞線粒體基因的表達，提高線粒體的活性[30-31]。年齡相關性卵母細胞質量和數(shù)量的下降、卵母細胞特異性基因Pdss2(prenyl diphosphate synthase subunit 2)缺陷動物的卵巢儲備減少，可通過飲食給予輔酶Q10來預防。Zhou等[32]的實驗研究表明，白藜蘆醇可以激活小鼠線粒體選擇性有絲分裂吞噬，防止活性氧的產生，有效地防止排卵后卵母細胞在體內老化。褪黑素可以通過增加SIRT-1蛋白表達、ATP含量和自噬來改善線粒體功能，從而最終改善卵母細胞中線粒體的分布；褪黑素及其代謝產物還可以作為自由基清除劑，降低細胞內ROS并增加總抗氧化能力(TAC)，提高卵母細胞的成熟率，改善高齡小鼠卵母細胞的質量[33]。

(二)線粒體移植

近年來，隨著顯微操作技術的發(fā)展，人工線粒體轉移技術為治療DOR提供了一種新的可能，目前主要有胞漿移植、異體體細胞線粒體移植、自體體細胞線粒體移植3種方式[34]。線粒體移植技術旨在確定線粒體的最佳數(shù)量和細胞組織來源，在體外和體內應用中誘導細胞重編程或組織修復，從而復制線粒體自然運輸過程的各個方面，模仿線粒體的自然轉移。但由于實施難度大、涉及到倫理等問題的存在，該技術并未在臨床廣泛推廣[35]。

(三)生活方式干預

日常的不良生活習慣已成為DOR的重要致病因素，從生活方式角度進行干預，改善線粒體功能，進而延緩DOR進程，將成為DOR防治的重要方面。

1.合理飲食，適量運動：隨著當今社會物質水平的提高，育齡期女性體質量指數(shù)(BMI)值偏高比例逐漸上升，不健康的高熱量飲食及吸煙飲酒等生活習慣也會造成內分泌紊亂，影響卵巢儲備功能。研究表明，脂肪與游離脂肪酸會在肥胖小鼠的卵母細胞及卵丘細胞堆積，線粒體膜電位及ATP含量下降明顯，ROS水平明顯升高，影響卵母細胞正常代謝，造成排卵后卵母細胞的老化，從而影響卵巢儲備功能[36]。通過鍛煉、在飲食中限制卡路里的攝入可顯著減少mtDNA的損傷，維持代謝穩(wěn)態(tài)[37]。改善飲食結構，如低鹽低脂、多吃蔬菜水果、攝入優(yōu)質碳水、規(guī)律飲食等對于改善卵巢儲備功能都有積極影響。另外，運動訓練可促進線粒體的生物合成，是激活線粒體功能的有效刺激，經有氧運動干預后，肥胖大鼠部分腫脹線粒體形態(tài)結構恢復，膜結構完整，逐步恢復正常線粒體功能[38]；但運動訓練應遵循適度原則，過度的運動也會導致線粒體功能受損[39]。

2.調暢情志：現(xiàn)代社會生活節(jié)奏快，育齡期女性工作、生活壓力大，生活不規(guī)律，長期處于緊張焦慮的狀態(tài)，易影響卵巢功能。葛靈玲等[40]研究表明，DOR患者暴躁、憂郁情緒發(fā)生率高于健康女性。研究表明抑郁癥患者線粒體異常廣泛存在，線粒體數(shù)目減少，ATP產生低，mtDNA缺失，形態(tài)上會表現(xiàn)出空泡、腫脹、內嵴排列紊亂或消失等異常[41]。實驗研究表明，心理應激下卵母細胞線粒體分布不均，mtDNA拷貝數(shù)降低，細胞內ATP含量降低，造成卵母細胞線粒體功能受損，影響卵母細胞的生長發(fā)育[42]。因此，調暢情志、改善不良的情緒狀態(tài)也是DOR防治過程的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述，DOR過程中存在線粒體異常，主要包括線粒體數(shù)量、結構和分布、線粒體自噬及線粒體膜電位等的改變，造成卵母細胞及顆粒細胞衰老或發(fā)育不良，最終導致DOR的發(fā)生和發(fā)展。了解線粒體異常在DOR中的機制，有助于制定針對線粒體損傷的精確的治療策略，并將治療關口前移，有效預防和減緩線粒體異常引起的DOR。