草烏甲素閃式提取工藝優(yōu)化及熱穩(wěn)定性研究

付彬彬，龔云麒，周 劍，劉建文，劉軍鋒

(昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650021)

草烏甲素(Bulleyaconitine A，分子式C35H49NO10，相對(duì)分子質(zhì)量643.76)，又名滇西嘟拉堿甲，為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，最早是從毛莨科烏頭屬植物滇西嘟拉(aconitum bulleyanum diels)中分離出的一種具有生物活性的生物堿[1-2]。因具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，草烏甲素現(xiàn)如今作為一種現(xiàn)代植物藥，廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、肩周炎、四肢扭傷等的治療[3-7]。草烏甲素具有鎮(zhèn)痛時(shí)間長(zhǎng)，副作用小，療效明確，且對(duì)器官無明顯損傷等特點(diǎn)。相比于傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痛藥，草烏甲素沒有阿片類鎮(zhèn)痛藥的成癮性及耐受性等副作用，也沒有非甾體消炎藥類鎮(zhèn)痛藥的胃腸道損傷、出血及腎毒性等不良反應(yīng)[8]。

近年來，草烏甲素及其制劑在疼痛治療領(lǐng)域的臨床價(jià)值不斷被認(rèn)可，連續(xù)列入了帶狀皰疹后神經(jīng)痛、神經(jīng)病理性疼痛、腰背痛全國專家共識(shí)推薦用藥。隨著草烏甲素制劑在疼痛病領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，草烏甲素原料藥的需求也在不斷增加。現(xiàn)如今，草烏甲素原料藥主要來源于烏頭屬類植物的提取分離。因此，通過草烏甲素閃式提取工藝優(yōu)化及熱穩(wěn)定性研究，為草烏甲素的提取純化工藝水平的提升提供科學(xué)依據(jù)。

閃式提取是一種新型提取方法，具有提取速度快、提取時(shí)間短、有效成分破壞少等優(yōu)點(diǎn)[9]，其原理是物料在提取器內(nèi)通過高速粉碎、快速攪拌、高速振動(dòng)等方式使有效成分迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡[10]。此次試驗(yàn)以長(zhǎng)喙烏頭粗粉為原料，探究長(zhǎng)喙烏頭閃式提取最佳工藝條件及對(duì)提取液的熱穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

高效液相色譜儀(LC-2030C，日本島津)；JHBE-50T閃式提取器(河南智晶生物科技)；BP221S型分析天平(北京賽多利斯儀器公司)；HWS12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；DFY-1000D型高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

長(zhǎng)喙烏頭(麗江永勝)，草烏甲素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所)，乙腈(色譜級(jí)，上海星可)，磷酸(色譜級(jí)，阿拉丁)，乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(4.6ID×250 mm)，0.2%三乙胺水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.1±0.1)-乙腈(65∶35)為流動(dòng)相;流速 1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm; 柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量:10 μL；理論塔板數(shù)按草烏甲素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[11]。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 草烏甲素對(duì)照品色譜圖

圖2 長(zhǎng)喙烏頭藥材色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取草烏甲素對(duì)照品 11.5 mg，置于 100 mL 量瓶中，加少量 0.1 mol/L 鹽酸溶解后，加水稀釋制成 40 μg/mL 草烏甲素，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取本品粗粉 0.5 g，置予具塞錐形瓶中，加入50%甲醇 50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率 250 W，頻率 35 kHz )30 min，放冷，再稱定質(zhì)量。用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取過濾液，作為供試品溶液。

2.4 儀器精密度試驗(yàn)

以同一份對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣7次，草烏甲素峰平均保留時(shí)間為 12.64 min，RSD=0.36%；平均峰面積697.66，RSD=0.16%。表明儀器重復(fù)性好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

草烏甲素對(duì)照品溶液在 0、2、4、8、12、24、48 h 時(shí)分別測(cè)定，以峰面積計(jì)算RSD，為0.28%。結(jié)果表明，草烏甲素溶液在 48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取草烏甲素對(duì)照品 20.8 mg，加 0.1 mol/L 鹽酸溶解后，加水稀釋定容至 100 mL 容量瓶中，制成儲(chǔ)備液(0.208 mg/mL)。分別精密量取儲(chǔ)備液2.5、3.5、4.0、5.0、5.5、6.5、7.5 mL，分別置予 25 mL 量瓶中，加水稀釋制成一系列梯度濃度的溶液。分別取 10 μL 進(jìn)高效液相色譜儀，波長(zhǎng) 260 nm 處測(cè)定峰面積，以草烏甲素的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算。線性回歸方程為：Y=17.244X-8.820，r=0.9998(n=7)。結(jié)果表明，草烏甲素在 20.8～62.4 μg/mL 范圍內(nèi)，峰面積和質(zhì)量濃度呈良好線性。

3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取工藝

3.1 因素水平設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別考慮乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比例、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以草烏甲素提取率為考察指標(biāo)，確定正交試驗(yàn)的最佳試驗(yàn)方案。見表1。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果詳見表2、表3。

表2 閃式提取法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 閃式提取的方差分析

由草烏甲素方差分析(表3)得出：提取次數(shù)(D)與料液比(B)有顯著性，為顯著因素。直觀分析四個(gè)影響因素大小順序?yàn)镈>B>C>A；其中A2> A1> A3；B3> B2> B1；C3> C1> C2;D3> D2> D1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，長(zhǎng)喙烏頭中草烏甲素閃式提取方案應(yīng)為A2B3C3D3。即：70%乙醇，料液比 1∶8 g/mL，提取時(shí)間 30 min，提取4次。

3.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

如表4所示，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化出的長(zhǎng)喙烏頭閃式提取最佳方案，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得到平均提取率為93.08%，均高于正交實(shí)驗(yàn)9次結(jié)果，證明優(yōu)選出的長(zhǎng)喙烏頭閃式提取工藝效率高、穩(wěn)定、可靠。

表4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 長(zhǎng)喙烏頭提取液熱穩(wěn)定性的考察

將上述驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)得到的長(zhǎng)喙烏頭閃式提取液(20201215批)置于 10 mL 容量瓶中，定容，置于一定溫度(恒溫)水浴鍋內(nèi)靜置保溫，分別在 0、1、2、4、8、12、24 h 時(shí)取出一個(gè)容量瓶，冷卻至室溫，用75%乙醇補(bǔ)充損失體積，重新定容。其中，水浴溫度為 70 ℃、75 ℃、78 ℃。高效液相色譜法檢測(cè)每份容量瓶中草烏甲素的質(zhì)量濃度，結(jié)果如表5所示。

表5 長(zhǎng)喙烏頭提取熱穩(wěn)定性考察結(jié)果

將表5中實(shí)驗(yàn)結(jié)果以時(shí)間為橫坐標(biāo)，草烏甲素質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制出草烏甲素在一定溫度下質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化的趨勢(shì)圖，如圖3所示。

圖3 草烏甲素?zé)岱€(wěn)定性趨勢(shì)圖

從圖3中看出，草烏甲素的質(zhì)量濃度隨著水浴時(shí)間和水浴溫度的增加逐漸降低，在 78 ℃ 條件下，草烏甲素的質(zhì)量濃度在 24 h 內(nèi)下降了85.7%，說明提取液中的草烏甲素具有熱不穩(wěn)定性，不能長(zhǎng)久置于高溫(≥70 ℃)環(huán)境中。但從數(shù)據(jù)也可知，提取液在 75 ℃ 以下環(huán)境中，0～4 h 內(nèi)草烏甲素的質(zhì)量濃度變化不大，為可控范圍。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比例、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察對(duì)象，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到長(zhǎng)喙烏頭閃式提取最佳工藝參數(shù)，即：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%，料液比例 1∶8 mg/L，提取時(shí)間 30 min，提取次數(shù)4次。重復(fù)驗(yàn)證最佳工藝參數(shù)的草烏甲素提取率為93.08%,說明優(yōu)選出的長(zhǎng)喙烏頭閃式提取工藝效率高、穩(wěn)定、可靠。長(zhǎng)喙烏頭提取液熱穩(wěn)定性考察，說明提取液中的草烏甲素具有熱不穩(wěn)定性，不能長(zhǎng)久置于高溫(≥70 ℃)環(huán)境中。

研究結(jié)果提示，在提取、濃縮等工藝步驟中，應(yīng)控制溫度及加熱時(shí)間，以避免草烏甲素降解，閃式提取法因提取時(shí)間短、效率高、提取溫度低等優(yōu)點(diǎn)，在草烏甲素的提取上具有一定的推廣意義。