桑黃有效物的提取應(yīng)用及抑菌性能研究＊

謝曉韋，孫雨晴，陸龍喜，霍進喜，潘新平，胡桂燕＊

（1.浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 311215； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021；3.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310051； 4.浙江菊絲明生物科技有限公司，浙江 嘉興 314500）

桑黃（Phellinus linteus.）是一種寄生在闊葉樹上非常珍貴的藥用真菌，有很高的藥用價值，作為中藥的應(yīng)用歷史悠久，在《神農(nóng)百草經(jīng)》和《本草綱目》中均有記載。中醫(yī)中主要用來治療婦科炎癥和脾虛泄瀉，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑黃具有調(diào)節(jié)免疫抗炎，抗癌等功效[1]；桑黃提取物具有多種生物有效活性成分，如桑黃多酚、多糖、黃酮等，在抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等生物功效[2-4]。痤瘡、濕疹等常見的有損美觀的皮膚癥狀，青少年痤瘡發(fā)病度接近60%，它是由遺傳、內(nèi)分泌、過敏原、微生物等多方面因素引發(fā)，其中細菌、真菌等致病菌在上述問題皮膚中檢出率很高。林麟等對149例濕疹患者進行研究，發(fā)現(xiàn)121例攜帶細菌，其中金黃色葡萄球菌是最為常見的細菌（42.96%）[5]。昝文華等研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡病損中葡萄球菌的檢出率與痤瘡丙酸桿菌接近，且應(yīng)用葡萄球菌菌苗治療痤瘡收到了良好的效果[6]。高峰等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在痤瘡患者中馬拉色菌的帶菌率高達83.57%[7]。以上提示表明，痤瘡、濕疹等常見皮膚病癥與某些細菌感染有關(guān)。

本項目結(jié)合上述兩大因素，通過優(yōu)選提取方法提取人工培養(yǎng)桑黃子實體中桑黃多酚為主的有效活性成分，開展桑黃有效物（多酚-桑黃醇溶組分中的主要成分）的抑菌作用及機理研究，并應(yīng)用在抑菌抗菌產(chǎn)品和化妝品中，研發(fā)了“菊絲明皮膚抑菌霜”和“桑黃祛痘護膚膜”，并分別進行動物抑菌試驗和人體皮膚療效觀察試驗，觀察產(chǎn)品的抑菌性能和問題皮膚的治療效果，為桑黃有效物的開發(fā)應(yīng)用提供更廣寬的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料

桑黃由浙江省農(nóng)科院蠶桑與茶葉研究所提供，桑黃有效物由本學(xué)科的實驗室提??；蠶繭由浙江省農(nóng)科院蠶茶研究所提供，絲膠蛋白液由本學(xué)科的實驗室水解；聚乙烯醇、卡波爾、丙三醇、脂肪醇、脂肪酸酯、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、菌種、凈化水等輔料，由杭州仁裕貿(mào)易有限公司和杭州高琦化妝品有限公司提供。

1.1.2 儀器

主要實驗儀器：臭氧發(fā)生器，廣州佳環(huán)電器科學(xué)有限公司；超聲波提取罐，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；灌裝設(shè)備，無錫市靈美日用化工機械廠；輔助設(shè)備：目篩、紫外線消毒燈、電子天平、水浴鍋、烘箱、培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)品制備工藝流程

利用浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主培育的桑黃子實體，經(jīng)粉碎，浸提，超聲波處理，過濾，濃縮后，得到精制桑黃多酚有效物；絲膠繭經(jīng)脫膠、生物降解，過濾，濃縮，得到精制的絲膠蛋白液；凈化水和輔料加熱溶解，然后加入桑黃多酚有效物和絲膠蛋白液，分別經(jīng)均質(zhì)乳化和混合攪拌，冷卻靜止，得到桑黃抑菌霜和桑黃絲膠蛋白祛痘膜產(chǎn)品。其工藝流程如圖1所示。

圖1 提取和應(yīng)用試驗工藝流程Figure 1 Extraction and Application Test Process Flow

1.2.2 桑黃多酚的提取純化

將干燥桑黃子實體粉碎過80目篩，取樣本4份，分別用水、75%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯按1 g∶10 mL浸提，并在60℃水浴中超聲波（100 Hz）處理5 h，然后將不同溶劑處理獲得的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除溶劑成份，至小體積獲得提取液，65℃烘箱中烘干，獲得桑黃多酚粗提物。桑黃多酚的純化方法如下：稱取100 g活化的D101大孔樹脂加入錐形瓶中，加入無水乙醇浸過樹脂，完全吸收后補充去離子水，靜置15 min后傾倒醇水溶液，繼續(xù)加入去離子水后傾倒醇水溶液，此反復(fù)洗滌至無醇味，用濾紙吸干樹脂表面的水分。向錐形瓶內(nèi)加入2 g/L的多酚提取物溶液，密封置于搖床內(nèi)室溫下120 r/min振蕩24 h。傾出上清，樹脂用超純水沖洗5遍，然后用95%乙醇洗脫樹脂，直至洗脫液顏色較為澄清。合并洗脫液，用旋蒸儀濃縮至小體積后置于65℃烘箱中烘干，獲得純化后的桑黃多酚。

1.2.3 總酚含量測定

準確稱量提取物100 mg，加入2 mL相應(yīng)提取試劑充分溶解，用水稀釋至10 mL后，取溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入福林酚試劑1 mL，加水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，離心，取上清液，以相應(yīng)的試劑為空白，在760 nm的波長處測定吸光度。以沒食子酸為標準品，繪制標準曲線。樣品中的多酚含量用沒食子酸當量表示。

2 試驗結(jié)果

2.1 桑黃不同溶劑提取物的得率及多酚含量

由表1可知：采用水、75%乙醇為溶劑浸提，粗提物得率和多酚得率均較高；綜合提取成本、操作方便程度、環(huán)保等因素，以水、75%乙醇為溶劑浸提容易規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

表1 不同溶劑對桑黃多酚的提取效果Table1 Polyphenol Content of Different Solvent Extracts

2.2 桑黃乙醇提取物的抑菌作用

桑黃乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用，在0.02 g/mL質(zhì)量濃度下對金黃色葡萄球菌的抑制率達到93.6%，對大腸桿菌的抑制率為89.9%；在0.0667 g/mL質(zhì)量濃度下對金黃色葡萄球菌的抑制率可達100%。

2.3 “菊絲明皮膚抑菌霜”的抑菌作用

依據(jù)GB15979—2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》的要求，產(chǎn)品抑菌率≥50%才符合標準。選用試驗菌株為大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、白色念珠菌ATCC 10231，中和劑為D/E中和肉湯，消毒液為原液。在檢測樣品“菊絲明皮膚抑菌霜”原液和對照樣品無菌水上滴加菌懸液0.1 mL，混勻作用至預(yù)定時間，適當稀釋，做活菌菌落計數(shù)。菊絲明皮膚抑菌霜樣品對試驗菌株的抑菌效果見表2所示。采用添加了桑黃提取物的菊絲明?皮膚抑菌霜樣品原液，經(jīng)檢測，在作用時間為2 min、5 min、10 min、20 min時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌率均大于99.9%，該樣品對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均有較強抑菌作用。

表2 菊絲明皮膚抑菌霜的抑菌作用Table 2 Antibacterial Effect of Jusiming Skin Antibacterial Cream

2.4 桑黃絲膠蛋白祛痘護膚膜人體功效評價

2021～2022年期間，本課題組人員將實驗室研制的桑黃絲膠蛋白祛痘護膚膜100余盒，免費提供給我院內(nèi)外的粉刺、痤瘡患者試用，目前收回試用報告30余份，其中女性21名，男性9名，年齡最小的16歲，最大的83歲，粉刺、痤瘡患者在16～30歲之間，病期3年以上；色素沉著、黃褐斑、手足皸裂患者在30歲以上，病期大于10年。使用方法：洗臉后將桑黃絲膠蛋白祛痘護膚膜輕輕涂在面部和皮膚皸裂處，約30 min左右待膏體成膜后，用手揭去膜層；粉刺、痤瘡患者2 d～3 d使用一次，色素沉著、黃褐斑、手足皸裂患者每日使用一次；每周觀察一次，持續(xù)觀察一個月。療效判斷標準：顯效，癥狀明顯消退，自我感覺癥狀顯著減輕；有效，癥狀不同程度消退，自我感覺癥狀減輕；無效：癥狀無改善。經(jīng)初步觀察，試用效果總結(jié)如表3所示。桑黃絲膠蛋白祛痘護膚膜對粉刺、痤瘡色素沉著、黃褐斑、手足皸裂均有一定的效果。

表3 桑黃絲膠蛋白祛痘護膚膜人體療效觀察結(jié)果Table3 Human Skin Efficacy Observation Results of Phellinus Anti-acne Skin Care Mask

3 結(jié)論

綜合提取成本、操作便易程度、環(huán)境保護、提取物安全性能等因素，我們最后選擇75%乙醇為溶劑浸提，這套工藝方法容易規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。試驗結(jié)果表明桑黃乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用。研制成功的抗（抑）菌產(chǎn)品菊絲明?皮膚抑菌霜具有抑菌性能，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均有較強抑菌作用。痤瘡、粉刺是年輕人面部常見的皮膚疾病，因青春期人體內(nèi)雄性激素水平較高，從而引起皮膚皮脂分泌過多，毛孔中堵塞，排泄不暢，導(dǎo)致細菌感染，發(fā)生皮膚炎癥。桑黃有效物多酚等成份，具有消炎、抗炎、活血、生肌的作用。本研究經(jīng)人體功效評價結(jié)果表明，桑黃絲膠蛋白祛痘護膚膜對粉刺、痤瘡色素沉著、黃褐斑、手足皸裂有一定的效果。外用桑黃絲膠蛋白祛痘護膚膜后，液體面膜使用后滲透入毛孔內(nèi)，留在表面的部份在30分鐘內(nèi)慢慢干燥，讓皮膚表面形成局部“封包”狀態(tài)，促進面膜中的桑黃等有效成人的吸收；液體面膜干燥后，洗除或撕掉時，同時去除了皮膚表面和毛孔中的不潔物質(zhì)，保持毛孔暢通，最終使痤瘡、粉刺慢慢治愈。因此，結(jié)合桑黃的實際特性，筆者認為桑黃乙醇提取物在抑菌產(chǎn)品和護膚品中添加應(yīng)用存在較大的可能性，可以進一步研究，以擴大桑黃的應(yīng)用范圍，延伸桑黃多元化利用產(chǎn)業(yè)鏈，創(chuàng)造更多更大的社會經(jīng)濟效益。