棕色化和白色化條件下脂肪組織KLF7的差異表達(dá)分析

唐意涵，馬丁凌，梁毛迪，袁成鋼，李夢(mèng)環(huán)，侯艷婷，孫超月，張君

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000)

肥胖已成為一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題，并且與心血管疾病和2型糖尿病等疾病密切相關(guān)[1]。肥胖主要是由于機(jī)體能量的攝入量長(zhǎng)期大于消耗量，多余的能量以甘油三酯的形式儲(chǔ)存在脂肪組織中而導(dǎo)致[2]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為哺乳動(dòng)物有兩種脂肪組織：白色脂肪組織(White adipse tissue, WAT)和棕色脂肪組織(Brown adipose tissue, BAT)。其中白色脂肪組織最為常見(jiàn)，并發(fā)現(xiàn)作為皮下組織，分布在腹部、大腿和腰部，而棕色脂肪組織主要分布在血管周?chē)?、心外膜、腎上腺和肩胛區(qū)[3]。棕色脂肪組織和白色脂肪組織在形態(tài)和功能上完全不同。白色脂肪組織是儲(chǔ)存過(guò)剩能量的主要組織，有較少的線粒體和大脂滴，能將體內(nèi)過(guò)多的能量以甘油三酯的形式儲(chǔ)存起來(lái)，當(dāng)能量缺乏時(shí)，水解為游離脂肪酸釋放入血循環(huán)，以供產(chǎn)能。棕色脂肪組織是一種耗能組織，有更多的線粒體和小脂滴，其線粒體富含解偶聯(lián)蛋白1(Uncoupling protein 1, UCP1)，可以跨過(guò)線粒體內(nèi)膜運(yùn)輸質(zhì)子，破壞氧化磷酸化，而機(jī)體對(duì)ATP的需求迫使更多脂肪分解，實(shí)現(xiàn)非顫抖性產(chǎn)熱[4-6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在寒冷、運(yùn)動(dòng)刺激或β3腎上腺素受體激動(dòng)劑作用下，可以促進(jìn)UCP1和過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子1α(Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α)等產(chǎn)熱基因的表達(dá)，并且白色脂肪組織中UCP1陽(yáng)性脂肪細(xì)胞數(shù)量會(huì)明顯增加，并發(fā)揮類似于棕色脂肪的產(chǎn)熱作用，其被稱為“米色脂肪細(xì)胞”(Beige adipocyte)[7]。米色脂肪細(xì)胞可以增加能量代謝，產(chǎn)生減肥效應(yīng)，并由于米色脂肪細(xì)胞來(lái)源于白色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，因此將這一過(guò)程稱為白色脂肪棕色化[8-11]。而熱中性環(huán)境可以使棕色脂肪失活，向白色脂肪轉(zhuǎn)變[12]。

Krüppel樣因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一類含鋅指的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和程序性死亡。其功能的改變與許多人類疾病的病理生物學(xué)有關(guān)，包括心血管疾病、代謝紊亂和癌癥[13]。KLF7對(duì)包括瘦素在內(nèi)的多種脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)有抑制作用，并且是哺乳動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子，基因多態(tài)性和關(guān)聯(lián)分析顯示，KLF7還是糖尿病和肥胖癥的相關(guān)基因[14-16]。而KLF7是否在白色脂肪棕色化過(guò)程發(fā)揮作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

為此，本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)建立肥胖小鼠模型，觀察白色脂肪棕色化過(guò)程中棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織中KLF7蛋白表達(dá)情況，為深入揭示KLF7的調(diào)控功能和生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選擇4周齡C57BL/6雄性小鼠36只，購(gòu)自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司，飼養(yǎng)于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將小鼠按體重隨機(jī)分為普通飲食組(normal diet, ND)(n=6)和高脂飲食組(high-fat diet, HFD)(n=30)。分組喂養(yǎng)8周成功構(gòu)建飲食誘導(dǎo)的肥胖模型后，將高質(zhì)飲食組小鼠隨機(jī)分為室溫組(n=6)、4 ℃冷刺激處理組(n=6)、32 ℃熱中性處理組(n=6)、生理鹽水處理組(Saline)(n=6)和β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理組(CL316,243)(n=6)。本研究經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(編號(hào)：A2019-086-01)。

1.2 小鼠肥胖模型的建立

2組C57BL/6小鼠均分籠喂養(yǎng)，普通飲食組飼以基礎(chǔ)飼料(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司提供)，高脂飲食組飼以高脂飼料(60%脂肪)。每天更換飲用水，隔日清理糞便，每天監(jiān)測(cè)小鼠飲食量、每周測(cè)量小鼠體長(zhǎng)和體重1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電子分析天平(中國(guó)賽多利斯公司)、動(dòng)物恒溫培養(yǎng)箱、Western blot電泳儀(Bio-Rad公司)、高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司)、超低溫冰箱(Thermo公司)、血糖儀(瑞士羅氏公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

CL316,243、UCP1抗體、PGC-1α抗體和KLF7抗體購(gòu)于Abcam公司，β-Tubulin抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司, 生理鹽水(saline)購(gòu)于新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司。

1.5 方法

1.5.1 給藥方法及劑量

室溫組小鼠置于25 ℃環(huán)境7 d，4 ℃冷刺激處理組小鼠置于4 ℃環(huán)境7 d，32 ℃熱中性處理組小鼠置于32 ℃動(dòng)物飼養(yǎng)恒溫箱7 d，β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理組每日按照1 mg·kg-1腹腔注射β3腎上腺上腺素能受體激動(dòng)劑CL316,243 處理7 d, 生理鹽水處理組小鼠每日腹腔注射等量生理鹽水。

1.5.2 攝入量的測(cè)定

當(dāng)日稱量加入小鼠飼料重量，次日同時(shí)稱量剩余飼料重量，通過(guò)計(jì)算，得出小鼠每日的食物攝入量。

1.5.3 樣本收集

處理7 d結(jié)束后，解剖分離小鼠棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織并稱重，將脂肪組織迅速放入-80 ℃冰箱凍存，用于后續(xù)測(cè)定KLF7蛋白表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)首先需進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)選擇非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(數(shù)據(jù)以中位數(shù)呈現(xiàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重比較

如圖1所示，分組喂養(yǎng)8周后，高脂飲食組小鼠體重顯著高于普通飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖1 普通飲食組(ND)與高脂飲食組(HFD)小鼠體重(A)和大體形態(tài)(B)比較

2.2 棕色化和白色化條件對(duì)小鼠體重、攝食量和血糖的影響

如圖2所示，不同處理組小鼠各自處理7 d后，通過(guò)對(duì)小鼠體重稱量發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理組和32 ℃熱中性處理組沒(méi)有差異顯著性，而4 ℃冷刺激組小鼠體重顯著降低，并且血糖顯著升高。與對(duì)照組相比，β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理組和4 ℃冷刺激組小鼠攝食量沒(méi)有差異顯著性，而32 ℃熱中性處理組小鼠攝食量顯著減少。

圖2 棕色化和白色化條件對(duì)小鼠體重體重(A)、血糖(B)和攝食量(C)的影響

2.3 棕色化和白色化條件對(duì)小鼠脂肪組織重量和形態(tài)的影響

如圖3所示，通過(guò)完整的分離棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織，并進(jìn)行稱量計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理組和32 ℃熱中性處理組小鼠附睪白色脂肪組織重量顯著降低，4 ℃冷刺激處理組小鼠棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織重量均顯著降低。

隨后與對(duì)照組相比，β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑和4 ℃冷刺激處理可使小鼠棕色脂肪組織顏色更深。

圖3 棕色化和白色化條件對(duì)小鼠3種脂肪組織重量(A)和形態(tài)(B)的影響

2.4 3種脂肪組織中KLF7蛋白表達(dá)水平差異

如圖4所示，完整分離對(duì)照組小鼠的棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PGC-1α、UCP1和KLF7的蛋白含量在棕色組織組織中含量最高。

2.5 高脂飲食與普通飲食小鼠脂肪組織中KLF7表達(dá)差異

如圖5所示，高脂飲食喂養(yǎng)八周后，完整分離高脂飲食和普通飲食組小鼠的棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)普通飲食組小鼠的棕色脂肪組織和腹股溝白色脂肪組織中PGC-1α和UCP1含量升高，而高脂飲食組小鼠的棕色脂肪組織和腹股溝白色脂肪組織中KLF7含量升高。

圖4 小鼠棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織中KLF7蛋白表達(dá)水平

圖5 高脂飲食與普通飲食小鼠棕色脂肪組織(A)、腹股溝白色脂肪組織(B)和附睪白色脂肪組織(C)中KLF7蛋白表達(dá)差異

2.6 β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理對(duì)小鼠脂肪組織中KLF7表達(dá)的影響

如圖6所示，完整分離對(duì)照組和CL316，243處理小鼠的棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)UCP1和KLF7會(huì)因β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理而升高。

圖6 β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑對(duì)高脂飲食小鼠棕色脂肪組織(A)、腹股溝白色脂肪組織(B)和附睪白色脂肪組織(C)中KLF7表達(dá)的影響

2.7 4 ℃冷刺激和32 ℃熱中性處理對(duì)小鼠脂肪組織中KLF7表達(dá)的影響

如圖7所示，完整的分離室溫處理組、4 ℃冷刺激處理組和32 ℃熱中性處理組小鼠的棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與室溫組小鼠相比，UCP1、PGC-1α和KLF7會(huì)因4 ℃冷刺激而升高，而32 ℃熱中性條件下會(huì)使UCP1、PGC-1α和KLF7降低。

圖7 4 ℃冷刺激和32 ℃熱中性條件下對(duì)高脂飲食小鼠棕色脂肪組織(A)、腹股溝白色脂肪組織(B)和附睪白色脂肪組織(C)中KLF7表達(dá)的影響

3 討論

肥胖源于能量攝入和能量消耗之間的長(zhǎng)期不平衡，并且與心血管疾病、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病密切相關(guān)[17]。白色脂肪組織可儲(chǔ)存多余的能量，棕色和米色脂肪組織可以產(chǎn)熱，并以熱量的形式消耗能量。已有研究表明，成年人中存在活躍的棕色脂肪組織，并且其與較低的體重指數(shù)(BMI)、較低的年齡、較低的室外溫度、女性性別和較低的血糖水平有關(guān)[18]。因此，促進(jìn)白色脂肪棕色化對(duì)于治療肥胖及相關(guān)代謝性疾病具有廣闊的應(yīng)用前景。

轉(zhuǎn)錄因子KLF7 具有核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)，能夠與入核載體結(jié)合，通過(guò)核孔復(fù)合體運(yùn)送至細(xì)胞核。KLF7 蛋白羧基端具有保守的 3 個(gè) C2H2 型鋅指結(jié)構(gòu)域[19]，可以結(jié)合靶 DNA 的 CACCC 基序或富含 GC 的序列，調(diào)控靶基因表達(dá)[20]。KLF7在脂肪、胰腺、肝臟和骨骼等組織均表達(dá)。已有研究表明，KLF7在胰島β細(xì)胞中抑制胰島素的表達(dá)和釋放；在脂肪細(xì)胞中能夠抑制脂聯(lián)素和瘦素的合成，促進(jìn)炎癥因子IL-6的釋放[16]。并且KLF7還是是哺乳動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子，KLF7的表達(dá)在3T3-L1脂肪細(xì)胞分化時(shí)降低，并且KLF7過(guò)表達(dá)會(huì)抑制脂肪生成。類似地，KLF7在人前脂肪細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制了其向脂肪細(xì)胞的分化，并降低了脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)[13]。本研究的結(jié)果顯示，棕色化條件下如β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理和4 ℃冷刺激處理可在不改變小鼠飲食量情況下，其棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織的重量均呈降低趨勢(shì)，并且促進(jìn)KLF7的表達(dá)增加，與UCP1呈同步變化，提示KLF7可能在白色脂肪棕色化過(guò)程發(fā)揮抑制脂肪細(xì)胞分化和脂肪合成的作用，同時(shí)KLF7作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是否能轉(zhuǎn)錄激活UCP1有待進(jìn)一步研究。