參花外用顆粒皮膚用藥安全性評價

喻 琴，侯 巖，朱聰聰，陳 亞，連天雁，陳中建，朱全剛

(上海市皮膚病醫(yī)院/上海中藥外用制劑創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，上海 200443)

銀屑病是一種以鱗屑性紅斑為特征的慢性炎癥性皮膚病,主要分為尋常型、關(guān)節(jié)病型、膿皰型和紅皮病型，其中尋常型約占銀屑病的97.98%[1]。銀屑病病因復(fù)雜，發(fā)病機制尚不明確，全球發(fā)病率可高達(dá)2%，且有逐年增高的趨勢[2]。該病常伴瘙癢，遷延不愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，尚無徹底根治的藥物及方法，主要是減輕皮損及瘙癢等癥狀，控制及穩(wěn)定病情，減少銀屑病相關(guān)的并發(fā)癥，提高患者生活質(zhì)量[3-4]。中醫(yī)辨證論治銀屑病越來越受到關(guān)注，大量研究認(rèn)為中西醫(yī)結(jié)合治療能顯著降低該病復(fù)發(fā)率，整體治療效果更好，且不良反應(yīng)少[5-6]。參花外用顆粒原名中浴1號，由苦參、花椒、野菊花、生側(cè)柏葉組成，具有清熱解毒、除濕止癢的功效，主要用于尋常型銀屑病等多種炎癥性皮膚病的治療。該方在上海市皮膚病醫(yī)院臨床應(yīng)用已逾10年，效果顯著，目前該院對該方進(jìn)行劑型優(yōu)化，由傳統(tǒng)洗劑開發(fā)為使用攜帶方便、穩(wěn)定性更好的顆粒劑即參花外用顆粒，但尚未對其進(jìn)行系統(tǒng)的安全性評價。故本實驗參考國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒發(fā)的《中藥、天然藥物局部刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》和《中藥天然藥物免疫毒性(過敏性、光過敏反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》等，對參花外用顆粒外用的安全性進(jìn)行了評價，以為其開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 7～8周齡健康豚鼠，雌雄各半，體重250～300 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2018-0004。動物飼養(yǎng)于上海市皮膚病醫(yī)院動物房，溫度22～26 ℃，相對濕度40%～65%，噪聲≤50 dB。本實驗經(jīng)上海市皮膚病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[2021-108(動)預(yù)]，并按照機構(gòu)指南進(jìn)行。

1.2藥物與試劑 參花外用顆粒，由上海市皮膚病醫(yī)院委托上海寶龍藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：2108001。制備方法：取處方量苦參、野菊花、生側(cè)柏葉、花椒，每次加6倍量水，煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，煎液濾過、合并，靜置24 h，取上清液，濃縮至相對密度為1.25(70～90 ℃)的清膏，加入適量糊精，混勻，制粒，干燥，制成顆粒即得。參花外用顆粒臨床藥浴使用濃度的生藥比為0.5%，即臨床使用濃度，藥液配置方法：稱取適量顆粒，加蒸餾水配置成生藥比為0.5%的藥液；最大濃度即400倍臨床使用濃度，藥液配置方法：稱取適量顆粒，加蒸餾水配置成生藥比為200%的藥液。2,4-二硝基氯苯購自美國Sigma公司。

1.3實驗方法

1.3.1參花外用顆粒的皮膚刺激性試驗 將20只豚鼠隨機分為臨床使用濃度完整皮膚組、臨床使用濃度破損皮膚組、最大濃度完整皮膚組、最大濃度破損皮膚組及空白對照組，每組4只，雌雄各半。

1.3.1.1單次給藥皮膚刺激性試驗 采用自體背部左右側(cè)對比方法進(jìn)行：實驗前24 h在豚鼠背部脊柱兩側(cè)建立范圍為3 cm×3 cm的脫毛區(qū)，分別作為給藥區(qū)和對照區(qū)。破損皮膚組用無菌針頭于脫毛區(qū)劃“#”字，以表皮出血絲、不傷及皮下組織為度。除空白對照組外，其他各組豚鼠給藥區(qū)均涂抹參花外用顆粒藥液200 μL，對照區(qū)涂抹等量蒸餾水，涂抹面積為2 cm×2 cm，覆蓋消毒紗布后用無刺激性膠布固定。單次給藥24 h后，用溫水清洗去除殘留藥液。觀察給藥后1 h、24 h、48 h、72 h給藥部位皮膚有無紅斑、水腫等情況，并參照文獻(xiàn)[7]中“皮膚刺激反應(yīng)評分及刺激強度評價標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行評分。

1.3.1.2多次給藥皮膚刺激性試驗 操作方法與單次給藥皮膚刺激性試驗相同，每天于同一部位給藥1次，每次6 h，連續(xù)14 d。從第2天開始，每次給藥前剪毛，用溫水清洗去除殘留藥物，1 h后觀察結(jié)果，并進(jìn)行皮膚刺激反應(yīng)評分及皮膚刺激強度評價。末次給藥停藥后1 h、24 h、48 h、72 h觀察給藥部位皮膚有無紅斑、水腫、潰爛等現(xiàn)象，并進(jìn)行皮膚刺激反應(yīng)評分及皮膚刺激強度評價。

1.3.2參花外用顆粒的急性毒性反應(yīng) 多次給藥皮膚刺激性試驗期間，每日稱豚鼠體重，記錄體重增長情況。試驗結(jié)束后取豚鼠腹主動脈血液、受試部位皮膚及主要臟器組織。稱量心、肝、肺、腎、脾組織重量，計算各臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100；對受試部位皮膚及臟器組織進(jìn)行石蠟切片，HE染色觀察；對腹主動脈血樣離心取血清，用深圳雷杜生命科技(Chemray 240)全自動生化分析儀測定肝功能指標(biāo)[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)]及腎功能指標(biāo)[血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)]水平。

1.3.3參花外用顆粒的皮膚過敏試驗 將16只豚鼠隨機分為蒸餾水組、參花外用顆粒臨床使用濃度組、參花外用顆粒最大濃度組、2,4-二硝基氯苯組(致敏濃度為1%，激發(fā)濃度為0.1%)，每組4只，雌雄各半?？紤]到2,4-二硝基氯苯的毒性，故未進(jìn)行破損皮膚過敏性試驗。致敏接觸：試驗前24 h于豚鼠背部左側(cè)去毛3 cm×3 cm。將受試液均勻涂抹于脫毛區(qū)，涂抹面積為2 cm×2 cm，以消毒紗布覆蓋，用無刺激性膠布加以固定，6 h后用溫水洗去殘留藥液。第7天、第14天用同樣方法給藥誘導(dǎo)。激發(fā)接觸：第28天于豚鼠右側(cè)脫毛區(qū)再次涂抹各受試液進(jìn)行激發(fā)，6 h后用溫水清潔給藥部位除去殘留藥液。即刻(0 h)、24 h、48 h、72 h觀察豚鼠背部皮膚的過敏情況。記錄各時間點所有豚鼠局部皮膚變態(tài)反應(yīng)發(fā)生情況，同時注意有無全身變態(tài)反應(yīng)(哮喘、站立不穩(wěn)或休克等)。致敏率=出現(xiàn)皮膚紅斑、水腫或全身變態(tài)反應(yīng)的所有動物例數(shù)(不論程度輕重)/受試動物總數(shù)。參照文獻(xiàn)[8]中“皮膚過敏反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行評分，計算平均分值，積分≥2分判為該動物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)。各組皮膚過敏評分(紅斑或水腫項)總分表述為：皮膚該項過敏評分×動物數(shù)量分。

2 結(jié) 果

2.1參花外用顆粒的皮膚刺激性 參花外用顆粒在臨床使用濃度及最大使用濃度下單次外用對豚鼠完整及破損皮膚的刺激反應(yīng)評分和刺激強度評分均為0，無刺激性。連續(xù)外用14 d，臨床使用濃度下對豚鼠完整皮膚組及破損皮膚組的皮膚刺激反應(yīng)評分和刺激強度評分為0分，無刺激性。最大濃度下連續(xù)外用6 d后，完整皮膚組及破損皮膚組皮膚均出現(xiàn)輕微紅斑，無水腫反應(yīng)；連續(xù)外用14 d后，完整皮膚組皮膚刺激性評分均值為1.25分，破損皮膚組評分均值為1.75分，均小于2分，且在末次給藥后72 h內(nèi)紅斑均消失。試驗結(jié)束后受試部位皮膚病理學(xué)顯示，臨床使用濃度下，完整皮膚組及破損皮膚組皮膚組織完整，無結(jié)構(gòu)紊亂，表皮無增厚、水腫，與空白對照組皮膚相比無明顯差異；最大濃度下，完整皮膚組及破損皮膚組表皮增厚約為空白對照組的2倍，無結(jié)構(gòu)紊亂、出血及水腫反應(yīng)。見圖1。

圖1 空白對照組和參花外用顆粒各組豚鼠受試部位皮膚病理表現(xiàn)(HE，×100)

2.2參花外用顆粒的急性毒性反應(yīng)

2.2.1體重及臟器系數(shù)比較 各組豚鼠在給藥期間大小便正常，無反應(yīng)差、抓痕及死亡等情況。給藥前、給藥第3天、給藥第7天、給藥第14天，參花外用顆粒臨床使用濃度完整皮膚組、臨床使用濃度破損皮膚組及最大濃度完整皮膚組、最大濃度破損皮膚組豚鼠體重與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。參花外用顆粒臨床使用濃度完整皮膚組、臨床使用濃度破損皮膚組、最大濃度完整皮膚組豚鼠的主要臟器系數(shù)與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；最大濃度皮膚破損組豚鼠脾臟系數(shù)明顯高于空白對照組(P<0.05)，其他臟器系數(shù)與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表1 空白對照組和參花外用顆粒各組豚鼠體重比較

表2 空白對照組和參花外用顆粒各組豚鼠臟器系數(shù)比較

2.2.2主要臟器病理學(xué)表現(xiàn) 臨床使用濃度完整皮膚組和臨床使用濃度破損皮膚組豚鼠心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟細(xì)胞染色均勻，結(jié)構(gòu)正常，與空白對照組相比無明顯差異，未發(fā)現(xiàn)病理性改變；最大濃度完整皮膚組和最大濃度破損皮膚組豚鼠的肝臟局部均有炎癥反應(yīng)(箭頭位置)，出現(xiàn)病理組織學(xué)改變，其他臟器未發(fā)現(xiàn)病理改變。見圖2。

2.2.3肝腎功能指標(biāo)比較 參花外用顆粒連續(xù)外用14 d后，臨床使用濃度完整皮膚組、臨床使用濃度破損皮膚組及最大濃度完整皮膚組、最大濃度破損皮膚組豚鼠的血清ALT、AST、BUN、Cr、UA水平與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，在正常范圍內(nèi)波動。見表3。

圖2 空白對照組和參花外用顆粒各組豚鼠主要臟器組織病理表現(xiàn)(HE，×200)

2.3參花外用顆粒的皮膚致敏性 蒸餾水組激發(fā)6 h后，即刻至72 h脫毛區(qū)皮膚均未出現(xiàn)紅斑及水腫，致敏率為0。2,4-二硝基氯苯組自激發(fā)給藥6 h后，即刻觀察到2只出現(xiàn)嚴(yán)重紅斑(3×2分) [1只伴勉強水腫(1×1分)，1只伴明顯水腫(2×1分)]，2只出現(xiàn)明顯紅斑(2×2分)[均伴勉強水腫(2×1分)]，平均積分為3.75分，致敏率為100%；24 h開始消退,平均積分為2.75分，致敏率為75%(3/4)；48 h平均積分為1.0分，致敏率為25%(1/4)；72 h后僅1只可見微弱紅斑，無水腫，平均積分為0.25分, 致敏率為0。參花外用顆粒臨床使用濃度組激發(fā)給藥6 h后，即刻至72 h脫毛區(qū)皮膚均未出現(xiàn)紅斑及水腫，致敏率為0；參花外用顆粒最大濃度組激發(fā)給藥6 h后，即刻觀察到3只豚鼠出現(xiàn)輕微紅斑，均無水腫現(xiàn)象，平均積分為0.75分(<2分)，24 h已完全消退，致敏率為0。

表3 空白對照組和參花外用顆粒各組豚鼠肝腎功能指標(biāo)水平比較

3 討 論

目前銀屑病仍以西醫(yī)治療為主。西醫(yī)治療主要分為系統(tǒng)用藥、局部用藥以及物理療法，或多種治療方法聯(lián)用[9]。系統(tǒng)用藥主要有糖皮質(zhì)激素、維A酸類藥、抗生素、維生素類、免疫療法以及生物制劑等；局部用藥主要有焦油制劑、地蒽酚、糖皮質(zhì)激素、維A酸類藥、維生素D3類似物等；物理治療主要有紫外線治療、水療、日光浴等[10]。西醫(yī)治療，尤其是激素治療，存在易復(fù)發(fā)、不良反應(yīng)嚴(yán)重的特點，聯(lián)合中藥治療有增效減毒作用[11]。中藥外用為傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療疾病尤其是皮膚疾病的重要手段[12]，如中藥洗劑治療銀屑病具有療效確切、不良反應(yīng)小、使用簡便、復(fù)發(fā)率低的優(yōu)勢[13-15]。

參花外用顆粒方劑中苦參清熱燥濕、祛風(fēng)消炎為君藥，野菊花清熱解毒、疏風(fēng)涼肝為臣藥，以生側(cè)柏葉涼血止血、除內(nèi)濕、散腫毒為佐藥，花椒祛風(fēng)除濕、殺蟲止癢為使藥。全方針對銀屑病血“熱”的主要病因病機。宋勛等[16]報道該方藥浴聯(lián)合NB-UVB照射治療尋常型銀屑病效果優(yōu)于單用NB-UVB照射治療，能夠明顯改善患者生活質(zhì)量。徐爽等[17]觀察該方熏洗聯(lián)合走罐治療斑塊狀銀屑病的臨床療效與NB-UVB聯(lián)合外用中效糖皮質(zhì)激素的長期療效差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且不良反應(yīng)小。鑒于參花外用顆粒的傳統(tǒng)制劑效果顯著，故進(jìn)行新劑型的皮膚安全性研究，對于安全用藥及臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。

本實驗結(jié)果顯示，參花外用顆粒在臨床使用濃度下無論外用于豚鼠完整皮膚還是破損皮膚，單次及多次刺激均顯示無刺激性；當(dāng)濃度增大至臨床使用濃度的400倍時，單次外用于完整及破損皮膚無刺激性，連續(xù)多次使用出現(xiàn)輕度紅斑，在末次給藥72 h內(nèi)可自行消失，皮膚病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)表皮增厚約為空白對照組的2倍，表現(xiàn)為輕度表皮增厚，對皮膚有輕度刺激性。急性毒性評價顯示，臨床使用濃度下對豚鼠體重、主要臟器及肝腎功能無影響，無毒性；最大濃度下對豚鼠存在潛在肝毒性。上述結(jié)果說明參花外用顆粒臨床使用濃度下對皮膚無刺激性、致敏性及毒性；最大濃度下對皮膚有輕度刺激性，存在潛在肝毒性，無致敏性。總體而言，參花外用顆粒是安全的外用制劑，值得臨床推廣應(yīng)用及開發(fā)新產(chǎn)品。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。