宮頸癌細胞代謝調(diào)控異常與HPV16編碼基因表達的關(guān)系*

努爾滿古力·肉孜，彭 敏，張 玲

(廣元市中心醫(yī)院，廣元 628000)

惡性增殖是腫瘤的基本特征，腫瘤細胞可能改變物質(zhì)代謝譜式，以提供細胞增殖所需的原料，調(diào)整能量短缺狀態(tài)[1]。腫瘤細胞代謝重編程(tumor metabolic reprogramming)學說認為，腫瘤細胞代謝調(diào)控可能是一種顛覆性的代謝調(diào)整，一方面獲得必要的能量供應，另一方面平衡能量供應和生物大分子合成，以實現(xiàn)細胞群體的快速增殖[2]。代謝重編程的前提是細胞內(nèi)基因表達調(diào)控，以此引起細胞信號轉(zhuǎn)導途徑功能及參與代謝調(diào)控的關(guān)鍵酶活性發(fā)生相應變化，調(diào)整細胞代謝狀態(tài)，影響代謝網(wǎng)絡中營養(yǎng)物質(zhì)和能量的流向和流量[3]。腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移、逃避免疫和抵制細胞凋亡為腫瘤細胞代謝重編程提供微環(huán)境[4]。宮頸癌癌前病變到宮頸癌過程是以人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16型和18型等高危型HPV持續(xù)感染加快其病變感染過程，其檢出率高達90%以上[5]。按組織病理學分類，宮頸癌分為鱗狀細胞癌、腺癌、腺鱗癌及其他少見類型歸類，其中80%以上為鱗狀細胞癌，15%～20%屬于腺癌[6]。宮頸鱗癌的常見感染類型為HPV16，宮頸腺癌的常見感染類型為HPV18[7]。本團隊前期研究中采用高分辨魔角核磁共振及超高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜等高通量技術(shù)，對宮頸癌、癌前病變組織進行代謝組學研究，明確宮頸鱗癌發(fā)生及HPV16感染與腫瘤組織細胞內(nèi)代謝紊亂有關(guān)，其中糖酵解、脂肪酸-β氧化和谷氨酰胺氧化代謝增強，篩選出12種代謝標志物[8-9]?？梢?，腫瘤發(fā)生伴有細胞代謝調(diào)控網(wǎng)絡發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細胞內(nèi)小分子代謝物水平上發(fā)生“微調(diào)”，是腫瘤早期預警的重要標記。但是，從HPV感染水平上研究腫瘤細胞代謝調(diào)控的研究甚少。本研究通過探討HPV感染與腫瘤細胞內(nèi)小分子化合物代謝調(diào)控的關(guān)系，為詮釋宮頸癌發(fā)病機制及早期預警提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備及試劑 600M核磁共振波譜儀(VARIAN，美國)，核磁共振波譜儀工作站(Inova 600M，美國)，熒光倒置顯微鏡(DMI6000B LEICA，德國)，倒置顯微鏡(AE31，中國)，共聚焦激光顯微鏡(C2尼康，日本)，Real time RT-PCR SYBR Green1試劑盒(TAKARA，日本)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo公司，美國)，SiHa宮頸癌細胞(HPV16陽性)由中國科學院上海生物化學研究所細胞庫提供，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，雙抗(青霉素和鏈霉素)和胰蛋白酶；Trizol試劑(DP405北京天根生物公司)，氯仿(上海生工)，異丙醇、乙醇(上海生工)，聚酰胺(新疆恒博鑫業(yè))，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph，德國)，二氧化碳培養(yǎng)箱(HERAEUS，日本)，生物安全柜(KS-18，Hereaus，德國)。

1.2 HPV16編碼基因E6和E7的RNAi載體構(gòu)建 根據(jù)HPV16編碼基因E6或E7在線數(shù)據(jù)庫序列，設(shè)計2對shRNA寡核苷酸片段，其中一對為E6特異性片段，另一對為E7基因特異性片段，見表1。通過RNAi寡核苷酸雙鏈的生成反應、質(zhì)粒表達載體鏈接(克隆)、測序鑒定等過程，小規(guī)模制備用于轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的質(zhì)粒。

表1 HPV16編碼基因相應的RNAi寡核苷酸單鏈信息

1.3 建立HPV編碼基因RNAi細胞模型 在常規(guī)細胞培養(yǎng)條件下，用含10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)SiHa宮頸癌細胞。細胞融合度達80%時，用胰蛋白酶(0.25%)消化收集細胞。選擇3μL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche公司)添加至1μg質(zhì)粒DNA/100μL DMEM培養(yǎng)基，分別制備表達E6和E7 shRNA片段的RNAi細胞模型。分組：Control組(未轉(zhuǎn)染組)，僅以含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人宮頸癌SiHa細胞，在轉(zhuǎn)染步驟加無血清無抗生素DMEM；pGFP載體組(空白對照組)，轉(zhuǎn)染表達pGFP的空載體；pRNAi載體組，加pRNAi載體，轉(zhuǎn)染HPV16-E6-siRNA和HPV16-E7-siRNA載體并表達GFP的載體，又分為E6-pRNAi載體組，E7-pRNAi載體組，每組設(shè)3復孔。

1.4 激光共聚焦顯微鏡轉(zhuǎn)染效率的觀察 空載體攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)，SiHa細胞轉(zhuǎn)染24h后，轉(zhuǎn)染成功的細胞在熒光倒置顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察看到綠色熒光。

1.5 RNAi抑制HPV16編碼基因表達水平的RT-PCR分析 轉(zhuǎn)染后48h，分別收集各組細胞，提取細胞總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在20μL體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板，用SYBR Green I嵌合熒光法對E6和E7基因轉(zhuǎn)錄水平進行Real-time PCR分析。每組設(shè)3個復孔，實驗重復3次。

1.6 基于RNAi模型的核磁共振代謝譜分析 樣品取出，室溫解凍，取450μL加入重水配制的DSS緩沖溶液50μL(0.045mol/L NaH2PO4和0.045mol/L K2HPO4)。1H-NMR采用NOESYPRESAT-ID脈沖序列進行氫譜測定，DSS作為內(nèi)標，其化學位移定為0ppm。采用預飽和方式抑制水峰，飽和時間2s，采樣點數(shù)32k，譜寬10000Hz，掃描128次，采樣時間均為1.64s，測試溫度為25℃。所有1H-NMR譜進行相位和基線校正，并用增寬因子為0.5Hz的指數(shù)窗函數(shù)進行處理。每一個1H-NMR譜的δ9.0～0.5ppm范圍以每段為δ0.003ppm分成2668段進行分段積分并進行歸一化處理，同時水分的信號范圍δH=4.70～4.95ppm移除掉。數(shù)據(jù)用SIMCA-P+11軟件進行OPLS-DA分析。

代謝物在不同組(實驗組、空白對照組和空載體組等)的差異性采用OPLS-DA分析中獲得的變量重要性參數(shù)(variable importance in the projection，VIP)值確定。VIP>1的代謝物被認為是兩組中具有差異性的代謝物，而代謝物含量變化的方向采用OPLS-DA分析中的變量相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient，r)判斷。

2 結(jié) 果

2.1 E6-shRNA和E7-shRNA干擾宮頸癌細胞模型的建立 參照NCBI數(shù)據(jù)庫提供的HPV16基因組序列，設(shè)計一系列E6和E7 mRNA特異性小干擾發(fā)夾RNA(small hairpin RNA)，并選擇同步表達報告基因GFP(綠色熒光蛋白質(zhì))和shRNA的pcDNA3質(zhì)粒載體，構(gòu)建HPV16-E6-shRNA和HPV16-E7-shRNA表達載體。轉(zhuǎn)染SiHa宮頸癌細胞(HPV16陽性)，通過不同載體的抑制效率篩選，建立E6-shRNA和E7-shRNA干擾宮頸癌細胞模型。激光共聚焦成像觀察，不同表達載體轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞后，均有細胞群體發(fā)出強烈的熒光，見圖1。

RNAi片段表達水平與GFP報告基因表達同步，根據(jù)熒光觀察數(shù)據(jù)，推斷shRNA干擾效率較高。定量RT-PCR法結(jié)果顯示，sh-RNA干擾后，E6和E7 mRNA兩種由HPV16編碼基因的表達水平降低，見表2。提示shRNA表達后，可能影響細胞內(nèi)相對應的目標mRNA穩(wěn)定性，引起mRNA片段降解。

圖1 RNA干擾前后SiHa宮頸癌細胞內(nèi)GFP(綠色熒光蛋白)激光共聚焦成像(10×10)

表2 RNAi抑制對SiHa宮頸癌細胞內(nèi)E6和E7基因表達水平的影響

2.2 HPV16編碼蛋白表達對宮頸癌細胞代謝譜的影響 CPMG圖譜分析結(jié)果顯示，7.80～0.50ppm范圍內(nèi)，1H-NMR檢測出13種小分子化合物表達水平存在差異，其峰值未發(fā)生重疊，滿足進一步數(shù)據(jù)分析的條件。

對1H-NMR譜進行CPMG分段積分及積分值OPLS-DA分析，獲得二維主成分得分圖(scores plots)和三維空間分布圖(3D plots)。選擇性抑制HPV16 E6及E7表達可能影響細胞內(nèi)代謝調(diào)控，引起代謝譜發(fā)生變化，與空白對照或GFP空載體轉(zhuǎn)染組比較，包括上述小分子化合物在內(nèi)的代謝譜發(fā)生明顯差異，但在空白對照與GFP空載體組未發(fā)生明顯變化。

在OPLS-DA分析基礎(chǔ)上，計算13種代謝物的相關(guān)系數(shù)表，正值表示代謝物含量降低，負值表示代謝物含量升高，見表3。選擇性抑制HPV16編碼的E6和E7蛋白表達，宮頸癌細胞內(nèi)異亮氨酸(Ilu)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phenylalanine)等多種氨基酸以及α-、β-葡萄糖(α-and β-glucose)、β-羥丁酸(β-hydrocxy butyrate)、乙酸(acetate)含量顯著升高，乳酸(Lactate)、丙氨酸(Ala)、甲酸(formate)、甲基組氨酸(Methylhistidine)含量顯著降低，提示抑制HPV16編碼蛋白質(zhì)表達后，恢復氨基酸代謝，抑制腫瘤細胞內(nèi)糖的有氧酵解(aerobic glycolysis)等可能在很大程度上逆轉(zhuǎn)HPV16感染引起的細胞代謝異常。

表3 抑制HPV編碼基因表達與宮頸癌細胞代謝1H-NMR譜的關(guān)系——OPLS-DA相關(guān)系數(shù)

3 討 論

Warburg效應是指絕大多數(shù)腫瘤細胞為滿足快速增長的能量需求而在有氧條件下進行的糖酵解[10]。乳腺癌發(fā)生伴有磷脂代謝異常，雌激素受體陽性和陰性乳腺癌組織之間可能有多種氨基酸表達差異[11]。早期和晚期結(jié)腸癌組織可能發(fā)生脂代謝模式轉(zhuǎn)換[12]。本課題組前期研究顯示，HPV16感染可能引起宮頸癌組織中α和β-葡萄糖、酪氨酸、苯丙氨酸、乙酸含量顯著下降，而乳酸、異亮氨酸、丙氨酸、甲基脯氨酸和低密度脂蛋白含量顯著上升，涉及糖脂和氨基酸代謝異常，但是E6和E7基因表達對細胞內(nèi)代謝的影響尚未見報道[8]。本研究對HPV16陽性宮頸癌細胞進行RNA干擾，明確抑制E6和E7基因表達，通過代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)13種小分子化合物水平變化，其中α和β-葡萄糖、乙酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸含量顯著上升，而乳酸、丙氨酸、甲酸含量下降，提示HPV感染影響細胞內(nèi)糖脂和氨基酸代謝，其中E6和E7蛋白質(zhì)可能扮演重要角色。

HPV感染與子宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。幾乎所有宮頸癌及絕大部分癌前病變(宮頸上皮內(nèi)瘤變)組織檢出高危型HPV16和18，其主要感染形式是病毒與宿主基因組整合[14]。HPV16編碼的E5、E6和E7蛋白可能干擾p53和pRB介導的DNA損傷修復、細胞周期調(diào)控網(wǎng)絡或免疫監(jiān)視，是一種較公認的HPV致病、致癌及免疫逃逸機制[15]。據(jù)現(xiàn)有研究，HPV16編碼的E6蛋白可能促進細胞糖酵解，抑制氧化磷酸化，呈典型的Warburg效應[16]。頭頸部腫瘤與HPV感染的關(guān)系密切，其組織葡萄糖和核酮糖表達下降也是較典型的Warburg效應[17]。E6和E7表達激活PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路，促進能量代謝[18]。本研究中，抑制E6或E7蛋白表達后，α和β-葡萄糖含量顯著增加，乳酸含量下降，提示宮頸癌細胞內(nèi)可能存在上述有氧糖酵解過程。腫瘤組織內(nèi)氨基酸含量變化異?？赡苁请p刃劍，對于其促進或抑制腫瘤細胞增殖存在分歧[19]。腫瘤組織可能極力動用體內(nèi)游離氨基酸，彌補迅速增長所需的蛋白質(zhì)合成原料，并以氨基酸分解為代價，解決能量代謝緊張狀態(tài)[20]。由上述分析，可推斷HPV編碼的E6和E7蛋白質(zhì)表達可能促進腫瘤細胞內(nèi)有氧糖酵解過程，此伴有脂代謝和氨基酸代謝重編程，以維持腫瘤快速生長相關(guān)的蛋白質(zhì)生物合成和能量需求。