儲(chǔ)存條件對(duì)乳酸菌飲料的活菌數(shù)有何影響

張熙喬

張永強(qiáng)? 中學(xué)高級(jí)教師，湖南省十佳科技教師。科普中國(guó)2021年十大科普人物獎(jiǎng)獲得者，全國(guó)校園發(fā)明創(chuàng)意大賽、湖南省青少年科技創(chuàng)新大賽、湖南省創(chuàng)新編程與智能設(shè)計(jì)大賽、湖南省科學(xué)調(diào)查體驗(yàn)活動(dòng)評(píng)審專家組成員。

經(jīng)常飲用活菌型乳酸菌飲料可改善腸道微生物的組成，提高人體免疫力。但是，體內(nèi)的乳酸菌活菌要積累到一定數(shù)量，才有機(jī)會(huì)到達(dá)并定植于小腸內(nèi)，抑制有害菌生長(zhǎng)，保持腸道微生態(tài)平衡。所以，評(píng)價(jià)活菌型乳酸菌飲料的一個(gè)重要指標(biāo)是其活菌的含量。

目前，活菌型乳酸菌飲料都需冷藏保存。雖然大多數(shù)超市的乳酸菌飲料被存放在冰柜中，但有時(shí)為方便促銷(xiāo)，部分乳酸菌飲料被擺放在常溫柜臺(tái)或未密封的小冰柜里。

常溫下，乳酸菌飲料中的乳酸菌還能存活嗎？保質(zhì)期內(nèi)，冷藏保存的乳酸菌飲料中的活菌數(shù)真的達(dá)標(biāo)嗎？外出攜帶的乳酸菌飲料中的活菌數(shù)有什么變化？對(duì)于腸胃敏感的人來(lái)說(shuō)，提前多久將乳酸菌飲料置于常溫下更合適？這些問(wèn)題都值得深入探討。

一、市場(chǎng)調(diào)研

走訪成都市新都區(qū)的超市，挑選并記錄常溫、冷藏保存的乳酸菌飲料的種類(lèi)及產(chǎn)品信息。

二、實(shí)驗(yàn)器材

4種活菌型乳酸菌飲料、MRS液體培養(yǎng)基、瓊脂粉、90 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿、天平、三角瓶、微量移液器、酒精燈、普通光學(xué)顯微鏡、RO純水儀、超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、培養(yǎng)箱等。

三、實(shí)驗(yàn)方法

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.35—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》執(zhí)行，遵循無(wú)菌操作程序。

（一）分組

將購(gòu)買(mǎi)的活菌型乳酸菌飲料分成兩組。第一組包含4種，每種12瓶，分別儲(chǔ)存于4 ℃和常溫環(huán)境中，在保質(zhì)期內(nèi)，每隔5天分別取1瓶檢測(cè)其活菌數(shù)。第二組由2種活菌型乳酸菌飲料組成，每種7瓶，分別考察它們于常溫下放置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h后的活菌數(shù)。

（二）制備平板培養(yǎng)基

稱取MRS液體培養(yǎng)基66.2 g，將其加熱溶解于1000 mL蒸餾水中，加入2%瓊脂粉。將配好的培養(yǎng)基用121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻至50 ℃左右，在超凈工作臺(tái)內(nèi)制備平板。

（三）樣品稀釋、涂布及培養(yǎng)

1.樣品稀釋

將1 mL乳酸菌飲料制成1∶10的樣品稀釋液，混勻后取0.1 mL上述稀釋液加入0.9 mLRO水中，制成1∶100的稀釋液。按上述操作順序，做成10倍遞增樣品稀釋液。

2.涂布及培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，取10^-8、10^-9或10^-10稀釋梯度的稀釋液0.05 mL，分別均勻涂布于2個(gè)MRS平板內(nèi)，封口膜密封平板后于37 ℃環(huán)境中倒置培養(yǎng)48 h。

（四）平板計(jì)數(shù)

選取菌落數(shù)在30～300 CFU、無(wú)散延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)菌落數(shù)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)記錄為兩個(gè)平板的平均數(shù)。將上述平均值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，作為每毫升乳酸菌飲料中含有的活菌數(shù)。

（五）觀察菌落形態(tài)

將培養(yǎng)好的平板取出，肉眼觀察每個(gè)平板上的菌落形態(tài)。

（六）革蘭氏染色及觀察細(xì)胞形態(tài)

1.革蘭氏染色

用接種環(huán)挑取菌落形態(tài)不同的單菌落置于載玻片，均勻涂開(kāi)后用酒精燈外焰烤干。載玻片上的菌體薄層用草酸銨結(jié)晶紫染色1 min。之后用RO水沖洗，再滴加碘液覆蓋涂面染色1 min后，用RO水沖洗，用干凈的吸水紙吸干多余水分，加入數(shù)滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的酒精，并輕輕搖動(dòng)。脫色20 s后，再用RO水沖洗，用干凈的吸水紙吸去表面水分。最后用蕃紅復(fù)染1 min，RO水沖洗、干燥，用顯微鏡觀察。

2.觀察細(xì)胞形態(tài)

先用普通光學(xué)顯微鏡的低倍鏡找到待觀察物象，并移到視野中央，再切換到高倍鏡和油鏡，觀察菌體細(xì)胞形態(tài)和上述革蘭氏染色結(jié)果。

四、實(shí)驗(yàn)觀察

（一）選取實(shí)驗(yàn)對(duì)象

經(jīng)市場(chǎng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，2022年暑假期間成都市新都區(qū)售賣(mài)的乳酸菌飲料主要來(lái)自伊利、蒙牛、新希望、養(yǎng)樂(lè)多、菊樂(lè)等5個(gè)廠家，產(chǎn)品類(lèi)型主要有10種。挑選其中4種明確標(biāo)識(shí)“活菌型乳酸菌”的產(chǎn)品作為本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，如表1。

（二）不同儲(chǔ)存溫度對(duì)保質(zhì)期內(nèi)活菌型乳酸飲料中活菌數(shù)的影響

將4種乳酸菌飲料分別儲(chǔ)存在4 ℃和常溫的環(huán)境中，30天內(nèi)其活菌數(shù)的變化如表2所示。

（三）短時(shí)間內(nèi)常溫環(huán)境中乳酸菌飲料中活菌數(shù)的變化

常溫下，上市5 d后的“蒙牛優(yōu)益C”和“養(yǎng)樂(lè)多”的活菌數(shù)變化如表3。

（四）乳酸菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)

如圖2，平板內(nèi)的菌落均為白色、圓形，有的菌落中等偏大，有的偏小，所有菌落表面凸起、濕潤(rùn)，邊緣整齊。所有菌體細(xì)胞經(jīng)革蘭氏染色處理后呈紫色，表明這些菌體均為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）。有的菌體細(xì)胞為直徑0.5～2.0 μm的球形（圖3b），有的為長(zhǎng)桿或短桿形（圖3c），細(xì)胞均成對(duì)或成鏈排列，無(wú)芽胞、不運(yùn)動(dòng)。

五、結(jié)果分析與結(jié)論

（一）在保質(zhì)期內(nèi)，冷藏與常溫條件下活菌數(shù)的變化

常溫儲(chǔ)存5～10 d時(shí)，雖然乳酸菌飲料中的活菌數(shù)仍然達(dá)標(biāo)，但還是建議市民購(gòu)買(mǎi)活菌型乳酸菌飲料時(shí)，一定要從冷藏柜中挑選并盡量選擇生產(chǎn)日期較新的產(chǎn)品。買(mǎi)回家后若不能馬上飲用，一定要冷藏儲(chǔ)存并盡快飲用。

生產(chǎn)企業(yè)和超市應(yīng)始終對(duì)活菌型乳酸菌產(chǎn)品進(jìn)行冷鏈運(yùn)輸，并對(duì)超市銷(xiāo)售人員進(jìn)行培訓(xùn)，以便引導(dǎo)消費(fèi)者正確飲用。

（二）常溫條件下儲(chǔ)存24 h后，活菌數(shù)的變化

活菌型乳酸菌飲料常溫放置超過(guò)4 h時(shí)，其中的活菌數(shù)開(kāi)始顯著下降。因此，建議腸胃敏感者可提前將活菌型乳酸菌飲料置于常溫下，但在常溫下放置的時(shí)間最好不要超過(guò)4 h。外出游玩時(shí)，未冷藏的活菌型乳酸菌飲料最好在4 h內(nèi)飲用。

（三）乳酸菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)

本實(shí)驗(yàn)分離的乳酸菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌。目前，市面上銷(xiāo)售的乳酸菌飲料中主要含有乳桿菌屬、嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌屬三類(lèi)，本實(shí)驗(yàn)只觀察到了嗜熱鏈球菌和乳桿菌的細(xì)胞形態(tài)，未見(jiàn)雙歧桿菌?？赡苁且?yàn)殡p歧桿菌只能存活于絕對(duì)厭氧條件下，在兼性需氧條件下不生長(zhǎng)。而我們的培養(yǎng)條件是兼性厭氧，未達(dá)到絕對(duì)厭氧，因此雙歧桿菌不能生長(zhǎng)。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得出結(jié)論：活菌型乳酸菌飲料中的活菌數(shù)與儲(chǔ)存條件比如溫度、時(shí)間密切相關(guān)。

六、創(chuàng)新性與實(shí)用性

首次探究了常溫條件下，活菌型乳酸菌飲料中活菌數(shù)在24 h內(nèi)的變化，為人們科學(xué)飲用活菌型乳酸菌飲料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，探索了冷藏和常溫兩種環(huán)境對(duì)活菌型乳酸飲料中活菌數(shù)在保質(zhì)期內(nèi)的變化，為企業(yè)生產(chǎn)活菌型乳酸菌飲料以及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

實(shí)用性體現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可引導(dǎo)人們正確選購(gòu)與飲用活菌型乳酸菌飲料，以保證攝入足夠的活菌，充分發(fā)揮乳酸菌促消化、抑制有害微生物在人體腸道內(nèi)生存等作用。

感謝指導(dǎo)老師為本研究提供的實(shí)驗(yàn)條件和指導(dǎo)?。ㄖ笇?dǎo)老師：解蒸）

專家點(diǎn)評(píng)

本文研究了活菌型乳酸菌飲料中的乳酸菌在不同條件下的數(shù)量變化，文章結(jié)構(gòu)完整，思路清晰，選題恰當(dāng)，聯(lián)系生活實(shí)際，是一篇優(yōu)秀的研究論文。

本文以生活中常見(jiàn)的乳酸菌飲料為研究對(duì)象，探討飲料中的乳酸菌在冷藏和室溫下活菌數(shù)量的變化，為人們正確飲用活菌型乳酸菌飲料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有很強(qiáng)的實(shí)踐性。從實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)到方案的執(zhí)行，再到結(jié)果的分析，符合學(xué)生的認(rèn)知能力，可由學(xué)生獨(dú)立完成，有利于培養(yǎng)學(xué)生提出問(wèn)題、做出假說(shuō)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等科學(xué)探究的能力。