DNA甲基化及其在輻射防護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用

蘇麗霞，戰(zhàn)景明，古曉娜，薛向明，武寶利

(中國(guó)輻射防護(hù)研究院，山西 太原，030006)

0 引言

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種重要形式，在生物學(xué)中起重要作用，表觀遺傳即不改變DNA序列但基因表達(dá)水平發(fā)生變化，并且這種變化在發(fā)育和細(xì)胞增殖過(guò)程中可以穩(wěn)定傳遞[1]。

電離輻射是DNA損傷誘導(dǎo)劑，作用于機(jī)體后產(chǎn)生大量電子，這些電子可使分子或原子電離或激發(fā)，破壞其重要的化學(xué)鍵，發(fā)生不可逆變化，最終導(dǎo)致DNA單鏈或雙鏈斷裂及堿基損傷等生物效應(yīng)，使細(xì)胞功能受損，影響轉(zhuǎn)錄、翻譯、DNA復(fù)制以及有絲分裂等過(guò)程[2]。電離輻射還是表觀遺傳毒性劑，可誘導(dǎo)表觀遺傳及其調(diào)控的改變，尤其是改變DNA甲基化的模式[3]。研究發(fā)現(xiàn)電離輻射可誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化，特定基因啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化和重復(fù)序列DNA甲基化水平的改變等。

DNA甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，在許多癌變過(guò)程的早期就可以檢測(cè)到DNA甲基化的改變。腫瘤細(xì)胞中全基因組DNA甲基化水平低于正常細(xì)胞，啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平高于正常細(xì)胞，因此腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細(xì)胞癌變與DNA異常甲基化密切相關(guān)[4]。隨著核能及放射診療應(yīng)用越來(lái)越廣，接觸輻射的人員也隨之增多，對(duì)人類的潛在健康危害也在不斷增加，DNA甲基化的作用及影響成為放射生物學(xué)、輻射防護(hù)學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。因此研究DNA甲基化模式的改變，將其作為基因組不穩(wěn)定性診斷和細(xì)胞早期惡變的生物標(biāo)志物具有重要意義。

本文介紹了DNA甲基化以及電離輻射誘導(dǎo)全基因組DNA、特定基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化和重復(fù)序列DNA甲基化水平的改變，探討了電離輻射誘導(dǎo)DNA甲基化模式改變的可能機(jī)制，介紹了DNA甲基化在輻射防護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 DNA 甲基化

1.1 DNA甲基化的概念

DNA甲基化通常發(fā)生在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上，由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的DNA修飾序列。DNA甲基化主要是由一系列甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)來(lái)完成[5]。目前，已經(jīng)鑒定出DNMT家族的5個(gè)成員，其中DNMT1(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1)、DNMT3A(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 alpha)和DNMT3B(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 beta)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有功能活性[6]。DNMT1的功能主要是DNA復(fù)制過(guò)程中甲基化的維持，在模板鏈的指導(dǎo)下，將母鏈DNA甲基化模式傳遞給子鏈；而 DNMT3A 和 DNMT3B 主要負(fù)責(zé)未甲基化位點(diǎn)的甲基化反應(yīng)發(fā)生，在胚胎發(fā)生和生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中在兩條DNA鏈上產(chǎn)生新的甲基化模式，DNMT3A和DNMT3B 靶向不同的甲基化位點(diǎn)，具體取決于細(xì)胞類型和發(fā)育階段[7]。

1.2 DNA甲基化功能

在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化基本位于胞嘧啶和鳥嘌呤堿基序列(CpG)的胞嘧啶殘基中，CpG位點(diǎn)分布不均勻，且基本集中在富含CpG位點(diǎn)的CpG島上，CpG島主要位于基因的啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域。真核細(xì)胞基因組DNA約70%的CpG位點(diǎn)能夠發(fā)生甲基化，位于CpG島的CpG位點(diǎn)在正常的細(xì)胞中通常是未甲基化的[8]。但啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)改變可引起某些基因異常轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)情況發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生發(fā)展。

DNA 甲基化與生命活動(dòng)環(huán)節(jié)密切相關(guān)，DNA甲基化與其他表觀遺傳改變相互作用，在調(diào)控基因表達(dá)、發(fā)育分化、X染色體失活、基因組印跡、染色質(zhì)修飾和內(nèi)源基因沉默方面起重要作用[9]。DNA甲基化是調(diào)節(jié)遺傳信息正確表達(dá)的關(guān)鍵表觀遺傳機(jī)制。

此外甲基化水平的變化是引起腫瘤的一個(gè)重要因素，甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)是基因突變的熱點(diǎn)[10]。在腫瘤細(xì)胞中，(1)全基因組DNA甲基化水平降低，癌基因處于低甲基化狀態(tài)，通常會(huì)導(dǎo)致癌基因活化、轉(zhuǎn)錄表達(dá)，形成突變熱點(diǎn)從而導(dǎo)致整個(gè)基因組不穩(wěn)定性增加；(2)啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平升高，機(jī)體重要基因如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、抑癌基因、凋亡基因等處于高甲基化狀態(tài)，使其轉(zhuǎn)錄抑制、失活或沉默，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11]；(3)DNA甲基化發(fā)生在(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上，而5-mC可通過(guò)自發(fā)或酶促脫氨轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，使甲基化的CpG突變?yōu)門pG，引起基因突變，這也是DNA甲基化促進(jìn)細(xì)胞惡變發(fā)生腫瘤的一種機(jī)制[12]；(4)總體甲基化水平低可促進(jìn)雜合性丟失或高頻率的染色體重組改變?cè)袠?gòu)象，增加基因的不穩(wěn)定系，同樣導(dǎo)致有害基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[13]。

2 電離輻射誘導(dǎo)DNA甲基化

2.1 電離輻射誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化

Kalinich等[14]通過(guò)對(duì)4種體外培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行不同劑量的γ射線急性照射，觀察在照后24、48和72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)10 Gy照射后，所有細(xì)胞基因組DNA甲基化水平都表現(xiàn)為劑量依賴性降低，且在48 h的時(shí)間點(diǎn)下降最為明顯，表明了全基因組DNA甲基化的缺失。Tawa等[15]用高效液相色譜法檢測(cè)5-甲基胞嘧啶含量，研究了小鼠在4、7和10 Gy急性X射線照射后的甲基化水平變化，發(fā)現(xiàn)照射后8、24、48、72 h后小鼠干細(xì)胞出現(xiàn)全基因組DNA低甲基化。這兩項(xiàng)研究均使用高劑量輻射作為單一急性劑量。

Koturbash等[16]首次研究了淋巴瘤前期輻射目標(biāo)鼠胸腺受輻射誘導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)變化，對(duì)C57/B1小鼠進(jìn)行一次5 Gy X射線的急性照射和10天分段的慢性照射，發(fā)現(xiàn)急性和分次全身照射顯著改變了鼠胸腺中的DNA甲基化模式，導(dǎo)致全基因組DNA低甲基化。

Pogribny等[17]用0.5、l和2.5 Gy X射線急性全身照射C57/B1雄性、雌性小鼠6 h后，肝及脾組織中觀察到輻射誘導(dǎo)的全基因組DNA低甲基化，同時(shí)用5 Gy急性照射小鼠也發(fā)現(xiàn)同樣結(jié)果，但是慢性照射未有顯著變化。Wang等[18]研究也證實(shí)了雄性BALB/c小鼠急性暴露于0.5 Gy X射線或長(zhǎng)期暴露于分級(jí)劑量10天后，血液基因組表現(xiàn)出低甲基化。

梁建慶等[19]用12C6+束對(duì)大鼠右側(cè)肺部結(jié)構(gòu)進(jìn)行照射，通過(guò)MethylRAD技術(shù)對(duì)大鼠心、肝、脾、左肺、左腎組織進(jìn)行全基因組DNA甲基化檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)在大鼠相應(yīng)組織的全基因組DNA出現(xiàn)低甲基化表達(dá)。

目前發(fā)現(xiàn)高劑量和低劑量電離輻射均可誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化，且其程度因照射劑量、照射方式、照射組織等不同而異。全基因組DNA低甲基化通常被認(rèn)為是基因組不穩(wěn)定的標(biāo)志，會(huì)導(dǎo)致一些正常沉默的基因激活，與染色體和基因組不穩(wěn)定以及突變率增加有關(guān)[16]。通常在各種癌癥和癌前期都觀察到這種現(xiàn)象。

2.2 電離輻射誘導(dǎo)特定基因啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化

特定的基因組位點(diǎn)比其他基因位點(diǎn)對(duì)DNA甲基化的變化更敏感。特定基因內(nèi)的DNA甲基化譜可影響其轉(zhuǎn)錄模式，并可被外源應(yīng)激改變。電離輻射誘導(dǎo)的基因特異性DNA甲基化改變會(huì)影響相應(yīng)表達(dá)變化。

Kovalchuk等[20]報(bào)道了雄性和雌性C57/B1小鼠在分別接受單次5 Gy和分次劑量共5 Gy X射線照射后，肝臟中啟動(dòng)子p16 INK4的高甲基化，且單次暴露組比分次暴露組更明顯，雄性組比雌性組更明顯，但在肌肉組織和MGMT啟動(dòng)子區(qū)域無(wú)明顯變化。Romanenko等[21]同樣也發(fā)現(xiàn)慢性照射腫瘤組織后p16 INK4基因啟動(dòng)子區(qū)處于高甲基化狀態(tài)。

Wang等[18]將30只雄性BALB/c小鼠分為對(duì)照組、急性暴露(0.5 Gy X射線)和慢性暴露10天(0.05 Gy/d，10 d)，采用高效液相色譜(HPLC)和MeDIP定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)研究其甲基化譜，驗(yàn)證了8個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化(Rad23b，Tdg，Ccnd1，Ddit3，Llgl1，Rasl11a，Tbx2，Scl6a15)是相對(duì)穩(wěn)定的，并表示這些基因在放射生物學(xué)中可能發(fā)揮重要作用。

Song等[22]將暴露在全身輻射下的雄性BALB/c小鼠分成4周1.75 Gy劑量，p16基因啟動(dòng)子區(qū)在暴露6個(gè)月后胸腺組織有部分位點(diǎn)甲基化水平增高。

2.3 電離輻射誘導(dǎo)重復(fù)序列DNA甲基化改變

DNA甲基化的改變不僅限于特定的基因，還可以在重復(fù)序列中檢測(cè)到。重復(fù)序列是具有高拷貝的相同或互補(bǔ)的 DNA 片段，構(gòu)成三分之二的哺乳動(dòng)物基因組，對(duì)調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性與正常功能具有重要作用，其中包括長(zhǎng)散布序列1(LINE-1)和短散布序列Alu等。LINE-1和Alu重復(fù)序列約占人類基因組的30%，通常被高度甲基化[23-24]。而島外CpG位點(diǎn)的某些重復(fù)序列的DNA低甲基化，致使基因組和染色體不穩(wěn)定性增加，基因表達(dá)受抑制[25-27]。

Aypar等[28]將人類倉(cāng)鼠雜交細(xì)胞系(GM10115)暴露于2 Gy的X射線后，發(fā)生了LINE-1的 DNA低甲基化。Koturbash等[29]將C57BL/6J雄性小鼠暴露于兩種類型的空間輻射質(zhì)子和56Fe，在照射后第7天觀察到LINE-1的低甲基化，在照射90天后發(fā)現(xiàn)LINE-1和其他逆轉(zhuǎn)座子ERV2和SINE B1，以及主要衛(wèi)星DNA高甲基化。Baulch實(shí)驗(yàn)室顯示，在暴露于1 Gy的X射線后，RKO癌細(xì)胞系中LINE-1元素發(fā)生了明顯低甲基化；在同一研究中，在RKO和RKO中均觀察到LINE-1和Alu元素的低甲基化[24]。

Rashmi等[30]對(duì)人外周血進(jìn)行照射，分析了LINE-1重復(fù)序列的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)0.1 Gy照射條件下，MRE11A和TNFAα在照射后72 h甲基化水平顯著升高；2.0 Gy照射條件下，LINE1、MRE11A、PARP1、BRCA1、DNMT3A 和 RAD23B在照射后48 h和72 h的甲基化水平顯著升高。

綜上表明，重復(fù)序列的DNA甲基化狀態(tài)變化受電離輻射的影響，并且這些變化與劑量、細(xì)胞、組織、時(shí)間和輻射類型有關(guān)。

2.4 電離輻射誘導(dǎo)DNA甲基化模式改變的機(jī)制

電離輻射導(dǎo)致基因組DNA甲基化模式改變的可能機(jī)制有：電離輻射對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響、電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)和生物體-碳代謝途徑的改變。

(1)電離輻射對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響

電離輻射會(huì)引起各種DNA損傷如雙鏈斷裂等，損傷產(chǎn)物會(huì)降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性以及mRNA和蛋白表達(dá)水平，從而導(dǎo)致DNA低甲基化；電離輻射對(duì)機(jī)體水分子的電離和激發(fā)作用會(huì)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，ROS可作為DNA甲基化的催化劑，可以通過(guò)增加DNMTs的表達(dá)使啟動(dòng)子區(qū)域DNA高甲基化[31]。此外，電離輻射還會(huì)影響幾種特異性靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的micro-RNA，如miR-29家族，miR-141和miR-152，可能導(dǎo)致DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA降解以及隨后的DNA甲基化改變[32-33]。

(2)受照細(xì)胞DNA損傷及其修復(fù)狀態(tài)

電離輻射使全基因組DNA甲基化水平降低，其與DNA鏈斷裂的累積和重組活性的提高有關(guān)。直接照射的組織中細(xì)胞甲基化的降低可能與這些細(xì)胞的修復(fù)狀態(tài)有關(guān)。實(shí)際上，在修復(fù)合成過(guò)程中，參與修復(fù)和重組的DNA聚合酶摻入的是胞嘧啶而不是甲基胞嘧啶，因此，DNA損傷的誘導(dǎo)以及隨后DNA修復(fù)和重組機(jī)制的激活可能導(dǎo)致DNA低甲基化，即由于暴露于電離輻射引起的DNA甲基化抑制與DNA修復(fù)的激活相關(guān)[34]。

(3)一碳代謝途徑的改變

一碳代謝是一碳單位生成和轉(zhuǎn)移的生物過(guò)程，影響生物體中細(xì)胞功能和特定生物甲基化反應(yīng),主要是影響S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的合成。正常條件下，甲硫氨酸(MET)在甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A(MAT2A)的作用下轉(zhuǎn)化為SAM，SAM為DNMT提供其甲基，用于復(fù)制后的DNA甲基化維持。但是電離輻射可能會(huì)影響甲硫氨酸的合成和/或抑制甲硫氨酸向SAM的生物轉(zhuǎn)化，從而消耗了甲基供體SAM中的甲基，導(dǎo)致復(fù)制后的DNA半甲基化[35]。

3 DNA甲基化在輻射損傷防護(hù)的應(yīng)用

電離輻射致DNA甲基化可增加基因突變頻率對(duì)基因表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生影響，將特定基因甲基化水平變化作為輻射損傷的生物標(biāo)志物具有重要意義。然而目前僅是將特定基因甲基化水平作為輻射損傷標(biāo)志物的可行性及理論基礎(chǔ)進(jìn)行研究。

Lyon等[36]對(duì)MAYAK工人的基因甲基化研究表明，在工人腺癌中，GATA5啟動(dòng)子甲基化程度高，GATA5是正常發(fā)育和維持細(xì)胞分化所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。推測(cè)啟動(dòng)子甲基化使基因失活的頻率增加以及靶向腫瘤抑制基因(如GATA5)的增加可能是導(dǎo)致與放射線暴露相關(guān)的肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加的因素。

Lee 等[37]對(duì)核電廠工作人員職業(yè)輻射暴露與DNA甲基化的關(guān)系進(jìn)行多元回歸模型分析，結(jié)果顯示，全基因組甲基化水平與輻射作業(yè)工人近1.5 年輻射劑量呈負(fù)相關(guān)，LINE-1甲基化水平與總累積輻射劑量呈正相關(guān)。

Alexer[38]對(duì)切爾諾貝利核電廠清理工人外周血白細(xì)胞中RASSF1A、p16、p14和GSTP1啟動(dòng)子的甲基化水平分析發(fā)現(xiàn)P16和GSTP1基因的甲基化與輻射暴露相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)在切爾諾貝利事故后生活在放射性污染地區(qū)的腎細(xì)胞癌患者中，可以觀察到p14ARF和p16INK4A基因異常高甲基化[39]。這些研究提示，將DNA甲基化特異性進(jìn)一步研究，有可能作為癌癥早期診斷的生物標(biāo)志物。

4 結(jié)語(yǔ)

目前對(duì)輻射誘導(dǎo)DNA甲基化的機(jī)制了解不夠充分，需要有效的方法識(shí)別與輻射相關(guān)的引發(fā)機(jī)體發(fā)生甲基化的熱點(diǎn)基因組[40]。如開發(fā)高通量測(cè)序方法和強(qiáng)大分析平臺(tái)用于臨床的診斷、治療以及預(yù)后，將會(huì)為輻射導(dǎo)致的DNA全基因組和啟動(dòng)子區(qū)基因組的改變提供技術(shù)支持。開發(fā)實(shí)用的模型對(duì)受照人群的流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評(píng)估輻射風(fēng)險(xiǎn)，確定個(gè)體放射敏感性決定因素，對(duì)研究表觀遺傳機(jī)制以及進(jìn)一步理解劑量暴露的影響有重要作用。

另外，需要深入了解DNA甲基化誘發(fā)腫瘤的機(jī)制及去甲基化藥物的開發(fā)與應(yīng)用，將其用于抗癌治療或用作放射治療敏化劑；選擇適當(dāng)?shù)呐鋵?duì)方式對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性甲基化檢測(cè)；對(duì)早期疾病特別是腫瘤的篩查、評(píng)估治療效果和預(yù)后評(píng)估中具有重要意義。