快速測定唐古特白刺種子生活力的研究

李超群，李毅，張詠梅，陳君嬋，李蒙，蘆倩

（1.甘肅農業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業(yè)大學省部共建國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

唐古特白刺（Nitraria tangutorum），又稱酸胖、白茨、白刺，主要分布于陜西北部、內蒙古西部、寧夏、甘肅河西、青海、新疆及西藏東北部等地區(qū)［1］。白刺是中國荒漠地區(qū)特有的灌木樹種，具有較強的耐鹽堿、耐干旱和防風固沙的生態(tài)適應性，常被用來固定流沙，對我國西北地區(qū)的生態(tài)環(huán)境具有重要意義。其葉和果實等可提取藥物，有一定經濟價值。近年來受人為破壞、環(huán)境變化和病蟲害等的嚴重危害，唐古特白刺在全國各個自然分布區(qū)均有不同程度的縮減［2-3］。以柴達木盆地自然分布區(qū)為例，目前有10萬hm2唐古特白刺，其中3.3萬hm2以上遭到不同程度的破壞［4］。在這種情況下，恢復唐古特白刺自然分布區(qū)是十分必要的。唐古特白刺一般采用播種造林，而一批發(fā)芽率高的種子是播種造林的基本條件。種子的發(fā)芽率主要取決于種子本身生活力強弱和是否休眠兩個方面。種子生活力是種子發(fā)芽的潛在能力或種胚所具有的生命力，所以常用種子生活力來評價一批種子的質量好壞和其發(fā)芽的可能性［5］。

唐古特白刺為核果植物，種子被石質細胞組織包裹，形成堅硬的果核，狹卵形，表面孔穴分布不均且少［6］，因此硬實現(xiàn)象是影響唐古特白刺種子發(fā)芽率高低的關鍵因素之一。目前許多學者對唐古特白刺種子發(fā)芽率的研究多集中在通過熱水浸種［7］、擦破種皮或果皮［8］或濃硫酸浸泡［9］等打破休眠和內果皮硬實的影響［10］以提高發(fā)芽率。不同的預處理方式導致了唐古特白刺種子發(fā)芽率的差異很大，造成這種情況的原因有：一是擦破內果皮和打破休眠的程度不同，二是忽略了種子本身的生活力大小。利用發(fā)芽率檢測一批種子的質量是最準確的，可對于發(fā)芽周期長的唐古特白刺種子來說是耗時耗力，因此，急需找到一種科學并且檢測時間短的方法代替直接發(fā)芽試驗。秦家順［11］發(fā)現(xiàn)TTC染色法的檢測結果與種子實際發(fā)芽率相接近。TTC法是根據胚的染色形狀、顏色深淺來判斷種子生活力大小，這種方法世界公認、原理可靠、不受休眠限制［12］，因此TTC染色法快速測定種子生活力是比較理想的一種替代方式。目前還沒有關于快速檢測唐古特白刺種子質量的相關報道，本研究優(yōu)化了TTC溶液對唐古特白刺種子的染色條件，旨在快速檢驗唐古特白刺種子的發(fā)芽潛力，為播種造林、恢復唐古特白刺分布區(qū)提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試唐古特白刺種子于2020年8月初采自甘肅省武威市涼州區(qū)羊下壩鎮(zhèn)唐古特白刺試驗田（N 38°24′，E 103°9′）。利用尼龍網布揉搓，洗去果肉后晾干，保存于4℃冰箱中備用。種子于10月初取出后常溫干燥保存，試驗在11月中旬進行［9］。

1.2 試驗方法

1.2.1 正交試驗設計參考相關學者［13-16］的研究，選取2個打破種子休眠、影響種子萌發(fā)的關鍵因素（浸種溫度、浸種時間），選取3個影響種子染色的關鍵因素（TTC濃度、染色溫度、染色時間）作為檢測唐古特白刺種子生活力的指標。采取L16（45）5因素4水平正交試驗設計（表1）。

表1 白刺種子生活力測定條件正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal test factor level for determination of seed viability of Nitraria tangutorum

1.2.2 種子預處理唐古特白刺種子用0.5%的高錳酸鉀消毒40 min后，蒸餾水沖洗8～10次，用70%H2SO4浸種20 min，蒸餾水再沖洗8～10次，用pH試紙測試最后一次的沖洗液，直至pH值處于6.5～7.5［17］。

1.2.3 TTC溶液的配制用NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O按照一定比例配制pH=7的磷酸緩沖液［18］，精確稱取0.1、0.3、0.5、0.7 g的氯化四唑粉劑，分別溶解于100 mL磷酸緩沖液中，配制成0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的TTC溶液，放置于棕色瓶中，4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TTC染色

1.3.1 浸種處理預處理的種子取出50粒為一個組合，共16個處理組合，每個處理組合重復3次。先將放有蒸餾水的培養(yǎng)皿放入各個試驗梯度的恒溫箱中2 h，后將種子放入培養(yǎng)皿中，使種子完全浸沒，然后按照正交試驗設計分別浸泡處理5、10、15、20 h。

1.3.2 染色取出浸泡的種子，用吸水紙吸干表面水分，在試驗臺上沿內果皮的縱向用解剖刀切開，留下保留完整種胚的一半，放入培養(yǎng)皿中，加入等量對應濃度的現(xiàn)配TTC溶液，使種子完全浸沒，放回到其對應25、30、35、40℃恒溫箱中，避光染色，按照正交試驗設計分別等待5、10、15、20 h后取出培養(yǎng)皿，用蒸餾水將種子沖洗干凈，吸水紙吸干表面的水分，準備觀察。

1.3.3 觀察用鑷子將染色的種子從內果皮中取出，觀察種胚和胚乳染色面積及深淺并記錄。判斷種子生活力強弱的標準為：種胚和胚乳全部或大部分染成紅色、粉色，為生活力強；種胚和胚乳僅有少部分染成紅色、粉色，為生活力弱；種胚和胚乳未被染色，呈現(xiàn)黃色或白色，為無生活力［19-20］。

1.4 數(shù)據處理

采用Excel統(tǒng)計數(shù)據計算種子生活力（均值±標準差）、極大值、極小值以及各因素水平對應的總生活力（總生活力：每個因素水平對應的生活力之和）；Minitab18對數(shù)據進行方差分析、相關性分析與回歸分析。

2 結果與分析

2.1 唐古特白刺種子生活力測定正交試驗結果

對正交試驗結果進行極差分析（表2），比較各因素對測定結果的影響大小，極差值為：R2>R4>R3>R1>R5，即浸種時間對測定唐古特白刺生活力影響最大，其次是染色溫度，而影響較小的是TTC濃度、浸種溫度和染色時間。以各因素對應最大值來代表檢測生活力的最優(yōu)條件時，其中因素A（浸種溫度）最大值出現(xiàn)在水平4，因素B（浸種時間）最大值出現(xiàn)在水平3，因素C（TTC濃度）最大值出現(xiàn)在水平1，因素D（染色溫度）最大值出現(xiàn)在水平1，因素E（染色時間）最大值出現(xiàn)在水平4，即唐古特白刺在40℃下浸種15 h、0.1% TTC染色液、25℃恒溫、黑暗條件下染色20 h，染色效果最好。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

由正交試驗結果進行方差分析，由表3可知，試驗選取的5個影響因素都對試驗結果有極顯著影響（P<0.01），即說明浸種溫度、浸種時間、TTC濃度、染色溫度和染色時間都是影響唐古特白刺種子生活力測定的主要因素。

表3 方差分析結果Table 3 Results of analysis of variance

以3次試驗的結果分析得到種子生活力隨因素水平變化的生活力情況（圖1），隨因素A（浸種溫度）的水平變化，白刺種子生活力呈顯著性增大，在水平A4達到最大值；隨因素B（浸種時間）的水平變化，種子生活力在水平B3達到最大值，之前呈顯著性增大，后又顯著性減??；隨因素C（TTC濃度）的水平變化，種子生活力在水平C1到C2略有下降，后顯著減??；隨因素D（染色溫度）的水平變化，種子生活力先顯著減小，后顯著增大，但并沒有高于水平D1；隨因素E（染色時間）的水平變化，種子生活力呈顯著性增大、減小和增大，在水平E4達到最大值。

圖1 正交試驗直觀效果圖Figure 1 Visual effect diagram of orthogonal experiment

2.2 相關性分析

對5個直接影響種子染色的因素和種子生活力進行相關性分析，與種子生活力成正相關的因素是浸種溫度、浸種時間和染色時間，其中相關性最強的是浸種時間，達到極顯著水平，浸種溫度與染色時間均未達到顯著水平；與種子生活力成負相關的因素是TTC濃度和染色溫度，均未達到顯著水平。

多因素直接進行相關性分析，各因素之間存在相互影響，導致各因素與種子生活力之間的線性關系強弱存在偏差，在直接進行相關性分析的基礎上進行凈相關性分析（偏相關性分析），在控制部分因素的線性影響的條件下，再次分析各因素與種子生活力直接的線性關系。由表4可以看出，控制因素B（浸種時間）后，因素A（浸種溫度）和種子生活力呈顯著線性正相關，因素C（TTC濃度）和種子生活力呈顯著線性負相關；控制因素C（TTC濃度）后，因素A（浸種溫度）仍然和種子生活力呈顯著線性正相關；控制因素A（浸種溫度）后，因素D（染色溫度）、E（染色時間）與種子生活力的線性關系不顯著。

表4 偏相關分析Table 4 Partial correlation analysis

2.3 回歸分析

2.3.1 初步擬合回歸方程通過對5個因素和檢測結果進行分析，存在函數(shù)關系，構建檢測唐古特白刺種子生活力的數(shù)學模型，以種子生活力為因變量（Y），以5個直接影響種子染色的因素為自變量（X），采用回歸分析的方法擬合回歸方程，數(shù)據處理方法選擇“Enter”法，得到初步回歸方程：

初步擬合的回歸方程擬合度為65.3%，D-W值為3.061（在0～4之間）>2，說明存在負自相關現(xiàn)象，反之存在正自相關現(xiàn)象，而越接近2（一般在1.5～2.5之間認為正常）說明自相關性越弱，即殘差圖無明顯規(guī)律。擬合回歸方程呈現(xiàn)極顯著水平說明各回歸系數(shù)不同時為0，自變量和因變量的線性關系顯著，可建立線性模型。由初步擬合的回歸方程擬合度不高，僅可以預測試驗中65.3%的自變量和因變量之間的關系，對試驗結果進行常規(guī)檢驗。

2.3.2 回歸診斷并優(yōu)化方程對方程進行回歸診斷，結果（圖2）表現(xiàn)為：首先從正態(tài)概率圖中可以看到，數(shù)據集中在直線周圍分布，無明顯規(guī)律，其次在直方圖中滿足正態(tài)曲線，說明滿足擬合回歸方程的要求；在與擬合值圖和與順序圖中，呈現(xiàn)的是觀測值距離擬合方程的程度大小，用標準化殘差表示，在95%的置信區(qū)間內，標準化殘差取值在［-2，2］之間，超出此范圍，默認為異常值，如圖所示，結合此模型，計算得到COOK距離=0.4，DFITS=1.55，所有觀測值都在此范圍內，無強影響點。在確定不是由于輸入錯誤的情況下，剔除異常值后重新擬合回歸方程。

圖2 標準化殘差Figure 2 Standardized residual plot

（R2=0.768，調整R2=0.738，D-W=2.52）

式中：是i個觀測值被排除后算得的模型預測值，是對應的標準誤差，h(i)1/2是第i個杠桿率的平方根。

2.3.3 回歸系數(shù)的顯著性檢驗方程各系數(shù)表現(xiàn)為：常量>浸種時間>浸種溫度>染色時間>染色溫度>TTC濃度，標準誤差為：常量>TTC濃度>浸種時間=染色時間>染色溫度=浸種溫度，其中浸種溫度、浸種時間、染色溫度、染色時間均小于1。T值：浸種時間>浸種溫度>常量>染色時間>TTC濃度>染色溫度，其中生活力與浸種時間（PB<0.01）呈極顯著線性關系，與TTC濃度（PC<0.05）、染色溫度（PD<0.05）呈顯著線性關系，與其他因素系數(shù)沒有明顯線性關系。VIF很大程度的遠離10，說明5個因素變量之間無共線性關系（表5）。

表5 回歸模型Table 5 Regression model

2.3.4 回歸方程預測區(qū)間根據公式：

計算新擬合方程的預測區(qū)間，預測值所在范圍為26.5%～90.54%。

3 討論與結論

植物的一生起源于一粒種子，可種子萌發(fā)是植物生活史中最基礎也是最脆弱的階段，因此研究其過程及影響條件對植物一生有至關重要的意義［21］。唐古特白刺種子在不經預處理的情況下，由于其種子硬實現(xiàn)象導致自然發(fā)芽率低，發(fā)芽時間長［1，6，22］，難以在短時間內通過發(fā)芽試驗檢測一批種子的生活力強弱。使用TTC法可以快速檢測一批種子的質量，但不同植物種子對TTC染液的適應濃度不同，使用1.0%TTC（pH=7）染液避光對永瓣藤種子染色3 h，染色效果最好［23］；在40℃下，使用0.2%TTC染液染色2 h對南京椴種子的染色效果最好［24］；水稻種子吸水3 h后，在30℃下，1% TTC染液染色2 h的染色效果最好［25］。在這種情況下，本試驗通過設計正交表進行試驗，結果表明，唐古特白刺在35℃下浸種20 h、0.3%TTC染色液、25℃恒溫、黑暗條件下染色15 h，染色效果最好。而在極差分析中發(fā)現(xiàn)不同水平下，生活力變化差異較大，而當以各因素對應最大值為最優(yōu)條件篩選時，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)條件為40℃下浸種15 h、0.1%TTC染色液、25℃恒溫、黑暗條件下染色20 h，此結果與試驗得到的結果不同，相同的條件是染色溫度。對此，由于以最大值篩選的最優(yōu)條件未在試驗中，無法直接比較。但在相關性分析中發(fā)現(xiàn)，唐古特白刺的浸種時間對染色效果影響最大，在控制浸種時間的影響后，發(fā)現(xiàn)浸種溫度和TTC濃度對染色效果的影響次之，染色時間與染色溫度的影響較小，表明5個因素之間存在相互影響，這與雷慧霞等［26］在白鮮種子中的研究結果相似。綜上所述，35℃下浸種20 h、0.3% TTC染色液、25℃恒溫、黑暗條件下染色15 h此條件更適合唐古特白刺種子的生活力檢測。此篩選的最優(yōu)組合與曾彥軍等［27］對唐古特白刺的研究結果不同，其直接采用在20℃下浸種、1.0%TTC染液、30℃恒溫、黑暗條件下進行染色，每隔4 h觀察一次染色情況。

為了更好地了解5個因素對檢測種子生活力的影響，找到一個可以直觀反映其相關關系的直線，因此進行回歸分析。初步擬合方程，擬合程度不高，存在負自相關現(xiàn)象，常規(guī)檢驗后發(fā)現(xiàn)是存在異常值，出現(xiàn)異常值正好解釋以最大值篩選的最優(yōu)條件與試驗結果不符是由于異常值的存在，因此在剔除異常值組合后重新擬合方程，發(fā)現(xiàn)各因素系數(shù)間無共線性，此結果與偏相關分析結果一致，表明新方程擬合度高，具有預測唐古特白刺種子生活力的意義。

綜上所述，本研究篩選的最優(yōu)組合可以快速、準確的檢測一批唐古特白刺的種子生活力，并且回歸方程可以檢測試驗過程中是否出現(xiàn)異常值，可以為唐古特白刺的育苗造林提供參考。