MK571通過激活法尼醇X受體抑制肝臟膽汁酸合成

張明康，周燕，陳宇玥，勾雪艷，武新安，3

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730020；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)防控工程研究中心，甘肅 蘭州 730000）

膽汁酸主要由肝細(xì)胞合成并儲(chǔ)存在膽囊中，是體內(nèi)膽固醇代謝的重要途徑［1-2］。膽汁酸合成途徑主要有兩條，經(jīng)典途徑和替代途徑。經(jīng)典途徑主要由膽固醇-7α-羥化酶（cholesterol-7α-hydroxylase，CYP7A1）和膽固醇-12α-羥化酶（cholesterol-12αhydroxylase，CYP8B1）介導(dǎo)，產(chǎn)生至少70%的膽汁酸［3］。替代途徑主要由膽固醇-27α-羥化酶（choles‐terol-27α-hydroxylase，CYP27A1）介導(dǎo)［4-5］。膽汁酸的排泄主要通過膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistanceassociated protein 2，MRP2）排出［6］。此外膽汁酸還通過Na+依賴性?；悄懰釁f(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+tauro‐cholate cotransporting polypeptide，NTCP）和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2（organic anion transportingpolypep‐tide 2，OATP2）被肝細(xì)胞重吸收。法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）是肝臟和腸道中的膽汁酸的傳感器。細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度升高會(huì)激活FXR的轉(zhuǎn)錄，減少CYP7A1的表達(dá)，抑制膽汁酸合成。此外通過抑制NTCP的表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸的攝取，促進(jìn)BSEP的表達(dá)，增加膽汁酸的排泄［7］。膽汁酸代謝紊亂與肝膽代謝疾病密切相關(guān)［8］。膽汁酸的積累會(huì)形成不溶性鹽，并在膽管中沉淀，最終導(dǎo)致膽汁淤積，肝細(xì)胞損傷甚至肝硬化壞死［9-10］。因此膽汁酸的蓄積已成為誘發(fā)膽汁淤積，肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞損傷的重要因素［11］。

MK571是 一 種 白 三 烯D4（leukotriene D4，LTD4）和半胱氨酰白三烯受體1（cysteinyl leukotri‐ene receptor 1，CYSLTR1）抑制劑。據(jù)報(bào)道MK571可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、粘附分子和阻止內(nèi)皮氧化型谷胱甘肽的輸出，緩解氧化應(yīng)激，減輕炎癥［12-13］。MK571已成功應(yīng)用于氣道過敏、肺部炎癥和腎損傷等疾病［14］。此外MK571也是一種常用的多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated proteins，MRPs）抑制劑。抑制MRP5可以顯著減輕大鼠敗血癥引起的急性肺損傷［13，15］。同時(shí)MRP2作為肝臟膽汁酸另一條排泄途徑，受到MK571的抑制。然而目前關(guān)于MK571對(duì)膽汁酸合成影響的研究很少，機(jī)制更是不明。鑒于膽汁酸在肝損傷中的作用不可忽視，因此本研究主要探討MK571對(duì)肝臟膽汁酸合成及其調(diào)節(jié)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證號(hào)為SCXK（甘）2020-0002，飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物房，室溫25℃，晝夜12 h交替，試驗(yàn)期間動(dòng)物可以自由進(jìn)食、飲水。所有試驗(yàn)程序和動(dòng)物護(hù)理均在盡量減少動(dòng)物痛苦的條件下進(jìn)行，并嚴(yán)格遵循蘭州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)。

1.2 試驗(yàn)材料

MK571鈉鹽（純度>98%）（美國Med Chem Express公 司）；CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、BSEP和NTCP抗體（美國Abcom公司）；FXR和CYP7A1抗體（美國Santa Cruz公司）；RIPA裂解緩沖液（美國Thermo公司）；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

OLYMPUS AU400全自動(dòng)生化分析儀（日本OLYMPUS光學(xué)株式會(huì)社）；17/17R低溫高速離心機(jī)（美國Thermo公司）；Smart WLI光學(xué)顯微鏡（德國GBS公司）；LT-224S分析天平（北京賽多利斯公司）。

1.3 動(dòng)物分組及試驗(yàn)

供試SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為4組：MK571低、中、高劑量組和對(duì)照組，每組6只，分別每天腹腔注射5、10、20 mg/kg MK571和等體積生理鹽水，連續(xù)給藥7 d，每2 d記錄一次大鼠的體質(zhì)量。

1.4 大鼠肝功能指標(biāo)含量檢測

所有大鼠最后一次處理后，禁食過夜，次日用適量的乙醚麻醉。從腹主動(dòng)脈獲取3 mL血液樣品，立即以8 000 r/min離心10 min獲得血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）和總膽汁酸（TBA）含量。剩余血清儲(chǔ)存在-80℃冰箱中用于后續(xù)分析。

1.5 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化

收集完血液樣品后，立即采集肝組織。一部分放入液氮中快速冷凍，隨后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱。另一部分置于4%中性甲醛固定液中固定24 h，用于后續(xù)病理分析。HE染色：常規(guī)制備肝石蠟切片，梯度乙醇脫蠟，蘇木精伊紅染色，脫水，中性樹膠封片，再加蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。

1.6 UPLC-MS/MS測定大鼠血清和肝臟膽汁酸含量

取出低溫儲(chǔ)存的血清和肝臟樣品，使用UPLCMS/MS方法檢測膽汁酸含量。流動(dòng)相由乙酸銨-氨水溶液（A）（7.5 mmol/L乙酸銨，0.1%氨水，pH 7.5）和甲醇（B）組成。色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）。梯度洗脫比例：0～1 min，45% B→50% B；1～2 min，50% B→65% B；2～4 min，65% B；4～7 min，65% B→90%B；7～7.01 min，90% B→45% B；7.01～14 min，45%B。具體檢測條件見表1，注射體積為10μL，流速為0.2 mL/min，柱溫保持在30℃。

表1 膽汁酸的UPLC-MS/MS分析方法Table 1 UPLC-MS/MS analysis methods of bile acids

1.7 蛋白免疫印跡法分析

使用適量RIPA裂解緩沖液（RIPA∶PMSF=99∶1，V/V）裂解肝組織，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度以便調(diào)整上樣量。再通過SDS-PAGE電泳分離得到不同分子量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用脫脂牛奶在室溫下封閉1 h。之后PVDF膜 分 別 與 抗NTCP（Abcom，ab131084，1∶1 000）、抗CYP7A1（Santa Cruz，sc-25536，1∶1 000）、抗CYP27A1（Abcom，ab126785，1∶1 000）、抗CYP7A1（Abcom，ab191910，1∶1 000）、抗FXR（Santa Cruz，sc-25309，1∶500）、抗-β-actin（1∶3 000）抗體4℃搖床過夜。然后將膜在HRP偶聯(lián)的二抗（1∶4 000）中孵育1 h，并使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行檢測。最后用Image J軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析。試驗(yàn)中所有結(jié)果用表示，P<0.05表示差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MK571對(duì)大鼠肝功能生化指標(biāo)的影響

當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，血中AST和ALT水平升高［16］。由表2可知，與對(duì)照組相比，MK571干預(yù)后血清AST含量呈上升趨勢(shì)但無顯著性差異。高劑量組血清ALT水平顯著性降低（P<0.05）。中、高劑量組AST/ALT比值顯著性上升（P<0.05）。這些結(jié)果表明當(dāng)給予高劑量的MK571時(shí)會(huì)造成輕微的肝損傷。同時(shí)中、高劑量組TBIL和TBA含量均顯著降低（P<0.05）。因此認(rèn)為，MK571可引起輕微肝損傷，并降低血清TBA和TBIL含量.

表2 各組大鼠肝臟生化指標(biāo)變化（n=6）Table 2 Changes of liver biochemical indexes of rats in each group（n=6）

2.2 MK571對(duì)肝臟組織病理學(xué)變化的影響

HE染色結(jié)果見圖1。對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列規(guī)則，并且肝臟未出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤、膽管擴(kuò)張等病理損傷。但高劑量組肝臟匯管區(qū)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤（紅色箭頭），部分肝細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸性病變。HE結(jié)果顯示短期低劑量MK571不會(huì)引起肝細(xì)胞損傷，但高劑量MK571會(huì)引起肝臟輕度炎癥。

圖1 光學(xué)顯微鏡下肝組織HE染色結(jié)果觀察（×200）Figure 1 Observation of liver tissue HE staining result under an optical microscope（×200）

2.3 MK571對(duì)血清和肝臟膽汁酸含量的影響

膽汁酸存在于肝、胃、腎、腦和心臟等不同的器官中，擁有相同的初級(jí)膽汁酸（CA和CDCA）［17-18］。在嚙齒動(dòng)物中，CDCA可被羥基化為α-鼠膽酸（α-MCA），并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為β-鼠膽酸（β-MCA）。并且在大鼠血漿中，β-MCA和CA含量約占總膽汁酸的1/3。在人血漿中，GCDCA和GCA含量約占總膽汁酸的1/2［5］。

大鼠血清膽汁酸的含量檢測結(jié)果見圖2-A。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組大鼠血清GCA、CDCA含量顯著降低（P<0.05）；中、高劑量組血清LCA、GUDCA、GCDCA、CA含量顯著降低（P<0.05）；高劑量組血清TCA和GDCA含量顯著降低（P<0.05）；然而，中、高劑量組UDCA含量顯著升高（P<0.01）。結(jié)果表明MK571干預(yù)后，大鼠血清中初級(jí)膽汁酸（CA和CDCA）含量顯著減少；甘氨酸結(jié)合的膽汁酸（GCA，GUDCA，GCDCA，GDCA）和?；撬峤Y(jié)合的膽汁酸（TCA）顯著減少；UDCA含量顯著升高（P<0.05）.

大鼠肝臟膽汁酸的含量檢測結(jié)果見圖2-B。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組肝臟GCA、GCDCA、TUDCA（中劑量除外）含量均顯著降低（P<0.05）；中、高劑量組肝臟中GUDCA、UDCA、β-MCA的含量顯著降低（P<0.05）；高劑量組肝臟中CDCA和GDCA的含量顯著降低（P<0.05）；然而高劑量組DCA和LCA含量顯著升高（P<0.05）。結(jié)果表明MK571干預(yù)后，大鼠肝臟中初級(jí)膽汁酸（β-MCA和CDCA）含量顯著降低（P<0.05）；甘氨酸結(jié)合的膽汁酸（GCA、GUDCA、GCDCA、GDCA）和?；撬峤Y(jié)合的膽汁酸（TUDCA）含量均顯著減少（P<0.05）。結(jié)合血清和肝臟中的膽汁酸含量變化，發(fā)現(xiàn)MK571干預(yù)后，血清和肝臟中初級(jí)膽汁酸和?；撬?甘氨酸結(jié)合膽汁酸含量均出現(xiàn)顯著性降低。此外發(fā)現(xiàn)MK571可以增加血清中UDCA含量和肝臟中DCA和LCA含量。

圖2 大鼠血清和肝臟膽汁酸的含量Figure 2 The content of bile acids in the serum and liver of rat

2.4 MK571對(duì)大鼠血清和肝臟膽汁酸組成的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在正常大鼠體內(nèi)，游離型膽汁酸在血清中占大多數(shù)（圖3-A），而?；撬峤Y(jié)合的膽汁酸在肝臟中占大多數(shù)（圖3-B）。此外隨著MK571的干預(yù)，血清游離型膽汁酸比例增加，牛磺酸結(jié)合型膽汁酸的比例下降；在肝臟中，甘氨酸結(jié)合型膽汁酸的比例下降，牛磺酸結(jié)合型的膽汁酸比例增加。這些結(jié)果表明大鼠血清主要含有游離型膽汁酸，肝臟主要含有結(jié)合型膽汁酸，尤其是?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸。MK571干預(yù)后，大鼠血清和肝臟中游離型和結(jié)合型膽汁酸的比例發(fā)生變化。據(jù)此認(rèn)為MK571可影響大鼠血清和肝臟膽汁酸組成。

圖3 血清和肝臟中游離型和牛磺酸/甘氨酸結(jié)合型膽汁酸的比例Figure 3 The proportion of unconjugated and taurine/glycine conjugated bile acids in the serum and liver

2.5 MK571對(duì)肝臟膽汁酸相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的影響

膽汁酸的合成和排泄受許多代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控。當(dāng)給予MK571后，大鼠血清中總膽汁酸含量顯著降低，血清和肝臟中初級(jí)膽汁酸和甘氨酸/?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸含量顯著降低。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示（圖4）與對(duì)照組相比，中、高劑量組FXR、BSEP和NTCP的表達(dá)量均顯著增加（P<0.05）；低、中劑量組CYP7A1、CYP27A1、CYP8B1的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。以上結(jié)果表明MK571可激活FXR，下調(diào)CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1的表達(dá)，減少肝臟中膽汁酸的合成；上調(diào)BSEP的表達(dá)，促進(jìn)膽汁酸的排泄。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MK571對(duì)上述膽汁酸相關(guān)代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響不呈現(xiàn)劑量依賴性。

3 討論

與空白組比較，**表示P<0.01；*表示P<0.05。Compared with the control group，**represent P<0.01；*rep‐resent P<0.05.

膽汁酸存在于不同的器官中，并且以不同的形式（共軛/非共軛）和不同的比例存在［17］。據(jù)報(bào)道，通過檢測膽汁酸含量變化來檢測肝病要比一些傳統(tǒng)的方法更靈敏、更準(zhǔn)確［8］，其中用血清膽汁酸水平變化診斷肝病更靈敏可靠［19］。人體內(nèi)每天有將近500 mg的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸［20］。膽汁酸的主要合成部位是肝臟，同時(shí)受許多代謝酶的調(diào)控，CYP7A1主要催化CA和CDCA的合成，CYP8B1催化CA的合成，CYP27A1和CYP7B1催化CDCA的合成［4，21］。此外許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)膽汁酸的排泄和重吸收。BSEP是膽汁酸主要的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，幾乎只在肝臟中表達(dá)，介導(dǎo)95%的膽汁酸排泄到膽汁中［22-23］。NTCP和OATP2主要負(fù)責(zé)膽汁酸的重吸收［6］。FXR在維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)FXR被激活時(shí)，F(xiàn)XR通過誘導(dǎo)其下游靶基因小分子異二聚體伴侶受體（SHP）或成纖維細(xì)胞生長因子15/19（FGF15/19）的活性來抑制膽汁酸的合成［24］。已有研究報(bào)道大黃素通過增加FXR和BSEP的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)對(duì)小鼠膽汁淤積具有保護(hù)作用［25］。同時(shí)膽汁酸不僅是FXR的天然配體，還對(duì)FXR具有調(diào)節(jié)作用［10，26］。例如CDCA毒性較小，是一種有效的FXR配體；T-β-MCA和T-α-MCA是FXR拮抗劑［18］。據(jù)報(bào)道膽汁酸對(duì)FXR的親和力為：CDCA>LCA>DCA>CA，激活力為：CDCA>DCA>LCA［24］。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔注射不同劑量的MK571后，血清總膽汁酸含量顯著下降；大鼠肝臟中FXR和BSEP的表達(dá)顯著升高，CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表達(dá)量均有不同程度的降低；血清和肝臟初級(jí)膽汁酸和結(jié)合型膽汁酸含量顯著降低。此外發(fā)現(xiàn)肝臟LCA和DCA的含量顯著升高，以上結(jié)果提示LCA和DCA含量的增加激活了FXR通路，下調(diào)肝臟CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表達(dá)，上調(diào)BSEP的表達(dá)，可顯著降低大鼠血清和肝臟膽汁酸的含量。在生理?xiàng)l件下人體中大多數(shù)膽汁酸與甘氨酸結(jié)合，而在大鼠中，膽汁酸與?；撬峤Y(jié)合物占大多數(shù)［27-28］。此外甘氨酸結(jié)合的膽汁酸與肝損傷呈正相關(guān)［29］，?；撬峤Y(jié)合的膽汁酸對(duì)血管舒張和內(nèi)皮功能障礙具有有益作用，并且已成為門靜脈高壓癥的潛在治療方法［30］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著MK571的干預(yù)，血清和肝臟總膽汁酸的組成結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化。血清中游離型膽汁酸比例增加，?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸的比例下降；肝臟中甘氨酸結(jié)合型膽汁酸的比例下降，?；撬峤Y(jié)合型的膽汁酸比例增加。上述結(jié)果提示MK571在肝臟疾病方面具有潛在治療作用，但仍需要進(jìn)一步深入探究。

4 結(jié)論

MK571通過激活FXR，下調(diào)肝臟CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表達(dá)，上調(diào)BSEP的表達(dá)，顯著降低大鼠肝臟膽汁酸的合成。