傳統(tǒng)與強(qiáng)化發(fā)酵羊肉香腸微生物多樣性及代謝物差異分析

田海勇，蘇 偉,2,*，母應(yīng)春,2，姜 麗，趙 馳

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

發(fā)酵香腸是自然或人工控制條件下利用微生物發(fā)酵制成的具有良好貯藏性和特殊風(fēng)味的肉制品。羊肉因其低脂肪、低膽固醇和高優(yōu)質(zhì)蛋白等屬性?xún)?yōu)于豬肉[1]。以羊肉為原料，添加香辛料經(jīng)拌料、腌制、灌腸、發(fā)酵、干燥等工藝生產(chǎn)的羊肉香腸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于傳統(tǒng)的豬肉香腸。然而，傳統(tǒng)發(fā)酵羊肉香腸存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、品質(zhì)不穩(wěn)定、易受雜菌污染等問(wèn)題，限制了羊肉發(fā)酵香腸標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)。為提高香腸風(fēng)味品質(zhì)，且滿(mǎn)足消費(fèi)者對(duì)營(yíng)養(yǎng)健康追求，外源微生物被作為發(fā)酵劑用于制作香腸[2]。

目前，發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于肉制品中，通過(guò)接種特定發(fā)酵劑可以提高產(chǎn)品品質(zhì)；促進(jìn)醛類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)等良好風(fēng)味物質(zhì)形成。此外，添加發(fā)酵劑還可縮短成熟時(shí)間，提高產(chǎn)品安全性[3]。研究表明，乳酸菌作為發(fā)酵香腸中活性微生物在不同類(lèi)型發(fā)酵香腸中具有促進(jìn)蛋白質(zhì)水解和積累小分子肽的作用，還可利用碳水化合物產(chǎn)生的乙酸、甲酸、琥珀酸，使香腸具有特殊風(fēng)味[4]。其次，乳酸菌，尤其是乳酸菌屬和片球菌屬，可產(chǎn)生有機(jī)酸，主要是乳酸和乙酸，使肉糜酸化，抑制大多數(shù)有害食品微生物生長(zhǎng)[5]。如，曾志剛等[6]從香腸中分離得到了產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。在許多發(fā)酵香腸制品，如意大利[7]、希臘[8]等香腸表面都發(fā)現(xiàn)了霉菌，這些霉菌的生長(zhǎng)，為香腸提供了特有風(fēng)味。米根霉（Rhizopus oryzae）在共同培養(yǎng)下生長(zhǎng)不受乳酸菌抑制，可明顯促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)，且其代謝的酶具有分解蛋白和脂肪的能力，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味形成有重要作用[9]。

高通量測(cè)序（high throughput sequencing，HTS）技術(shù)是分析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落及相對(duì)豐度的重要工具，被廣泛用于發(fā)酵食品微生物多樣性的研究[10]。如Hu Yingying等[11]通過(guò)HTS研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）為東北5 個(gè)地區(qū)干香腸的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。代謝組學(xué)是一種旨在全面監(jiān)測(cè)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的新型組學(xué)技術(shù)，在近幾十年發(fā)展迅速[12]；其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）法具有檢出限低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)用于定性和定量分析，已在食品雜環(huán)胺檢測(cè)[13]、代謝物檢測(cè)[14]等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，適用于香腸中非揮發(fā)性成分的檢測(cè)分析。目前文獻(xiàn)多以探究羊肉香腸微生物多樣性和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為主[15-16]，關(guān)于傳統(tǒng)和強(qiáng)化發(fā)酵羊肉香腸中核心微生物挖掘鮮有報(bào)道。

本研究采用HTS技術(shù)、頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）和HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)與強(qiáng)化發(fā)酵羊肉香腸中微生物群落及代謝物差異進(jìn)行分析，并評(píng)價(jià)微生物與顯著差異代謝物（significantly differential metabolites，SDMs）之間的關(guān)系，以期為羊肉香腸中功能微生物的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊瘦肉、羊肥膘 貴州麻陽(yáng)河食品有限責(zé)任公司；食鹽、蔗糖、白酒、腸衣 貴州省花溪區(qū)合力超市；乳酸片球菌 中國(guó)工業(yè)微生物發(fā)酵劑保藏管理中心；米根霉 廣東省微生物發(fā)酵劑保藏管理中心。

E.Z.N.A.?Soil DNA提取試劑盒 美國(guó)Omega BioTek公司；FastPfu聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；建庫(kù)試劑盒 美國(guó)Bioo Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3測(cè)序試劑盒 美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Quantus? Fluorometer微型熒光計(jì) 美國(guó)Promega公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；MiSeq測(cè)序儀美國(guó)Illumina公司；Trace1300-TSQ8000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵羊肉香腸的制備

菌液及羊肉香腸的制備參考李靜雯[17]的方法。以傳統(tǒng)（不添加菌種）為對(duì)照組。每個(gè)樣品重復(fù)制備3 次。

乳酸片球菌按說(shuō)明書(shū)活化2 代，接種于乳酸片球菌種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，再?gòu)姆N子培養(yǎng)基中取2%菌液加入擴(kuò)大培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，6 000 r/min離心10 min，去上清液，用生理鹽水清洗3 次，加入無(wú)菌水，調(diào)整活菌數(shù)至 108CFU/mL。

米根霉按說(shuō)明書(shū)活化2 代，轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d，取斜面培養(yǎng)基加入5 mL無(wú)菌水并輕輕刮下孢子，重復(fù)清洗3 次，合并孢子液反復(fù)振蕩后用帶有滅菌脫脂棉的漏斗過(guò)濾，得到孢子液，調(diào)整孢子液濃度為107CFU/mL。

傳統(tǒng)發(fā)酵（CT）：羊肉瘦肥質(zhì)量比8∶2，加入2%鹽、0.7%蔗糖、1.5%高度白酒、15%冰水（4 ℃冷藏1 d）。

強(qiáng)化發(fā)酵（QH）：羊肉瘦肥質(zhì)量比8∶2，加入2%鹽、0.7%蔗糖、1.5%高度白酒、15%冰水（4 ℃冷藏1d），2%復(fù)配菌液（復(fù)配比為乳酸片球菌-米根霉1∶1）。

1.3.2 總DNA 提取和PCR擴(kuò)增

按E.Z.N.A.?Soil試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提。用正反引物（338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)16S rRNA的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，真菌使用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）在ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)分析

色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，不分流模式。升溫程序：50 ℃保持5 min，以5 ℃/min速率升至200 ℃，最后以20 ℃/min的速率升至250 ℃并保持10 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電子能量為70 eV，傳輸線(xiàn)和離子源溫度為280 ℃和230 ℃，掃描范圍m/z50～450。

定量分析：以20 μg/mL環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中各物質(zhì)含量，公式如下：

式中：Ci和Ai分別為待測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)含量/（μg/kg）和峰面積；Cis和Ais分別為內(nèi)標(biāo)物含量/（μg/kg）和峰面積。

1.3.4 非揮發(fā)性物質(zhì)分析

1.3.4.1 代謝物提取

將50 mg樣品4 ℃、10 000 r/min 離心15 min，移取上清液10 μL至EP管，加入含有內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸，2 μg/mL）的1 000 μL提取液（乙腈∶甲醇∶水=2∶2∶1）。在30 s渦旋后，在冰浴超聲5 min，重復(fù)2 次以上操作。在－40 ℃孵育1 h后于4 ℃、10 000 r/min離心15 min。將825 μL上清液移至新管，在真空濃縮器中于37 ℃干燥水分。在200 μL 50%乙腈溶液中重構(gòu)10 min。將構(gòu)造物4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取75 μL上清液于進(jìn)樣瓶中用于HPLC-MS/MS分析。

1.3.4.2 非揮發(fā)性代謝物分析

使用配有UPLC BEH Amide柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）的Waters 1290 Infinity系列超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動(dòng)相由25 mmol/L乙酸銨-25%氫氧化銨溶液（pH 9.75）（A）和乙腈（B）組成。梯度洗脫（0～0.5 min，5% A、95% B；0.5～0.7 min，5%～35% A、95%～65% B；7.0～8.0 min，35%～60% A、65%～40% B；8.0～9.0 min，35% A、40% B；9.0～9.1 min，60%～5% A、40%～95% B；9.1～12.0 min，5% A、95% B）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣器溫度4 ℃，進(jìn)樣體積1 μL。TripleTOF 6600質(zhì)譜用于在HPLC-MS/MS實(shí)驗(yàn)期間在信息依賴(lài)性下獲取MS/MS譜圖。電噴霧離子源設(shè)定如下：氣體1為60 psi，氣體2為60 psi，簾幕氣體為35 psi，源溫度為600 ℃，去聚集電位為60 V，離子噴霧電壓浮動(dòng)為5 000 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Student’sttest確定P＜0.05的顯著性水平。使用SIMCA 14.1對(duì)代謝物數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）?；贠PLS-DA模型，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）結(jié)合變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值大于1的代謝物作為SDMs（|FC|＞2，P＜0.05，VIP＞1）。Cytoscape v3.8.2用于相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肉香腸微生物多樣性分析

采用Illumina MiSeq測(cè)序?qū)鹘y(tǒng)和強(qiáng)化發(fā)酵羊肉香腸微生物群落組成進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)量過(guò)濾后，所有樣品細(xì)菌和真菌分別獲得216 815 條和309 844 條優(yōu)列。由圖1和表1可知，基于可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）的稀釋曲線(xiàn)趨于平坦，且覆蓋率均大于99%，說(shuō)明獲得的序列足以代表每個(gè)樣本的多樣性[18]。

圖1 CT和QH細(xì)菌（A）和真菌（B）稀釋性和Shannon指數(shù)曲線(xiàn)Fig. 1 Rarefaction and Shannon index curves of bacteria (A) and fungi (B)in naturally fermented and starter culture-fermented mutton sausages

分別用Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)描述樣本中微生物群落的物種豐富度和多樣性[19]。如表1所示，在細(xì)菌豐富度和多樣性方面，QH組Chao 1和Shannon指數(shù)均高于CT組，但無(wú)顯著差異，表明強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)細(xì)菌的豐富度和多樣性無(wú)顯著影響。在真菌豐富度和多樣性方面，CT組Chao 1指數(shù)略大于QH組，而QH組Shannon指數(shù)顯著高于CT組（P＜0.05），表明強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)真菌多樣性影響顯著。

表1 樣品中微生物的物種豐富度和多樣性分析Table 1 Species richness and diversity analysis of microorganisms in sausage samples

2.2 羊肉香腸中菌群組成分析

根據(jù)OTU在不同分類(lèi)水平的物種分類(lèi)信息，由圖2A可知，CT和QH均以厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，在CT和QH中分別占91.46%和77.49%；Kamilari等[20]也在研究中發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌。真菌方面，子囊菌門(mén)（Acomycota）為CT和QH的優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)，分別占99.86%和99.11%；Wen Rongxin等[21]研究發(fā)現(xiàn)哈爾濱干香腸中真菌以子囊菌門(mén)為主。此外，QH組接合菌亞門(mén)（Mucoromycota，0.33%）高于CT組（0.01%），這可能與QH中接種的米根霉適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境快速繁殖有關(guān)。

在屬水平上共鑒定出43 個(gè)細(xì)菌屬，選取平均豐度前10的屬進(jìn)行分析。由圖2B1可知，CT以明串珠菌屬（Leuconostoc，71.77%）占優(yōu)勢(shì)，其次為拉恩氏菌屬（Rahnella，5.88%）。QH以明串珠菌屬（30.72%）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix，24.65%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter，19.12%）、片球菌屬（Pediococcus，13.59%）占優(yōu)勢(shì)。與CT（71.77%）相比，QH（30.72%）組明串珠菌屬占比減小，而片球菌屬占比顯著增大（CT：0.57%；QH：13.59%），可能是明串珠菌屬與接種的乳酸片球菌在發(fā)酵環(huán)境中存在拮抗或營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)。本研究鑒定出多個(gè)乳酸菌，如明串菌屬、片球菌屬、腸球菌屬（Enterococcus）、unspecified_Lactobacillales和肉桿菌屬（Carnobacterium）。有研究報(bào)道乳酸菌是發(fā)酵香腸中的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，不僅通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)菌素，還參與生化反應(yīng)（如糖酵解、蛋白質(zhì)水解和脂解）對(duì)發(fā)酵制品pH值變化及風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要[22]。此外，還檢測(cè)出一些條件致病菌（如拉恩氏菌屬、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、unspecified_Enterobacteriaceae），它們?cè)赒H組相對(duì)豐度均小于CT組；該結(jié)果表明強(qiáng)化發(fā)酵不僅影響細(xì)菌豐度變化，也有利于提高產(chǎn)品安全性。

樣品中共檢測(cè)出33 個(gè)真菌屬，選取豐度前10的真菌進(jìn)行分析（圖2B2）。德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）是兩組香腸中的優(yōu)勢(shì)屬，但其在CT組（94.78%）的相對(duì)豐度顯著高于QH組（58.99%）。青霉菌屬（Penicillium，32.44%）是QH組中第2優(yōu)勢(shì)屬；說(shuō)明強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)羊肉香腸的優(yōu)勢(shì)真菌有重要影響。強(qiáng)化發(fā)酵后，樣品中曲霉屬（Aspergillus）、unspecified_Aspergillaceae、unspecified_Capnodiales、unspecified_Pleosporales、根霉屬（Rhizopus）等豐度均高于CT組。這些結(jié)果表明強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，提高了物種多樣性和復(fù)雜性，這與上述真菌多樣性結(jié)果一致。

圖2 香腸樣品中細(xì)菌、真菌在門(mén)水平（A）和屬水平（B）上的相對(duì)豐度Fig. 2 Relative abundance of bacteria and fungi at phylum (A) and genus levels (B) in sausage samples

2.3 傳統(tǒng)與強(qiáng)化發(fā)酵香腸中揮發(fā)性物質(zhì)分析

2.3.1 傳統(tǒng)與強(qiáng)化發(fā)酵香腸揮發(fā)性物質(zhì)組成

如表2所示，所有共鑒定出76種揮發(fā)性組分，包含酯類(lèi)17種、醛類(lèi)16種、醇類(lèi)13種、烴類(lèi)10種、酸類(lèi)8種、酮類(lèi)3種及其他類(lèi)9種。其中CT組66種，以醛類(lèi)為主，QH組70種，以酯類(lèi)和醛類(lèi)為主。

酯類(lèi)主要由醇類(lèi)和酸類(lèi)發(fā)生酯化反應(yīng)生成，對(duì)發(fā)酵香腸風(fēng)味有特殊貢獻(xiàn)[23]。兩組香腸中酯類(lèi)存在顯著差異，QH組中酯類(lèi)含量為300.82 μg/kg，較CT組（73.56 μg/kg）顯著提高。癸酸乙酯和辛酸乙酯為樣品中主要酯類(lèi)，而乙酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯僅在QH組中檢出，它們分別呈果香、酒香、菠蘿味、蜂蜜香[24]。表明強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)羊肉香腸特有風(fēng)味形成有重要作用。

兩組香腸中醛類(lèi)占比較大，均達(dá)到35.75%以上。說(shuō)明醛類(lèi)是香腸中的主要風(fēng)味物質(zhì)，由于其閾值較低對(duì)香腸風(fēng)味有重要作用。兩組香腸中壬醛（柑橘味）、苯甲醛（焦糖味）、反式-2-壬醛（黃瓜味）含量均較高[25]。己醛具青草味，其含量可反映脂肪氧化程度。QH組己醛含量為56.06 μg/kg，是CT（10.35 μg/kg）的5.4 倍；此結(jié)果表明強(qiáng)化發(fā)酵促進(jìn)了香腸醛香味的生成。

醇類(lèi)和酸類(lèi)是香腸中重要的揮發(fā)性物質(zhì)。醇類(lèi)源于微生物對(duì)糖的代謝或脂類(lèi)的氧化和降解。本研究共鑒定出12種醇，其中1-辛烯-3-醇（（15.66±0.65）μg/kg）是QH組中含量最高的醇類(lèi)，是CT組的2.9 倍。1-辛烯-3-醇由脂質(zhì)氧化形成，具有較低的閾值，呈典型的蘑菇味[26]。酸類(lèi)可能來(lái)源于甘油和磷脂的氧化降解及美拉德反應(yīng)，短鏈酸由于其低嗅覺(jué)閾值而在香氣形成中起重要作用；而較長(zhǎng)鏈酸，如辛酸閾值較高，不會(huì)直接影響香腸的風(fēng)味感知，但其可作為其他風(fēng)味的前體[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，CT組酸類(lèi)和醇類(lèi)顯著高于QH組，可能是強(qiáng)化發(fā)酵促進(jìn)了QH組中酸和醇類(lèi)物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯，這一推斷與上述酯類(lèi)物質(zhì)含量變化結(jié)果一致。此外，兩組香腸中烴類(lèi)、酮類(lèi)和其他類(lèi)代謝物含量無(wú)顯著差異。

表2 CT和QH中揮發(fā)性成分Table 2 Volatile components in sausage samples

續(xù)表2

續(xù)表2

2.3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

圖3 CT和QH中揮發(fā)性代謝物OPLS-DA得分圖（A）和置換檢驗(yàn)圖（B）Fig. 3 OPLS-DA score (A) and permutation test (B) plots for volatile metabolites in sausage samples

2.3.3 傳統(tǒng)與強(qiáng)化發(fā)酵香腸顯著差異揮發(fā)性代謝物變化分析

基于OPLS-DA結(jié)果，以|FC|＞2且VIP＞1、P＜0.05為指標(biāo)，共篩選出29種SDMs（表3），其中上調(diào)的物質(zhì)有14種，包含酯類(lèi)7種、醇類(lèi)3種、醛類(lèi)2種、烯烴1種和2-甲基戊酸酐1種。下調(diào)的物質(zhì)有15種，包括醛類(lèi)2種，醇類(lèi)5種，酸類(lèi)5種，烷烴、酮類(lèi)和醚各1種。

表3 CT和QH中揮發(fā)性SDMs分析Table 3 Analysis of significantly differential volatile metabolites in sausage samples

2.4 傳統(tǒng)與強(qiáng)化發(fā)酵羊肉香腸中非揮發(fā)性代謝物分析

2.4.1 傳統(tǒng)與強(qiáng)化發(fā)酵香腸非揮發(fā)性代謝物分析

采用配備Q-TOF高分辨率分析儀的HPLC-MS/MS對(duì)兩組香腸樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，共鑒定出375種非揮發(fā)性代謝物，有氨基酸及其衍生物108種、生物堿59種、有機(jī)酸及其衍生物54種、萜類(lèi)44種、酯類(lèi)32種、核酸及其衍生物18種、甾體18種、維生素及其衍生物13種、碳水化合物9種、其他20種。

圖4 CT與QH中非揮發(fā)性代謝物OPLS-DA得分圖（A）和置換檢驗(yàn)（B）Fig. 4 OPLS-DA score (A) and permutation test (B) plots for nonvolatile metabolites in sausage samples

為更好地了解樣品組間的非揮發(fā)性代謝物，進(jìn)行了OPLS-DA。由圖4可知，兩組樣品完全分離，模型和Q2值分別為0.924、0.992和0.984。說(shuō)明模型構(gòu)建成功，具有很高的擬合度和預(yù)測(cè)能力，適合探索不同發(fā)酵方式下羊肉香腸的非揮發(fā)代謝物差異。

2.4.2 傳統(tǒng)與強(qiáng)化發(fā)酵香腸顯著差異非揮發(fā)性代謝物變化分析

基于OPLS-DA結(jié)果，以|FC|＞2且VIP＞1、P＜0.05為指標(biāo)，共篩選出16種SDMs（表4），其中上調(diào)9種，有氨基酸及其衍生物3種，有機(jī)酸4種，生物堿和萜類(lèi)物質(zhì)各1種；下調(diào)7種，包括碳水化合物2種，核酸及其衍生物2種，生物堿、維生素及其衍生物、酯類(lèi)各1種。

表4 CT和QH中非揮發(fā)性SDMsTable 4 Significantly differential non-volatile metabolites in sausage samples

2.5 羊肉發(fā)酵香腸微生物與SDMs的相關(guān)性分析

羊肉發(fā)酵香腸中代謝物的產(chǎn)生與微生物活動(dòng)密不可分，為挖掘與羊肉香腸SDMs呈強(qiáng)相關(guān)性的核心微生物?；赑earson相關(guān)系數(shù)揭示微生物與SDMs之間的相關(guān)性。圖5A表明，7 個(gè)細(xì)菌屬（明串珠菌屬、環(huán)絲菌屬、片球菌屬、嗜冷桿菌屬、腸球菌屬、拉恩氏菌屬和葡萄球菌屬）與SDMs高度相關(guān)（|r|＞0.8，P＜0.05）。其中明串珠菌屬、片球菌屬、腸球菌屬和葡萄球菌屬已經(jīng)被證實(shí)為發(fā)酵香腸中的重要細(xì)菌屬，它們?cè)谙隳c發(fā)酵和成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。乳酸菌的酸化作用對(duì)羊肉香腸發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味發(fā)展和不良菌群的控制具有重要作用[20]。明串珠菌屬、嗜冷桿菌屬分別與40種和42種SDMs具有強(qiáng)相關(guān)性，表明它們對(duì)香腸風(fēng)味形成有重要貢獻(xiàn)作用。其中明串珠菌屬與麥芽糖、海藻糖、煙酰胺、肌苷和次黃嘌呤呈強(qiáng)正相關(guān)，與酯類(lèi)、醛類(lèi)、氨基酸和醇類(lèi)呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)。這與Lee等[28]研究結(jié)果不符，可能是由其與QH中接種的乳酸片球菌存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系導(dǎo)致。嗜冷桿菌屬與酯類(lèi)（V1～V6）、氨基酸（N1～N5）、醛類(lèi)、醇類(lèi)呈正相關(guān)，與酸類(lèi)、碳水化合物、肌苷和次黃嘌呤呈負(fù)相關(guān)；這可能與其能水解蛋白質(zhì)和分解脂類(lèi)有關(guān)[29]。環(huán)絲菌屬與D-脯氨酸、鳥(niǎo)氨酸、DL-正纈氨酸和月桂烯呈正相關(guān)，與正十五烷呈負(fù)相關(guān)。此外，葡萄球菌屬、拉恩氏菌屬雖為條件致病菌，但它們可以產(chǎn)生一系列酶，有助于風(fēng)味形成。據(jù)報(bào)道，葡萄球菌屬蛋白酶和脂肪酶活性較高，有助于發(fā)酵肉制品中特征風(fēng)味的生成[30]。

圖5B顯示，7 個(gè)真菌屬（德巴利氏酵母屬、青霉屬、曲霉屬、unspecified_Aspergillaceae、unspecified_Capnodiales、根霉屬和unspecified_Basidiomycota）與SDMs高度相關(guān)（|r|＞0.8，P＜0.05）。曲霉屬、德巴利氏酵母屬、青霉屬分別與43、25、21種SDMs具有強(qiáng)相關(guān)性，對(duì)香腸風(fēng)味形成貢獻(xiàn)較大。曲霉屬與酯類(lèi)（V1～V7）、D-脯氨酸、硬脂炔酸、鳥(niǎo)氨酸、3-吲哚乙酸等呈強(qiáng)正相關(guān)，與碳水化合物、酸類(lèi)和醇類(lèi)呈負(fù)相關(guān)。曲霉屬能夠分泌糖化酶用以分解淀粉，是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中與風(fēng)味形成相關(guān)的重要微生物[31]。青霉屬與酯類(lèi)（V2～V7）、正己醛、1-辛烯-3-醇等呈正相關(guān)，與碳水化合物、次黃嘌呤、肌苷等呈負(fù)相關(guān)。Mu等[32]研究發(fā)現(xiàn)青霉屬與有機(jī)酸密切相關(guān)。而有機(jī)酸可進(jìn)一步與醇類(lèi)反應(yīng)形成酯。德巴利氏酵母屬與大多數(shù)醇類(lèi)和酯類(lèi)之間呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，這與陳倩等[33]研究發(fā)現(xiàn)一致，unspecified_Capnodiales與癸酸乙酯和棕櫚酸乙酯呈強(qiáng)正相關(guān)。根霉菌屬與DL-正纈氨酸呈強(qiáng)正相關(guān)。這可能與米根霉能在適宜條件下產(chǎn)蛋白酶有關(guān)[34]。unspecified_Basidiomycota與9,10-二羥基-12(Z)-十八碳烯酸呈正相關(guān)，而unspecified_Aspergillaceae與單油酸甘油酯呈負(fù)相關(guān)。

圖5 細(xì)菌（A）、真菌（B）與SDMs間相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 Correlation network diagrams for bacteria (A) and fungi (B)versus SDMs

3 結(jié) 論

以不同發(fā)酵方式下的羊肉香腸為研究對(duì)象，采用Illumina HTS技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)分析其微生物組成和代謝產(chǎn)物之間的差異，并通過(guò)相關(guān)性分析確定香腸中與代謝物形成相關(guān)的核心微生物。結(jié)果表明，強(qiáng)化發(fā)酵顯著影響了羊肉香腸菌落結(jié)構(gòu)及微生物豐度，在屬水平上，傳統(tǒng)發(fā)酵中明串珠菌屬、環(huán)絲菌屬和德巴利氏酵母屬為主要微生物；而強(qiáng)化發(fā)酵中的主要微生物為明串珠菌屬、環(huán)絲菌屬、嗜冷桿菌屬、片球菌屬、德巴利氏酵母屬和青霉屬。從兩種香腸中分別篩選出29種揮發(fā)性和16種非揮發(fā)性代謝物為SDMs。相關(guān)性結(jié)果顯示，7 個(gè)細(xì)菌屬（明串珠菌屬、環(huán)絲菌屬、片球菌屬、嗜冷桿菌屬、腸球菌屬、拉恩氏菌屬和葡萄球菌屬）和7 個(gè)真菌屬（德巴利氏酵母屬、青霉屬、曲霉屬、unspecified_Aspergillaceae、unspecified_Capnodiales、根霉屬和unspecified_Basidiomycota）被視為兩種羊肉香腸的核心微生物。這為羊肉香腸產(chǎn)品功能微生物的研究奠定了理論基礎(chǔ)。