基于柚皮苷的甜味二氫查耳酮衍生物合成及其評價

黎志豪，黃寶華,*，甄維聰，周金林，盧宇靖

（1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東金駿康生物技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528225；3.梅州金柚康健康科技有限公司，廣東 梅州 514021；4.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

二氫查耳酮是黃酮類化合物中的一類，含有如圖1所示的基本骨架。天然二氫查耳酮主要以糖苷形式存在于薔薇科、殼斗科植物中，如多穗柯葉中的三葉苷、根皮苷和3-羥基根皮苷[1]。研究表明，大多數(shù)二氫查耳酮糖苷沒有毒性，水溶性和穩(wěn)定性比非糖苷類的二氫查耳酮高[2-3]。糖基類型、數(shù)目和連接位點的不同使二氫查耳酮類化合物的結(jié)構(gòu)具有多樣性，從而具有廣泛的生物活性。據(jù)報道，三葉苷可以通過調(diào)節(jié)線粒體活性氧的內(nèi)穩(wěn)態(tài)減少雙氧水對大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的氧化損傷[4]；根皮苷對糖尿病具有治療和預(yù)防作用[5-6]。已發(fā)現(xiàn)一些二氫查耳酮具有高甜、低熱量的特性，如新橙皮苷二氫查耳酮（neohesperidin dihydrochalcone，NHDC）甜度約是蔗糖的1 000 倍，柚皮苷二氫查耳酮（naringin dihydrochalcone，NarDC）是蔗糖的300 倍[7]。NHDC是很好的苦味抑制劑[8]，NHDC、橙皮素二氫查耳酮-7-葡萄糖苷（hesperetin dihydrochalcone-7-O-glucoside，HDC-7-G）和新地奧明的三元復(fù)配物能有效降低柑橘果酒的苦味[9]。但并非所有二氫查耳酮都具有甜味，如根皮素僅有微弱的甜味[10]，而橙皮素二氫查耳酮具有較強(qiáng)的甜味[11]，二者結(jié)構(gòu)相似，差異在B環(huán)上，前者連有4’-OH，后者連有3’-OH和4’-OCH3。Winnig等[12]運(yùn)用突變分析結(jié)合功能研究，通過分子建模，確認(rèn)人類甜味受體上具有NHDC的結(jié)合位點。有研究提及二氫查耳酮甜味強(qiáng)度似乎與A環(huán)上的羥基個數(shù)有關(guān)[13]；當(dāng)B環(huán)上兩個相鄰取代基之間有氫鍵形成時，則會導(dǎo)致與受體的結(jié)合程度減弱而使甜味降低[11]。本實驗利用廉價易得的柚皮苷為前體，合成一系列B環(huán)上有不同取代基的二氫查耳酮衍生物，以期篩選出安全無毒、高甜和具有良好生物活性的化合物?；诟泄僭u價和電子舌檢測結(jié)果探究二氫查耳酮衍生物的結(jié)構(gòu)與甜味的相關(guān)性，為開發(fā)安全高效的甜味劑、矯味劑提供科學(xué)參考。

圖1 二氫查耳酮的骨架結(jié)構(gòu)Fig. 1 Backbone structure of dihydrochalcone

電子舌是近年發(fā)展起來的一種智能味覺分析技術(shù)，其客觀性和可比性優(yōu)于感官評價法。目前已廣泛應(yīng)用于食品的味道評價[14]。日本Insent公司開發(fā)的甜味傳感器是基于表面的人工雙層脂質(zhì)膜和呈味物質(zhì)之間產(chǎn)生氫鍵作用[15-16]、靜電作用和疏水作用[17-18]引起膜電位的變化被分析器捕獲，對食品和飲料的甜味強(qiáng)度進(jìn)行量化[19]。本課題組前期工作證實，該甜味傳感器對二氫查耳酮化合物甜味評價具有一定的可靠性[20]。本實驗利用感官評價和電子舌檢測相結(jié)合對相關(guān)化合物甜味進(jìn)行評價和比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK2） 武漢普諾賽生命科技有限公司。

苯甲醛 廣州化學(xué)試劑廠；對甲氧基苯甲醛北京伊諾凱科技有限公司；4-氯苯甲醛 阿達(dá)瑪試劑有限公司；吡咯烷、3,5-二甲基-4-羥基苯甲醛、3,4,5-三甲氧基苯甲醛、2-羥基苯甲醛 上海麥克林生化科技有限公司；香草醛、3-羥基苯甲醛、3-氟苯甲醛、3-氯苯甲醛、對甲基苯甲醛、對氟苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛、噻唑藍(lán) 阿拉丁試劑有限公司；蔗糖 天津市大茂化學(xué)試劑廠；以上及其余常規(guī)試劑均為分析純；柚皮苷、NarDC、NHDC、三葉苷、HDC-7-G、根皮苷（純度均不小于98%） 廣東金駿康生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE III HD 400型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 瑞士Bruker公司；SA-402B味覺分析系統(tǒng) 日本Insent公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀、Forma 3111二氧化碳培養(yǎng)箱 美國賽默飛公司；SGW?X-4A顯微熔點儀 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 二氫查耳酮衍生物的合成及表征

1.3.1.1 合成

合成方法如圖2所示。

參照文獻(xiàn)[21]合成化合物根皮乙酰苯-4’-β-新橙皮苷。稱取一定量柚皮苷加入12% NaOH溶液，100 ℃攪拌回流2 h。經(jīng)冷卻，加入鹽酸溶液中和，析出黃色固體后經(jīng)抽濾、去離子水洗滌、75%乙醇溶液重結(jié)晶、抽濾和減壓干燥等步驟得到淡黃色粉末根皮乙酰苯-4’-β-新橙皮苷。

參照文獻(xiàn)[22]合成化合物3a～3m。以3a為例，稱取根皮乙酰苯-4’-β-新橙皮苷溶于一定量的無水乙醇，依次加入苯甲醛、乙酸和吡咯烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)下80 ℃攪拌24 h，過濾收集析出的固體，經(jīng)去離子水洗滌、真空干燥得到白色粉末固體（3a）。其余化合物的合成不需要氮?dú)獗Ｗo(hù)。3c～3f、3h～3m不能析出固體，需利用硅膠柱層析分離，選用V（二氯甲烷）∶V（甲醇）=8∶2的混合溶劑作為洗脫劑。

參照文獻(xiàn)[23]合成化合物4a～4m。以4a為例，稱取一定量3a于50 mL圓底燒瓶中，加入5% NaOH溶液，超聲輔助溶解后加入鈀碳催化劑，通入氫氣，30 ℃反應(yīng)24 h。其后緩慢加入稀鹽酸中和、抽濾析出的固體得到4a。4c、4e、4f、4i不能直接析出固體，需經(jīng)乙酸乙酯萃取、洗滌、干燥、旋蒸可獲得產(chǎn)物。

1.3.1.2 表征

4a（白色固體）：熔點144.7～148.2 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.30（s, 2H）、7.32～7.23（m, 4H）、7.18（tq,J＝6.1, 2.3, 1.9 Hz, 1H）、6.01（s, 2H）、5.35～5.25（m, 1H）、5.14～5.02（m, 3H）、4.66（dd,J＝9.2, 4.5 Hz, 2H）、4.56（d,J＝5.7 Hz, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.68（dt,J＝5.7, 3.5 Hz, 2H）、3.45～3.43（m, 1H）、3.32（d,J＝5.9 Hz, 7H）、3.22～3.15（m, 2H）、2.90（t,J＝7.6 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.26、164.22、163.39、141.99、128.80、126.31、105.75、101.09、97.57、95.27、77.62、77.30、77.08、72.31、70.98、70.87、69.91、68.80、60.75、45.70、30.49、18.60。

圖2 二氫查耳酮衍生物的合成Fig. 2 Synthesis of the dihydrochalcone derivatives

4b（白色固體）：熔點157.8～161.5 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.31（s, 2H）、7.96（s, 1H）、6.77（s, 2H）、6.01（s, 2H）、5.33～5.27（m, 1H）、5.14～5.02（m, 3H）、4.66（dd,J＝8.4, 4.5 Hz, 2H）、4.56（t,J＝5.6 Hz, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.68（ddd,J＝12.8, 7.9, 5.6 Hz, 4H）、3.55～3.48（m, 1H）、3.45（dt,J＝6.3, 2.9 Hz, 2H）、3.30（d,J＝3.5 Hz, 1H）、3.27～3.23（m, 1H）、3.23～3.12（m, 2H）、2.72（dd,J＝8.7, 6.8 Hz, 2H）、2.12（s, 6H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.61、164.22、163.34、151.66、132.16、128.49、124.48、105.74、101.09、97.57、95.25、77.62、77.29、77.08、72.31、70.97、70.86、69.91、68.80、60.75、46.32、29.88、18.59、17.10。

4c（黃色固體）：熔點145.9～151.5 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.34（s, 2H）、7.16～7.05（m, 4H）、6.01（s, 2H）、5.32（d,J＝4.4 Hz, 1H）、5.19～5.02（m, 3H）、4.66（d,J＝4.3 Hz, 1H）、4.53（d,J＝35.3 Hz, 2H）、3.68（ddd,J＝11.9, 7.4, 2.7 Hz, 3H）、3.53～3.47（m, 2H）、3.46～3.43（m, 1H）、3.27（s, 4H）、3.21（q,J＝9.3, 8.0 Hz, 2H）、2.85（t,J＝7.6 Hz, 2H）、2.26（s, 3H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.33、164.22、138.85、135.18、129.36、129.32、128.67、105.76、101.08、97.58、95.25、77.63、77.30、77.06、72.32、70.98、70.86、69.92、68.80、60.75、45.83、30.11、21.09、18.60。

4d（黃色固體）：熔點141.3～146.3 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.30（s, 2H）、7.19～7.12（m, 2H）、6.88～6.80（m, 2H）、6.01（s, 2H）、5.33～5.27（m, 1H）、5.14～5.01（m, 3H）、4.66（dd,J＝9.1, 4.5 Hz, 2H）、4.62～4.52（m, 1H）、4.47（d,J＝5.9 Hz, 1H）、3.71（s, 3H）、3.70～3.63（m, 3H）、3.51（dd,J＝11.8, 6.3 Hz, 1H）、3.45（dt,J＝6.3, 2.9 Hz, 3H）、3.31～3.22（m, 2H）、3.21～3.13（m, 2H）、2.83（t,J＝7.6 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.42、164.20、163.36、157.93、133.79、129.73、114.22、105.76、101.09、97.58、95.26、77.61、77.28、77.08、72.31、70.97、70.86、69.91、68.80、60.76、55.44、46.04、29.64、18.58。

4e（棕黃色固體）：熔點207.4～211.7 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.32（s, 2H）、6.87～6.83（m, 2H）、6.74（dd,J＝8.2, 2.0 Hz, 1H）、6.01（s, 2H）、5.36～5.27（m, 1H）、5.17～5.01（m, 3H）、4.68（dd,J＝11.5, 4.5 Hz, 2H）、4.58（s, 1H）、4.48（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.72（d,J＝7.5 Hz, 6H）、3.70～3.64（m, 4H）、3.54（d,J＝7.6 Hz, 1H）、3.49～3.45（m, 3H）、3.34～3.26（m, 2H）、3.20（dp,J＝9.6, 4.9, 4.2 Hz, 2H）、2.83（dd,J＝8.3, 6.6 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.1 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.47、164.20、163.36、149.09、147.49、134.42、120.49、112.82、112.41、105.80、101.08、97.60、95.27、77.63、77.29、77.06、72.32、71.00、70.86、69.93、68.79、60.75、56.00、55.86、46.03、30.21、18.61。

4f（黃色固體）：熔點147.4～151.5 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.32（s, 2H）、6.56（s, 2H）、6.02（s, 2H）、5.34～5.28（m, 1H）、5.19～4.99（m, 3H）、4.68（dd,J＝11.3, 4.5 Hz, 2H）、4.57（s, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.75（s, 6H）、3.68（ddd,J＝12.2, 6.1, 2.7 Hz, 2H）、3.62（s, 3H）、3.45（dt,J＝6.7, 3.2 Hz, 2H）、3.33（d,J＝10.4 Hz, 6H）、3.21（tt,J＝10.1, 5.1 Hz, 2H）、2.84（dd,J＝8.6, 6.9 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.40、164.18、163.38、153.19、137.68、136.09、106.04、105.85、101.10、97.57、95.26、77.61、77.29、77.09、72.30、70.98、70.86、69.91、68.80、60.76、60.43、56.23、45.86、31.01、18.60。

4g（白色固體）：熔點146.7～150.8 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.31（s, 2H）、8.68（s, 1H）、6.80（d,J＝1.9 Hz, 1H）、6.70～6.58（m, 2H）、6.01（s, 2H）、5.32～5.28（m, 1H）、5.14～5.01（m, 3H）、4.67（dd,J＝9.5, 4.5 Hz, 2H）、4.56（d,J＝5.6 Hz, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.73（s, 3H）、3.68（ddd,J＝12.8, 7.9, 5.2 Hz, 3H）、3.56～3.47（m, 1H）、3.45（dt,J＝6.2, 2.9 Hz, 2H）、3.28（dd,J＝8.8, 7.1 Hz, 2H）、3.19（td,J＝9.5, 4.8 Hz, 2H）、2.79（dd,J＝8.5, 6.7 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.58、163.35、147.86、145.03、132.71、120.80、115.78、113.05、105.81、101.09、97.57、95.25、77.62、77.29、77.08、72.31、70.98、70.86、69.91、68.80、55.99、46.19、30.26、18.60。

4h（白色固體）：熔點151.3～155.6 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.32（s, 2H）、9.27（s, 1H）、7.06（t,J＝7.8 Hz, 1H）、6.69～6.51（m, 4H）、6.02（s, 2H）、5.36～5.26（m, 1H）、5.15～5.01（m, 3H）、4.67（dd,J＝10.1, 4.5 Hz, 2H）、4.61～4.54（m, 1H）、4.48（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.74～3.63（m, 3H）、3.54～3.41（m, 3H）、3.30（td,J＝7.9, 6.9, 2.7 Hz, 2H）、3.20（dp,J＝9.5, 5.2 Hz, 2H）、2.81（t,J＝7.7 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ201.33、159.63、157.76、149.56、144.15、129.71、119.42、115.65、113.28、106.25、101.09、98.20、94.90、78.07、76.68、76.59、73.20、72.09、71.28、70.00、68.80、61.68、45.09、29.94、18.60。

4i（橙黃色固體）：熔點150.6～156.7 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.38（s, 2H）、9.42（s, 1H）、7.17～7.02（m, 2H）、6.86～6.72（m, 2H）、6.05（s, 2H）、5.37（d,J＝4.3 Hz, 1H）、5.16（td,J＝17.0, 15.3, 9.6 Hz, 3H）、4.84～4.50（m, 4H）、4.09（q,J＝7.2 Hz, 1H）、3.73（d,J＝15.2 Hz, 3H）、3.59～3.47（m, 5H）、3.30～3.24（m, 2H）、2.88（t,J＝7.6 Hz, 2H）、1.24（s, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ210.42、165.63、164.19、155.66、130.26、128.06、127.38、119.34、115.38、98.00、95.37、80.62、78.41、77.42、73.10、71.60、70.12、68.78、60.12、46.46、35.93、32.60、28.85、25.12、18.58。

4j（灰白色固體）：熔點144.8～149.2 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.30（s, 2H）、7.31～7.22（m, 3H）、7.20～7.15（m, 1H）、6.02（s, 2H）、5.33～5.27（m, 1H）、5.14～5.03（m, 3H）、4.67（dd,J＝9.4, 4.6 Hz, 2H）、4.56（t,J＝5.7 Hz, 1H）、4.47（d,J＝5.9 Hz, 1H）、3.68（td,J＝6.3, 3.5 Hz, 2H）、3.51～3.42（m, 2H）、3.32（d,J＝6.3 Hz, 6H）、3.20（tt,J＝9.4, 5.4 Hz, 2H）、2.90（dd,J＝8.4, 6.9 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.26、164.20、163.39、141.98、128.80、126.31、105.74、101.09、97.57、95.28、77.61、77.29、77.08、72.31、70.97、70.86、69.91、68.80、60.75、45.70、30.48、18.60。

4k（灰白色固體）：熔點144.1～149.7 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.33（s, 2H）、7.31～7.23（m, 3H）、7.21～7.00（m, 1H）、6.01（d,J＝1.7 Hz, 2H）、5.31（d,J＝5.1 Hz, 1H）、5.19～5.00（m, 3H）、4.67（dd,J＝8.9, 4.3 Hz, 2H）、4.57（s, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.77～3.61（m, 4H）、3.50～3.42（m, 6H）、3.21（dd,J＝9.8, 4.0 Hz, 2H）、2.89（td,J＝7.7, 3.7 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.23、164.27、163.41、142.00、130.60、130.52、128.80、126.31、115.53、115.32、105.77、101.09、97.58、95.24、77.62、77.30、77.07、72.31、70.98、70.86、69.91、68.80、60.75、45.70、30.50、29.59、18.60。

4l（灰白色固體）：熔點145.8～148.9 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.31（s, 2H）、7.30～7.23（m, 3H）、7.21～7.16（m, 1H）、6.02（s, 2H）、5.35～5.29（m, 1H）、5.13（d,J＝5.5 Hz, 1H）、5.10～5.02（m, 2H）、4.68（dd,J＝9.2, 4.5 Hz, 2H）、4.58（t,J＝5.7 Hz, 1H）、4.49（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.74～3.62（m, 3H）、3.53～3.41（m, 3H）、3.35～3.29（m, 4H）、3.20（tt,J＝9.5, 5.2 Hz, 2H）、2.90（t,J＝7.7 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.27、164.20、163.40、141.98、128.80、126.31、105.75、101.09、97.57、95.28、77.62、77.31、77.07、72.31、70.98、70.87、69.91、68.80、60.75、45.69、30.49、18.61。

4m（灰白色固體）：熔點145.7～150.1 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.31（s, 2H）、7.36～7.22（m, 2H）、7.13～7.06（m, 1H）、7.05～6.97（m, 1H）、6.01（s, 2H）、5.37～5.27（m, 1H）、5.16～5.02（m, 3H）、4.68（dd,J＝9.4, 4.5 Hz, 2H）、4.57（d,J＝5.6 Hz, 1H）、4.49（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.68（dp,J＝12.0, 5.7 Hz, 3H）、3.53～3.41（m, 3H）、3.31（d,J＝9.1 Hz, 2H）、3.20（tt,J＝9.5, 5.1 Hz, 2H）、2.91（q,J＝7.7 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.12、164.23、163.89、163.43、160.98、150.42、142.74、129.20、116.01、115.06、113.19、112.38、105.75、102.06、97.94、95.27、77.62、77.30、77.07、72.31、70.98、70.87、69.91、67.75、60.75、46.47、45.31、30.49、30.12、18.61。

1.3.2 細(xì)胞毒性測試

采用MTT法測定4a～4m對人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK2細(xì)胞的毒性。選用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長程度，收集對數(shù)期細(xì)胞，配制細(xì)胞懸液，濃度為5×104個細(xì)胞/mL，每孔100 μL加于96 孔板中。4a～4m的溶液濃度梯度設(shè)置為100、200、300、400 μmol/L。按MTT法使用酶標(biāo)儀在570 nm處測量藥物組和對照組（不加藥）的吸光度，計算細(xì)胞存活率[24]。

1.3.3 甜味評價

1.3.3.1 對照品溶液配制

參照GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[25]，通過感官法初步確定對照品NarDC、NHDC、HDC-7-G、三葉苷、根皮苷對應(yīng)“無味”、“弱甜味”和“較強(qiáng)甜味”3 個描述詞的濃度值，并根據(jù)此范圍設(shè)置5 個二氫查耳酮對照品的待測濃度系列，如表1所示。

蔗糖對照品配制14.7、29.5、74.5、153.4、236.9、324.6 mmol/L的系列溶液。

表1 5種二氫查耳酮對照品溶液的配制Table 1 Preparation of five dihydrochalcone standard solutions

1.3.3.2 感官評價

參照FP法[26]，評價員對6種對照品和4a～4m的系列溶液進(jìn)行味道評價。4a～4m濃度取值依據(jù)1.3.2節(jié)MTT法實驗，取0.10、0.20、0.40 mmol/L。感官描述分成3 級：“無味”、“弱甜味”和“較強(qiáng)甜味”，在對照品的參照下確定4a～4m在3 個濃度下感官法評價是否有甜味。

1.3.3.3 電子舌評價

基于1.3.3.2節(jié)的感官實驗評價結(jié)果，采用配有甜味脂質(zhì)膜傳感器（GL1）和Ag/AgCl參比電極的電子舌測定待測溶液的甜味信號值[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1H NMR和13C NMR譜圖采用MestReNova 14.0軟件解析。電子舌電勢值測定數(shù)據(jù)用Insent自帶軟件轉(zhuǎn)換為甜味值，Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析，Origin軟件繪圖。GraphPad Prism 5軟件用于繪制細(xì)胞毒性評價的相關(guān)柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫查耳酮衍生物的合成

為探討二氫查耳酮A環(huán)和B環(huán)上的取代基對該類化合物甜味的影響，以天然柚皮苷為起始原料，制備了B環(huán)引入甲基、甲氧基、羥基、鹵原子的13種衍生物（4a～4m）。在Claisen-Schmidt縮合和O-Michael加成步驟中，由于根皮乙酰苯-4’-β-新橙皮苷在A環(huán)上原有的糖基即可作為保護(hù)基團(tuán)，避免A環(huán)受到羰基的電子效應(yīng)影響轉(zhuǎn)化成醌式結(jié)構(gòu)、羰基轉(zhuǎn)化成烯醇式結(jié)構(gòu)而不能發(fā)生縮合反應(yīng)[27]，從而順利發(fā)生縮合和加成獲得3a～3m。然后，在弱堿條件下3a～3m經(jīng)Pd/C催化加氫還原得到4a～4m，此時堿用量以5% NaOH為適宜，過高則生成極性較大的物質(zhì)，未能檢測出目標(biāo)產(chǎn)物。

2.2 細(xì)胞毒性評價

為研究目標(biāo)化合物的毒性，采用MTT法考察不同濃度的目標(biāo)化合物（4a～4m）對HK2細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)化合物4a～4m濃度不高于400 μmol/L時，細(xì)胞存活率均大于80%。結(jié)果表明，4a～4m對HK2細(xì)胞均不具有明顯的毒性。

圖3 4a～4m對HK2細(xì)胞存活率的影響Fig. 3 Effect of dihydrochalone glycosides on viability of HK2 cells

2.3 感官評價和電子舌評價

以感官評價法預(yù)確定了對照品和4a～4m相應(yīng)于“無甜味”、“弱甜味”、“較強(qiáng)甜味”3 個甜味描述詞的濃度值，結(jié)果如表2所示。選取所得到的濃度值，以電子舌測定6種對照品和4a～4m的甜味值，結(jié)果如圖4、5所示。

表2 感官評價法預(yù)確定對照品和化合物（4a～4m）對應(yīng)不同甜味描述詞的濃度Table 2 Concentrations of dihydrochalone standards and dihydrochalone glycosides corresponding to different sweetness descriptors predetermined by sensory evaluation

由圖4可知，在表2中“弱甜味”的濃度下，HDC-7-G在0.04 mmol/L時電子舌甜味值為2.96，三葉苷0.60 mmol/L時甜味值為4.00，蔗糖29.50 mmol/L時甜味值為3.02，均高于呈苦味的根皮苷甜味值（0.2～1.0 mmol/L為1.13～2.15）。以上3種甜味對照品在電子舌甜味值小于3時人不能口嘗出相應(yīng)溶液的甜味，說明電子舌GL1的響應(yīng)合理，與感官評價結(jié)果一致。單糖苷的三葉苷和HDC-7-G（均帶有4-葡萄糖基）的甜味值低于其相應(yīng)甜味更強(qiáng)的雙糖苷NarDC和NHDC（均帶有4-新橙皮糖基）（圖4a、c）；根皮苷是帶有6-葡萄糖基的單糖苷，其B環(huán)與三葉苷、NarDC相同，但甜味值更低?？梢?，B環(huán)相同時，GL1可區(qū)分二氫查耳酮糖苷A環(huán)上的糖基是在4位還是6位，連接的是葡萄糖基還是新橙皮糖基。

圖4 對照品的電子舌甜味值測定Fig. 4 Sweetness values of reference substances determined by electronic tongue

GL1對不同化合物的響應(yīng)靈敏度不同。從圖5可知，在相應(yīng)表2“弱甜味”的濃度時，呈甜味的4a、4b、4h、4j～4m電子舌甜味值為5.92～15.01；“無甜味”的4d～4g、4i和呈苦味的4c甜味值為1.57～5.56；5種甜味對照品甜味值為2.92～8.16（圖4a～c）?？梢?，GL1對此類呈甜味衍生物的響應(yīng)值基本在合理范圍內(nèi)。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，使用同一根GL1測不同化合物的溶液會造成響應(yīng)值重復(fù)性欠佳。

圖5 4a～4m的電子舌甜味值測定Fig. 5 Sweetness values of dihydrochalone glycosides determined by electronic tongue

2.4 甜味構(gòu)效關(guān)系

2.4.1 A環(huán)糖基的影響

由表2可知，A環(huán)上帶4-新橙皮糖基或4-葡萄糖基的二氫查耳酮糖苷，有呈甜味的NarDC、NHDC、三葉苷、HDC-7-G、4h、4j、4k，亦有呈苦味的4c和無味的4i、4d、4e。可見二氫查耳酮糖苷呈味與A環(huán)的4-糖基并沒有明確關(guān)系，尚取決于B環(huán)的取代情況。NarDC、三葉苷和NHDC、HDC-7-G的B環(huán)結(jié)構(gòu)兩兩相同，NarDC、三葉苷的B環(huán)有4’-OH取代，NHDC、HDC-7-G同時有3’-OH和4’-OCH3取代。由表2可以看出，A環(huán)有4-新橙皮糖基的NarDC和NHDC的甜味皆比相應(yīng)B環(huán)相同、A環(huán)帶有4-葡萄糖基的三葉苷和HDC-7-G強(qiáng)得多。換言之，對于B環(huán)相同、A環(huán)4位有糖基取代的二氫查耳酮糖苷，新橙皮糖苷比單葡萄糖苷甜得多。三葉苷和根皮苷的B環(huán)相同，均為4’-OH取代，但是A環(huán)上葡萄糖基的取代位置不同。由表2可知，有4-葡萄糖基的三葉苷呈甜味，而連有6-葡萄糖基的根皮苷卻呈苦味，表明二氫查耳酮糖苷的呈味與A環(huán)糖基取代的位置有關(guān)。

2.4.2 B環(huán)的影響

合成的4a～4m均為新橙皮糖苷。由表2可知，4a、4b、4h、4j～4m呈不同程度的甜味，4d～4g、4i沒有甜味，4c呈苦味，可見B環(huán)上基團(tuán)的差異會影響二氫查耳酮糖苷的呈味。其中，4g（3’-OCH3，4’-OH）與NHDC（3’-OH，4’-OCH3）的分子結(jié)構(gòu)區(qū)別僅在于B環(huán)上3’位和4’位基團(tuán)的互換，前者沒有甜味，而后者具有強(qiáng)烈的甜味。呈甜味的4h（3’-OH）與NHDC結(jié)構(gòu)差異在于后者多了4’-OCH3，表明4’-OCH3具有強(qiáng)烈增甜作用。4h和NarDC（4’-OH）均有“較強(qiáng)甜味”，兩者差異在于B環(huán)—OH的位點不同。無甜味的4g（3’-OCH3、4’-OH）與NarDC（4’-OH）差異在于前者多了3’-OCH3，表明是4’-OH相鄰的3’-OCH3有去甜作用。而4b（3’,5’-CH3、4’-OH）甜味明顯低于NarDC（4’-OH），顯然是前者在4’-OH旁邊的兩個—CH3使甜味大大減弱?？梢?’-OH相鄰的—CH3有降甜作用（4b）。4c（4’-CH3）呈苦味，與有甜味的4a（2’～6’位均無取代）比較，可說明4’-CH3具致苦作用；僅有—OCH3一種取代基但個數(shù)不同的4d（4’-OCH3）、4e（3’,4’-OCH3）、4f（3’,4’,5’-OCH3）均不呈甜味，與4a比較可說明B環(huán)3’,4’,5’位上僅有同一種取代基時—OCH3有去甜作用。4i（2’-OH）無甜味，鹵原子取代的4j（4’-Cl）、4l（3’-Cl）、4k（4’-F）、4m（3’-F）呈“較強(qiáng)甜味”。與4a相比可知，B環(huán)2’位的OH對甜味沒貢獻(xiàn)。以上均說明B環(huán)3’位和4’位的取代基對二氫查耳酮的呈味至關(guān)重要。當(dāng)B環(huán)2’～6’位無取代，或3’位、4’位僅連有OH、F、Cl之一，此7種化合物均可呈甜味。

2.4.3 結(jié)構(gòu)-甜味效應(yīng)機(jī)理探討

Tinti等[28]的多點結(jié)合甜味理論認(rèn)為，人體甜味蛋白受體至少包含8 個基本識別部位，與甜味分子的結(jié)合部位相互作用產(chǎn)生甜味刺激。甜味分子與受體蛋白相互作用結(jié)合部位的數(shù)量和結(jié)合的有效程度決定了該甜味分子的甜度強(qiáng)弱，而結(jié)合的有效程度與甜味分子大小、立體空間構(gòu)型、活性基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)有很大關(guān)系。對物質(zhì)甜味感知的差異取決于甜味受體的結(jié)構(gòu)變化，Winnig等[12,29]通過對大鼠和人的兩個與甜味有關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體Tas1R2（taste receptor type 1 member 2）和Tas1R3（taste receptor type 1 member 3）的種間組合和嵌合體的分析，認(rèn)為人Tas1R3的七肽結(jié)構(gòu)域似乎與NHDC甜味受體的激活密切相關(guān)，并鑒定了一組不同的氨基酸殘基，從而形成NHDC結(jié)合口袋。AH-B受體結(jié)合理論認(rèn)為，所有甜味化合物都含有一個氫鍵供體（AH）和一個氫鍵受體（B），分別與受體上互補(bǔ)的受體（B）、供體（AH）相互作用，形成兩個氫鍵和/或阻斷受體蛋白上的分子內(nèi)氫鍵而引發(fā)了甜味的感知[30]。

綜上可知，甜味分子與受體蛋白的氫鍵作用對甜味感知有重要影響。呈甜味的NHDC、NarDC、4h的B環(huán)上3’位或4’位取代基—OH既可作為氫鍵受體也可作為氫鍵供體，易于與受體蛋白上的氨基酸殘基作用形成氫鍵；呈甜味的4j～4m，B環(huán)上3’位或4’位帶有的F或Cl可作為氫鍵受體形成氫鍵。4i不呈甜味，原因是B環(huán)上的2’-OH形成氫鍵有較大的空間位阻；4c的4’-CH3不能參與氫鍵形成，事實上4c呈苦味。4d（4’-OCH3）、4e（3’,4’-OCH3）、4f（3’,4’,5’-OCH3）均不呈甜味，它們的B環(huán)上僅有一種甲氧基，沒有任何羥基。甲氧基雖然可以作為氫鍵受體，但由于甲基的位阻導(dǎo)致形成的氫鍵較弱。4b甜味明顯低于NarDC，顯然是前者在4’-OH旁邊的兩個—CH3產(chǎn)生的位阻使4’-OH形成氫鍵的能力下降，導(dǎo)致甜味減弱。可見，當(dāng)B環(huán)上取代基為較強(qiáng)的氫鍵供體或受體，可與甜味受體蛋白形成較強(qiáng)的氫鍵，二氫查耳酮糖苷的甜味較強(qiáng)，3’位、4’位的取代基對二氫查耳酮呈味有較大影響。

3 結(jié) 論

合成了4a～4m共13 個二氫查耳酮衍生物，其中4a～4c、4j、4k、4e、4f、4l、4m為新化合物，目前鮮見文獻(xiàn)報道。MTT法測定結(jié)果表明，4a～4m對HK2細(xì)胞沒有明顯毒性作用。以甜味的NHDC、NarDC、HDC-7-G、三葉苷、蔗糖和苦味的根皮苷作為對照品，用感官法和電子舌分別對4a～4m進(jìn)行甜味評價。確認(rèn)4a、4b、4h、4j～4m呈甜味，4d～4g和4i沒有甜味，4c呈苦味。對于人感官口嘗有甜味的衍生物，電子舌的測定結(jié)果與感官評價法基本吻合?；谔鹞对u價結(jié)果，分析了包括5 個二氫查耳酮對照品和13 個衍生物的結(jié)構(gòu)與甜味的相關(guān)性。在前人的甜味構(gòu)效研究基礎(chǔ)上探討甜味分子與受體蛋白的氫鍵作用對甜味感知的影響。結(jié)果表明，二氫查耳酮糖苷的呈味與A環(huán)糖基的取代位點有關(guān)；與A環(huán)的4-糖基（新橙皮糖基/葡萄糖基）沒有明確關(guān)聯(lián)，尚取決于B環(huán)的取代情況。新橙皮糖苷呈味與B環(huán)3’、4’位的取代基有明確關(guān)聯(lián)，B環(huán)上2’～6’位無取代，或3’位、4’位僅連有OH、F、Cl之一，可呈甜味。—CH3、—OCH3不是產(chǎn)生甜味的關(guān)鍵基團(tuán)。下一步將設(shè)計合成更多的二氫查耳酮衍生物，以深入研究其甜味構(gòu)效關(guān)系。