外周血胞裂蛋白9甲基化狀態(tài)及其與結直腸癌的關系

李拓鍵, 張 超, 陳宗濤, 李新亮

(1. 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院 健康管理中心, 重慶, 400038;2. 北京大學深圳醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科, 廣東 深圳, 518036)

結直腸癌(CRC)是較為常見的惡性腫瘤之一，患者5年生存率僅為47.2%[1]。CRC的預后與早期診治密切相關，早期診治的CRC患者的5年生存率可高達90%, 而晚期診治的CRC患者的5年生存率不足10%[2]。研究[3-4]顯示外周血Septin 9甲基化狀態(tài)在CRC發(fā)生的極早期就會發(fā)生變化，或可作為CRC早期篩查的分子標志物。本研究檢測了120例CRC患者外周血中Septin 9甲基化狀態(tài)，分析外周血中Septin 9甲基化與CRC的關系，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

分析2017年1月—2019年12月在西南醫(yī)院體檢中心體檢并接受Septin 9篩查的人群1 586例。另選取2017年1月—2018年12月120例CRC者，其中男84例，女36例，平均年齡(57.1±12.2)歲，均采集樣本并進行Septin 9甲基化、癌胚抗原(CEA)和糖鏈抗原199(CA199)檢測。納入標準: ① 接受結腸鏡檢查的患者; ② 年齡>18歲者。排除標準: ① 既往有惡性腫瘤病史的患者; ② 曾接受放化療的患者; ③ 既往有腹部手術史的患者; ④ 妊娠期女性。

1.2 Septin 9甲基化狀態(tài)、CEA及CA199檢測

采集受試者外周靜脈血10 mL置于EDTA抗凝真空采血管中, 1 500轉/min離心15 min, 分離血清和血漿，保存于-80 ℃環(huán)境中并在4周內(nèi)完成檢測。Septin 9甲基化檢查過程參照大腸癌甲基化基因檢測試劑盒(PCR熒光探針法)說明書，采用伯樂實時熒光定量PCR儀完成檢測，血清CEA、CA199采用電化學發(fā)光法檢測，均由本院檢驗科完成。

1.3 外泌體分離

將血清置于無菌操作臺中融化，按1∶1體積加入外泌體沉淀試劑盒(賽默飛)，置于翻轉搖床上4 ℃孵育過夜，次日以12 000 g 離心60 min, 收集白色沉淀，采用100 μL無菌PBS溶解，測定蛋白濃度并將外泌體稀釋到1 mg/mL待用。

1.4 體外實驗

1.4.1 細胞培養(yǎng): Saos2細胞培養(yǎng)于由90%的DMEM培養(yǎng)基、10%FBS及1%雙抗組成的培養(yǎng)基中。待細胞融合度達到約90%時，采用胰酶消化細胞，并進行傳代。

1.4.2 免疫蛋白印跡(Western blot): 外泌體采用RIPA裂解液于冰上進行提取，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，按照50 μg的劑量將蛋白樣品加到10%的SDS-page中進行電泳; 電泳后進行轉膜，而后將膜用5%的脫脂牛奶進行封閉室溫孵育1 h, 一抗工作液4 ℃孵育過夜，洗膜后孵育相應的二抗工作，然后采用化學發(fā)光試劑盒檢測雜交信號。

1.4.3 CCK-8法檢測細胞增殖: 消化細胞并進行細胞計數(shù)，而后按照5 000個/孔的密度將細胞種植于96孔板中，待細胞貼牢后(6 h), 換為含有20 μg/mL外泌體的培養(yǎng)基(對照組為含有相應體積 PBS的培養(yǎng)基)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在處理后24、48、72 h向培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8溶液，將其置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)90 min, 而后采用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

1.4.4 流式細胞術檢測細胞凋亡: 外泌體處理細胞48 h后，采用0.25%胰酶消化細胞，血清中止，收集細胞, PBS重懸后按照Annexin V-FITC/PI試劑盒相關說明進行Annein V和PI染色，然后上機檢測，隨后應用FlowJo7.6進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，組間率的比較采用χ2檢驗，總樣本不同診斷方式采用受試者工作特征(ROC)曲線分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 1 586例體檢者的Septin 9陽性率

共計1 586例體檢者接受了Septin 9篩查，其中男1 023例，女563例; Seprtin 9甲基化陽性56例，陽性率為3.5%; 56例Septin 9陽性者中癌前病變1例，而Septin 9陰性者中未見癌變或癌前病變。Sepetin 9陽性者中，胃腸狀態(tài)異常者(腸胃炎癥或者息肉等)20例(35.7%), 而Septin 9陰性者胃腸狀態(tài)異常率僅為5.4%(83/1 530), 提示Septin 9在外周血中的甲基化狀態(tài)與受試者胃腸狀態(tài)密切相關，可能與癌前病變相關。見表1。

表1 1 586例正常人群Septin 9甲基化與胃腸狀態(tài)的相關性

2.2 120例CRC患者外周血Septin 9甲基化狀態(tài)監(jiān)測結果

120例CRC患者中, Septin 9甲基化陽性者93例，平均年齡(59.1±12.8)歲; Septin 9甲基化陰性者27例，平均年齡(53.1±10.2)歲; CRC在年齡較高人群中更易感，但與性別無關。120例CRC患者中, Septin 9甲基化陽性率為78.4%(73/93); 在不同性別、不同年齡的比較中, CRC患者外周血Septin 9甲基化陽性率的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.635、0.149); 在不同分化程度的比較中，高分化、中分化、低分化CRC患者的Septin 9甲基化陽性率依次為52.6%(10/19)、79.7%(59/74)、88.9%(24/27), 低分化CRC患者外周血Septin 9甲基化陽性率高于高分化組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006)。見表2。

表2 CRC患者Septin 9檢測情況[n(%)]

2.3 CRC患者外周血Septin 9甲基化以及CEA、

CA199蛋白檢測結果

本研究結果顯示，與CA199、CEA相比，外周血Septin 9甲基化的靈敏度為72.3%, 特異度為92.5%, 均優(yōu)于CEA和CA199的靈敏度和特異度，見表3、圖1。

表3 CRC患者Septin 9、CEA、CA199的靈敏度和特異度比較

圖1 Septin 9、CEA和CA199 的靈敏度及特異度的ROC曲線

2.4 血清外泌體中Septin 9的表達及甲基化狀態(tài)

本研究分別提取了正常健康人群和CRC患者外周血的血清外泌體，并以外泌體標志物CD63進行鑒定。結果顯示，提取的樣本中存在大量外泌體, Western blot結果顯示CRC患者外泌體中Septin 9表達較正常人群降低，外泌體中Septin 9甲基化水平也較正常人群上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.009、0.003)。見圖2。

A: Western Blot檢測外泌體標志物CD63; B: Western Blot檢測外泌體中Septin 9表達; C: 特異性甲基化PCR檢測外泌體中Septin 9甲基化狀態(tài)。與正常人群相比, **P<0.01; 與CRC相比, ##P<0.01。圖2 CRC患者血清外泌體中Septin 9表達及甲基化狀態(tài)

2.5 CRC患者血清外泌體對CRC細胞Saos2增殖、凋亡的影響

本研究將提取的外泌體以20 μg/mL的水平來處理CRC細胞系Saos2, 測定細胞增殖和凋亡情況。結果顯示, CRC患者血清外泌體可促進細胞增殖，對細胞凋亡有抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，表明CRC患者血清外泌體與CRC細胞增殖和凋亡密切相關。見圖3。

A: CCK-8檢測CRC血清外泌體對細胞增殖的影響; B: 流式法檢測CRC患者血清外泌體對細胞凋亡的影響。兩者比較, **P<0.01。圖3 CRC患者血清外泌體對CRC細胞系Saos2增殖和凋亡的影響

3 討 論

目前, CRC的早期診斷主要借助侵入式的結腸鏡，但患者的依從性較低[5]; 糞便潛血檢測有助于篩選高危人群，但易出現(xiàn)假陽性或假陰性，需要反復送檢，導致患者依從性也較低。Septin 9是一個高度保守的GTP結合蛋白，廣泛存在于人類細胞中，其基因位于長染色體17q25.3, 研究[6]顯示Septin 9甲基化在CRC及部分癌前病變患者外周血中有較高的檢出率。

Septin 9甲基化可出現(xiàn)在各期CRC中，陽性率不受患者性別、年齡、病變部位的影響; CRC患者的外周血 Septin 9甲基化水平與癌癥分期呈正相關，即Ⅳ期患者外周血Septin 9甲基化水平顯著高于Ⅰ～Ⅲ期，但Septin 9甲基化陽性率與腫瘤分化程度無關[7]。YANG J K等[8]及陳培等[9]認為，不同病理分期CRC患者的Septin 9甲基化陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 而本研究發(fā)現(xiàn)CRC患者外周血Septin 9甲基化與疾病分化程度相關，外周血Septin 9甲基化檢測的靈敏度及特異度均優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標志物CEA及CA199。本研究認為對外周血中Septin 9甲基化的檢測要考慮受試人群存在人種差異，亞洲人群外周血Septin 9甲基化或可是更好的CRC早期篩查標志物。

外泌體是細胞分泌的一種具有磷脂雙分子層的微小囊泡，其直徑多在30～200 nm[10], 并廣泛分布于人體內(nèi)，可以傳遞包括蛋白、RNA和DNA等多種物質(zhì)。外泌體被用于多種疾病的診斷[11], 在CRC中也有作為分子標志物的報道[12]。本研究證實外周血中Septin 9甲基化狀態(tài)可作為CRC的分子標志。外泌體的內(nèi)容物是經(jīng)過母體細胞精密調(diào)節(jié)、高度選擇的結果，攜帶其來源母體細胞的特性[13]。外泌體能將各種細胞因子、轉錄因子、蛋白質(zhì)和染色質(zhì)傳遞給間質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、炎癥細胞和免疫細胞等受體細胞，在腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)、腫瘤細胞與正常細胞及腫瘤細胞間信息傳遞中發(fā)揮重要作用[14-16]。本研究結果表明, CRC患者血清外泌體中Septin 9表達降低，甲基化水平升高, CRC患者血清外泌體能顯著促進Saos2細胞增殖。

綜上所述, Septin 9可作為CRC早期篩查的標志物, CRC患者血清外泌體誘導的CRC增殖、凋亡抵抗可能是Septin 9的作用機制。