大鼠脂肪組織石蠟切片制作及免疫組織化學(xué)顯色方法*

于 暢 李 梁 張立佳 郝文靜 張起帆 于 源 董自豪

（包頭醫(yī)學(xué)院，1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，2 醫(yī)學(xué)技術(shù)與麻醉學(xué)院18級(jí)放射學(xué)專(zhuān)業(yè)，3 第三臨床醫(yī)學(xué)院19級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，包頭 014040）

哺乳動(dòng)物體內(nèi)的脂肪組織可分為白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）和棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）。白色脂肪組織與棕色脂肪組織擁有不同的代謝特征。白色脂肪組織主要分布于皮下、腎周、腸系膜等部位，其功能是儲(chǔ)存甘油三酯。棕色脂肪組織則能通過(guò)非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱消耗甘油三酯。近年來(lái)，白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉(zhuǎn)變的研究成為熱點(diǎn)。2種脂肪組織均由大量脂肪細(xì)胞簇?fù)矶?，?xì)胞內(nèi)富含大量脂質(zhì)成分的脂滴。這種特殊的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟程序處理的脂肪組織難以與石蠟融合，質(zhì)地松軟，導(dǎo)致切片不完整，存在大量的空洞、破碎，難以切出合格的切片。解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）作為棕色脂肪組織的特征性蛋白[1]。本研究選取UCP1在大鼠脂肪組織中的表達(dá)來(lái)檢測(cè)制片程序?qū)γ庖呓M織化學(xué)顯色是否有影響。筆者摸索出一套大鼠脂肪組織石蠟切片制作及免疫組織化學(xué)顯色的具體方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

8周齡雄性SD大鼠共10只，平均體質(zhì)量321～400 g，由斯貝福（北京市）生物科技公司供應(yīng)，檢驗(yàn)合格證號(hào)為SCXK（京）2019-0010。

抗-UCP1抗體購(gòu)自Abcam，貨號(hào)ab209483；通用二步法免疫組織化學(xué)試劑盒（小鼠/兔增強(qiáng)聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)）購(gòu)自中杉金橋，貨號(hào)PV-9000。

1.2 取材

取材前禁食不禁水12 h，水合氯醛麻醉，解剖大鼠，分離腹股溝區(qū)白色脂肪組織及肩胛區(qū)棕色脂肪組織。生理鹽水清洗脂肪組織，濾紙吸干表面水分。

1.3 脂肪組織的固定、脫水、透明、浸蠟

將較大塊脂肪組織用取材刀分割成小塊，放置于中性福爾馬林溶液中，固定12 h。用取材刀，將脂肪組織分割成3 mm×3 mm×2 mm小塊，每4～5小塊放置于一個(gè)微孔塑料包埋框中。依次用梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，石蠟浸蠟。筆者改良前后各步驟時(shí)間如表1。

表1 改良前后脫水、透明及浸蠟程序設(shè)定的比較

1.4 脂肪組織的包埋

用酒精燈將眼科彎鑷預(yù)熱數(shù)秒，將脂肪小塊從包埋框中夾出，把脂肪小塊放在石蠟包埋機(jī)工作臺(tái)的加熱板上，利用加熱板的溫度使石蠟和脂肪組織中的脂滴仍呈液態(tài)，接著用彎鑷在脂肪小塊上從上到下、從左到右來(lái)回輕柔地均勻擠壓，盡可能將脂肪小塊中的脂滴擠出。包埋模具提前在加熱板上預(yù)熱，迅速將處理好的脂肪制作成蠟塊。

1.5 脂肪組織石蠟切片、H-E染色

將包埋好的蠟塊修切好后用切片機(jī)切片，切片厚度 5 μm，攤片機(jī)水槽內(nèi)溫度控制在40℃左右，烤片機(jī)溫度為60℃，烤片時(shí)間不少于1 h。H-E染色，環(huán)保中性樹(shù)膠封片。

1.6 免疫組織化學(xué)顯色

將切片常規(guī)脫蠟、脫水；TRIS-EDTA緩沖液抗原修復(fù)；抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加抗-UCP1抗體（1∶5 000），4℃孵育至次日；PBS沖洗，滴加二抗試劑，室溫孵育10 min；DAB顯色，鏡下觀察顯色程度；蘇木精復(fù)染，鏡下觀察細(xì)胞核著色；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

2 結(jié)果

2.1 2種程序處理的脂肪組織切片及H-E染色比較

改良程序組蠟塊質(zhì)地均勻，組織完整，呈白色及棕色半透明狀，切片時(shí)能連成完整蠟帶，切片無(wú)空洞、破碎，組織無(wú)褶皺、無(wú)裂縫。H-E染色后鏡下可見(jiàn)：白色脂肪組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，染色清晰，核質(zhì)分明，透明度好，無(wú)擠壓褶皺現(xiàn)象；細(xì)胞內(nèi)呈大空泡狀，細(xì)胞核呈橢圓形或類(lèi)圓形，偏離在邊緣一側(cè)，細(xì)胞團(tuán)聚集呈蜂窩狀；棕色脂肪組織形態(tài)完整，染色清晰，較白色脂肪組織的細(xì)胞排列更為緊密、細(xì)胞內(nèi)有較多小空泡，細(xì)胞基質(zhì)發(fā)達(dá)，細(xì)胞周?chē)休^多血管（圖1 A1、B1、C1、D1）。

傳統(tǒng)程序組肉眼可見(jiàn)蠟塊完整，與改良組無(wú)顯著區(qū)別，但切片時(shí)較為困難，不易連成蠟帶，切片不完整，存在大量的空洞、破碎，切片上組織存在褶皺、裂隙。有的切片看不到組織。H-E染色觀察到白色脂肪組織細(xì)胞團(tuán)整體結(jié)構(gòu)較為凌亂，存在較多裂隙，細(xì)胞核類(lèi)圓形，清晰可見(jiàn)，部分細(xì)胞膜不完整。棕色脂肪組織結(jié)構(gòu)不完整，中央有較多裂縫、空洞，完整部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚清晰（圖1 A2、B2、C2、D2）。

2.2 2種脂肪組織改良程序組石蠟切片免疫組織化學(xué)顯色

免疫組織化學(xué)顯色中，傳統(tǒng)程序組在清洗過(guò)程中偶有脫片，改良程序組2種脂肪組織未出現(xiàn)脫片。鏡下觀察可見(jiàn)，改良程序組背景清晰，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，白色脂肪組織可見(jiàn)個(gè)別棕色點(diǎn)狀顆粒，棕色脂肪組織于細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量棕色斑塊的陽(yáng)性表達(dá)，滿足科研需求（圖2 A1、B1）；而在傳統(tǒng)程序組，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，切片出現(xiàn)裂隙空洞，染色有非特異假陽(yáng)性斑塊（圖2 A2、B2）。

圖1 2種程序處理的脂肪組織切片及H-E染色。A1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2：H-E染色，×400，標(biāo)尺=100 μm；A1、B1：改良程序組白色脂肪組織H-E染色；C1、D1：改良程序組棕色脂肪組織H-E染色；A2、B2：傳統(tǒng)程序組白色脂肪組織H-E染色；C2、D2：傳統(tǒng)程序組棕色脂肪組織H-E染色.圖2 2種程序處理的脂肪組織UCP1免疫組織化學(xué)顯色，×400 ，標(biāo)尺=100 μm。A1：改良程序組UCP1在白色脂肪組織中的表達(dá)；A2：傳統(tǒng)程序組UCP1在白色脂肪組織中的表達(dá)；B1：改良程序組UCP1在棕色脂肪組織中的表達(dá)；B2：傳統(tǒng)程序組UCP1在棕色脂肪組織中的表達(dá).

3 討論

白色脂肪組織與棕色脂肪組織形態(tài)學(xué)及代謝特征均不同，其對(duì)健康的影響也截然不同。白色脂肪組織容易堆積，與肥胖癥、高脂血癥、糖尿病有著密切聯(lián)系；而棕色脂肪組織則能通過(guò)產(chǎn)熱消耗脂肪，對(duì)控制體脂、預(yù)防疾病有著積極的作用。近年來(lái)，白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉(zhuǎn)化的研究成為熱點(diǎn)。

對(duì)于脂肪組織的形態(tài)學(xué)研究，普遍采用石蠟包埋切片染色技術(shù)，石蠟切片制作過(guò)程中可脫去細(xì)胞中脂質(zhì)成分，能很好的觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)，準(zhǔn)確地定位抗原，并且石蠟切片能長(zhǎng)期保存。也有學(xué)者采用冰凍切片的方法處理脂肪組織，但脂肪組織幾乎不含水分，脂質(zhì)成分不易結(jié)冰，難以像其他組織被凍硬，快速冰凍產(chǎn)生的冰晶也會(huì)對(duì)組織結(jié)構(gòu)造成破壞，影響抗原定位，且冰凍切片不易長(zhǎng)期保存，故冰凍切片在臨床診斷上應(yīng)用較多，但在科研領(lǐng)域有較多局限性[2-3]。

棕色脂肪組織區(qū)別于白色脂肪組織就在于其非震顫自主產(chǎn)熱功能，從分子水平則表現(xiàn)為更高的UCP1表達(dá)量和耗氧量。換而言之，UCP1的表達(dá)量也決定著這種脂肪組織產(chǎn)熱功能的水平。UCP1通過(guò)引起線粒體氧化呼吸鏈的電子傳遞和ATP生成之間解偶聯(lián)，降低脂肪酸氧化代謝的產(chǎn)能效率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)棕色脂肪細(xì)胞釋放熱量的功能[4]。UCP1為經(jīng)典的棕色脂肪標(biāo)志蛋白，因此選取UCP1在大鼠脂肪組織中的表達(dá)來(lái)檢測(cè)制片程序?qū)γ庖呓M織化學(xué)顯色是否有影響。

全部10只大鼠脂肪組織石蠟包埋后切片H-E染色和免疫組織化學(xué)顯色，鏡下觀察并采集圖像。所有H-E染色圖像細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)著色良好，無(wú)擠壓和皺縮現(xiàn)象。2種脂肪組織特征明顯，易于分辨。免疫組織化學(xué)顯色中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，白色脂肪組織未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)，棕色脂肪組織呈陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果表明筆者所述的大鼠脂肪組織石蠟切片制作方法是成功的。

大鼠脂肪組織石蠟切片制作的成功與否關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)有3個(gè)方面。①取材：相對(duì)于大塊脂肪組織而言，較小的組織塊更易于乙醇、二甲苯、石蠟完全滲透進(jìn)入組織，在多次使用傳統(tǒng)大小組織塊（2.0 cm×1.0 cm×0.3 cm）失敗后，筆者將脂肪分割成3 mm×3 mm×2 mm小塊，多個(gè)小塊放于一個(gè)包埋框中，最后制成一個(gè)蠟塊。較小的組織塊能得到較好的脫水、透明以及浸蠟效果，也不會(huì)影響后續(xù)觀察。②固定：固定一定要徹底，這是制備各種病理切片都至關(guān)重要的步驟。固定液至少為脂肪組織體積的50倍，用紗布覆蓋以避免脂肪組織因懸浮在液體表面而造成固定不全。固定的目的是為了防止組織的自溶與腐敗，以保持組織或細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)。良好固定的組織呈一定的硬化狀態(tài)，增加了組織的韌性，而且不易變形，有利于后續(xù)的脫水、透明、浸蠟、包埋及切片。徹底的固定可以更好的保證細(xì)胞膜的完整性，這在一定程度上可延長(zhǎng)組織的脫水時(shí)間，并且在乙醇脫水、二甲苯透明及浸蠟的過(guò)程緩慢而溫和，不會(huì)過(guò)于劇烈而引起組織的變形。固定時(shí)間也不宜太長(zhǎng)，時(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)造成抗原性丟失，固定時(shí)間以12 h為宜。③脫水、透明及浸蠟：傳統(tǒng)上認(rèn)為細(xì)胞中的脂滴容易被乙醇、二甲苯等有機(jī)溶劑溶解，但近年來(lái)有研究表明：相對(duì)于乙醇，二甲苯有著更好的溶解置換脂滴的效果[5]。故此，筆者改良的脫水、透明、浸蠟程序中，大大延長(zhǎng)了100%乙醇溶液脫水以及二甲苯透明時(shí)間，以求盡可能置換出脂肪細(xì)胞中的大量脂滴。并且，筆者參考文獻(xiàn)[6-8]，在包埋前增加了使用眼科鑷擠壓脂肪塊的步驟。在包埋前將脂肪小塊放于石蠟包埋機(jī)加熱板上，利用加熱板上的高溫使脂滴仍然呈液態(tài)，用乙醇燈預(yù)熱眼科鑷，接著在脂肪組織上輕輕適當(dāng)?shù)財(cái)D壓，使在脂肪組織中不能置換掉的脂滴盡量地?cái)D出。改良程序處理的脂肪組織中，脂肪細(xì)胞中的脂滴被乙醇充分置換，進(jìn)而也能被透明劑二甲苯以及石蠟充分置換，進(jìn)而達(dá)到支撐細(xì)胞的作用，從而也能使蠟塊質(zhì)地均一，脂肪組織較軟；將脂滴完全置換，也能使組織塊得到充分的硬化，有助于后期的石蠟制片。傳統(tǒng)程序組中，脫水不盡，脂滴不能充分被置換，二甲苯則不能完全滲入，蠟液更不能完全滲入組織，達(dá)不到支撐組織的作用，組織較軟，蠟塊質(zhì)地不均一，切片質(zhì)量差，易出現(xiàn)組織破碎、空洞、重疊。

筆者改良的大鼠脂肪組織石蠟切片制片方法，通過(guò)改良組織脫水、透明、浸蠟程序以及包埋方法，在不增加微波熱固定、丙酮脫脂等復(fù)雜處理的同時(shí)[9-10]，有效提高了制片質(zhì)量，能滿足后續(xù)研究需求，值得在科研領(lǐng)域推廣。