枳椇皮提取物對泌尿結(jié)石大鼠腎功能及c-jun氨基末端激酶 信號通路的調(diào)節(jié)作用及其機制

鄭 新 于 斌 李育欣 何 蕊

（天津市第四中心醫(yī)院泌尿外科，天津 300140）

泌尿結(jié)石種類較多，近80%結(jié)石由草酸鈣構(gòu)成[1]。常見的治療方法為手術(shù)治療，但其術(shù)后的復發(fā)率為60%～80%。此外，外科手術(shù)中引起的腎損傷亦是結(jié)石治療過程中不容忽視的。相關(guān)研究提出[2]，枳椇皮提取物對腎結(jié)石具有一定的治療作用。枳懼又稱雞腳爪，其籽具有清涼利尿等作用，其皮可活血、舒筋解毒，其果可健胃、補血。經(jīng)貴州民間長期臨床觀察證實，枳椇皮對腎結(jié)石具有較好的治療效果。c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）是位于細胞質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其介導的JNK信號通路與細胞增殖、凋亡、細胞應激等多種生理活動密切相關(guān)，是機體內(nèi)重要的信號通路。多種腎臟疾病與JNK信號通路及其相關(guān)蛋白的異常表達密切相關(guān)。已有研究證實[3]JNK信號通路對于糖尿病引起的腎損傷具有一定的治療作用。另外研究發(fā)現(xiàn)[4]，JNK在草酸鈣結(jié)石中表現(xiàn)為異常高表達，激活的JNK通過調(diào)節(jié)JNK通路的相關(guān)蛋白可誘導腎小管上皮細胞凋亡的發(fā)生，影響腎功能。由于近80%的泌尿結(jié)石為腎結(jié)石，因此本文建立腎結(jié)石大鼠模型，研究枳椇皮提取物對腎結(jié)石大鼠腎功能及JNK信號通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

選取SPF級健康SD大鼠55只，體質(zhì)量200~300 g，由長沙市海天勤公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）-2019-0002]。常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水。隨機將大鼠分為對照組（健康大鼠）、模型組（泌尿結(jié)石大鼠模型組）、低劑量組（泌尿結(jié)石大鼠模型+15 mg/kg枳椇皮提取物）、高劑量組（泌尿結(jié)石大鼠模型+25 mg/kg枳椇皮提取物）、排石組（排石顆粒藥物對照），每組11只。

1.2 實驗試劑

枳椇皮采自貴州省，經(jīng)專家鑒定為鼠李科植物枳椇的樹皮部分；排石顆粒（江西南昌濟生制藥廠 ）；p-JNK、JNK一抗（廣州丹麥公司）；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)試劑盒（上海雅吉公司）；TUNEL試劑盒（西安東澳公司）；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（creatinine，Cr）試劑盒（長春匯力公司）。

1.3 枳椇皮提取物制備

取枳椇皮100 g，蒸餾水提取2次，取提取液，濃縮至浸膏，干燥至粉末。使用前，取部分粉末溶于水中按所需濃度配置。

1.4 模型建立及給藥

對照組大鼠給予常規(guī)飼養(yǎng)，其余各組大鼠給予1%乙二醇去離子水作為大鼠的唯一飲用水源并自由飲用，以制作腎結(jié)石模型[5]。建模成功后，對照組及模型組大鼠給予2 mL/d蒸餾水灌胃，低、高劑量組分別給予15 mg/kg、25 mg/kg枳椇皮提取物灌胃，排石組給予100 mg/kg排石顆粒灌胃。4周后結(jié)束灌胃。

1.5 H-E染色觀察大鼠腎組織病理形態(tài)

實驗結(jié)束后，收集大鼠24 h空腹尿量，顯微鏡下觀察草酸鈣結(jié)晶。而后處死各組大鼠，切取左側(cè)腎組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)制作切片，并進行H-E染色，最后以中性樹膠封片，在偏光顯微鏡下觀察大鼠腎組織的病理改變。

1.6 比色法檢測各組大鼠腎功能指標水平

斷頭處死各組大鼠，經(jīng)腹主動脈采集各組大鼠血液樣本5 mL，以3 000 r/min離心10 min，將上清凍存于-20℃冰箱，用比色法檢測血清BUN和Cr水平。

1.7 TUNEL法檢測各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡

取各組大鼠腎組織石蠟切片脫蠟，加入20 μg/mL不含核酸內(nèi)切酶的蛋白酶K工作液處理組織37℃反應15 min，蛋白酶K通透后，4%多聚甲醛浸泡5 min，100 μL平衡緩沖液室溫5 min，加100 μL TdT反應混合液，置濕盒中，37℃反應1 h，加50 μL convertr-POD，常溫無光孵育0.5 h，PBS清洗，DAB液顯色，沖洗，蘇木精復染，脫水透明、封片。以細胞核呈棕褐色為凋亡陽性細胞的判定標準。取5個高倍視野，計數(shù)細胞中的陽性細胞，細胞凋亡率=凋亡陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)。

1.8 免疫組織化學檢測各組大鼠腎組織p-JNK、JNK表達

大鼠斷頭處死后分離腎，用4%多聚甲醛固定，室溫下靜置10 min，石蠟包埋、切片，經(jīng)脫蠟、水化、封閉、抗原修復、封閉后，37℃放置30 min，滴加稀釋的p-JNK、JNK一抗（1∶200），4℃過夜。次日加人二抗（1∶1 000）及SABC（1∶1 500），室溫DAB顯色，封片后顯微鏡觀察。

1.9 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平檢測

取各組大鼠腎組織，將其制成勻漿后離心10 min。黃嘌呤氧化酶法檢測腎組織SOD水平，TBA法測定腎組織MDA水平，嚴格按照說明書操作。

1.10 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎組織形態(tài)

草酸鈣結(jié)晶多呈現(xiàn)菱形。模型組大鼠尿液中的草酸鈣結(jié)晶明顯排出較少，低、高劑量組與排石組草酸鈣結(jié)晶排出量均較模型組高，且以高劑量組效果最佳。H-E染色可見，對照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠腎小管上皮細胞發(fā)生壞死，有大量炎癥細胞浸潤，管腔中可見明顯的結(jié)石結(jié)晶，部分腎小球發(fā)生明顯的萎縮；低劑量組大鼠部分腎小管上皮細胞壞死，管腔中可見少量結(jié)石結(jié)晶，周圍炎癥細胞浸潤有所減少，腎小球未見明顯萎縮；高劑量組大鼠腎小管上皮細胞未發(fā)生腫脹及壞死，管腔未有結(jié)石，無炎癥細胞浸潤，腎小球未發(fā)生萎縮；排石組大鼠腎小管上皮細胞有些輕微的腫脹，未見壞死，管腔中未見結(jié)石，腎間質(zhì)未見炎癥細胞浸潤，腎小球未發(fā)生萎縮（圖1）。

2.2 各組大鼠腎功能指標水平比較

模型組大鼠血BUN、Cr水平較對照組高（P＜0.05），低劑量組血BUN、Cr水平較模型組低（P＜0.05）。高劑量組與排石組血BUN、Cr水平較低劑量組低（P＜0.05）。高劑量組與排石組血BUN、Cr水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組大鼠血清BUN、Cr水平比較（n=11，±s）

表1 各組大鼠血清BUN、Cr水平比較（n=11，±s）

*P＜0.05 vs 對照組；#P＜0.05 vs 模型組；△P＜0.05 vs低劑量組

組別 BUN（mmol/L） Cr（μmol/L）對照組 3.01±0.42 162.27±20.34模型組 7.28±1.05* 234.59±31.45*低劑量組 5.82±0.59*# 201.37±24.82*#高劑量組 3.65±0.37*#△ 162.49±22.17*#△排石組 4.05±0.41*#△ 171.52±31.22*#△

2.3 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡比較

對照組、模型組、低劑量組、高劑量組與排石組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率分別為4.27%±0.31%、30.45%±3.26%、17.24%±1.15%、12.45%±1.03%、13.11%±0.84%。模型組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率高于對照組（P＜0.05），低劑量組低于模型組（P＜0.05），高劑量組和排石組低于低劑量組（P＜0.05），而高劑量組和排石組差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

2.4 各組大鼠腎組織p-JNK、JNK水平比較

模型組大鼠腎組織p-JNK、JNK水平高于對照組（P＜0.05），低劑量組低于模型組（P＜0.05），高劑量組和排石組低于低劑量組（P＜0.05），而高劑量組與排石組p-JNK、JNK水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2，圖3）。

表2 各組大鼠腎組織p-JNK、JNK水平比較（n=11，±s）

表2 各組大鼠腎組織p-JNK、JNK水平比較（n=11，±s）

*P＜0.05 vs 對照組；#P＜0.05 vs 模型組；△P＜0.05 vs低劑量組

組別 p-JNK JNK對照組 2.23±0.14 2.52±0.17模型組 7.65±0.82* 7.95±0.84*低劑量組 5.71±0.58*# 6.43±0.58*#高劑量組 3.62±0.27*#△ 3.94±0.41*#△排石組 4.24±0.33*#△ 4.25±0.37*#△

2.5 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平比較

與對照組相比，模型組大鼠腎組織中SOD降低、MDA升高（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組大鼠SOD升高、MDA降低（P＜0.05）；與低劑量組相比，高劑量組與排石組SOD升高、MDA降低（P＜0.05），高劑量組與排石組SOD、MDA水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

表3 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平比較（n=11，±s）

表3 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平比較（n=11，±s）

*P＜0.05 vs 對照組；#P＜0.05 vs 模型組；△P＜0.05 vs低劑量組

組別 SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot）對照組 65.26±6.17 0.56±0.04模型組 32.47±4.52* 1.98±0.21*低劑量組 46.38±3.96*# 1.09±0.18*#高劑量組 63.47±5.88*#△ 0.67±0.08*#△排石組 59.56±7.49*#△ 0.73±0.05*#△

3 討論

腎結(jié)石是一種常見的、復發(fā)性疾病，在亞洲其患病率為2%～5%，而在歐洲和北美洲其患病率高達8%～15%，草酸鈣是腎結(jié)石的主要成分，約占腎結(jié)石成分的80%[6]。在中國至少有一億多人口患腎結(jié)石疾病[7]。西醫(yī)對于該病的治療多采用手術(shù)的方式，但術(shù)后復發(fā)率較高，中醫(yī)運用對癥治療的方式，改善體質(zhì)、消除結(jié)石，從而起到治療作用。

圖1 各組大鼠H-E染色結(jié)果。A：對照組；B： 模型組；C：低劑量組；D： 高劑量組；E： 排石組。A1~E1：標尺=100 μm，×100；A2~E2：標尺=25 μm，×400.圖2 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況，標尺=50 μm。A：對照組；B： 模型組；C：低劑量組；D： 高劑量組；E： 排石組.圖3 各組大鼠腎組織中p-JNK（A1~E1）、JNK（A2~E2）水平對比，標尺=50 μm，×200。A：對照組；B： 模型組；C：低劑量組；D： 高劑量組；E： 排石組.

尿液過飽和導致晶體于腎上皮細胞黏附是腎結(jié)石產(chǎn)生的一個過程。腎上皮細胞黏附導致晶體滯留管腔并堆積形成晶體，最終形成腎結(jié)石。細胞損傷是細胞黏附的基礎(chǔ)病理條件。當細胞損傷后，會有大量帶負電荷的分子產(chǎn)生，這些分子可吸附帶正電荷的草酸鈣結(jié)晶，同時還可使細胞產(chǎn)生自由基，通過氧化損傷進一步損傷腎上皮細胞，形成惡性循環(huán)，導致腎結(jié)石產(chǎn)生[8-9]?；钚匝醯倪^量生成或體內(nèi)抗氧化水平的降低，將導致氧化應激和炎癥損傷，并通過促進腎小管上皮細胞損傷參與結(jié)石的生成。MDA、SOD是臨床上常用反應機體氧化應激損傷程度的指標，MDA是氧自由基氧化后的產(chǎn)物，SOD為抗氧化物。枳椇具有清涼利尿等作用，在貴州等地常用其皮泡水用于治療結(jié)石，經(jīng)長期臨床觀察，發(fā)現(xiàn)其具有一定的治療效果。本研究結(jié)果顯示，枳椇皮提取物可有效減少腎上皮細胞的凋亡、促進草酸鈣結(jié)晶的排出并改善氧化應激狀態(tài)。顏春魯?shù)萚10]研究證實了通過減少氧化應激損傷可有效抑制腎結(jié)石形成。柳海艷等[11]在對酒精肝的實驗研究中提出，枳椇籽具有提高模型大鼠抗氧化的功能。任群利等[12]在對腎結(jié)石大鼠的研究中提出，通過運用枳椇皮提取物干預后，發(fā)現(xiàn)大鼠尿液中排出大量草酸鈣結(jié)晶，且組織病理形態(tài)顯示病情有所改善。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)加工蛋白質(zhì)的重要細胞器，當病理損傷因素持續(xù)存在時，會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白分離并通過下游信號轉(zhuǎn)導途徑引起組織損傷。JNK是JNK信號通路的關(guān)鍵蛋白，JNK蛋白以磷酸化形式激活，并影響下游相關(guān)蛋白的表達[13-14]。JNK通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的下游通路之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過促進p-JNK增加促凋亡蛋白因子水平，導致腎小管上皮細胞凋亡，加重腎結(jié)石嚴重程度，影響腎功能[15-16]。BUN、Cr是反映腎功能損傷程度的指標[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)枳椇皮可有效降低p-JNK、JNK水平，并可改善大鼠腎功能損傷，這與任群利[12]等對腎結(jié)石大鼠的研究結(jié)果相似。蘭天[19]等在對糖尿病腎病大鼠的研究中提出，JNK水平升高可促進足細胞凋亡，進而誘導腎小球濾過功能障礙。賀德華[20]等對腎結(jié)石大鼠的研究證實，漢黃芩通過調(diào)控JNK信號通路，改善大鼠腎功能。本研究與上述研究結(jié)果相似。

綜上所述，枳椇皮提取物通過降低JNK水平，減少腎小管上皮細胞的凋亡，降低氧化損傷，從而改善泌尿結(jié)石大鼠腎功能。