羅布麻微生物脫膠的菌種篩選與工藝優(yōu)化

程 芬，張興群,2，王云龍，王 穎

(1.新疆大學 紡織與服裝學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.東華大學 生物與醫(yī)學工程學院，上海 201620)

羅布麻是新疆特色植物，被譽為野生纖維之王，對環(huán)境的適應能力強且具有較高的應用價值。羅布麻的葉不僅可制茶和飲料，還具有調(diào)節(jié)血壓[1]、降低心臟病的發(fā)作[2]、抗糖尿病[3]、延緩衰老[4]等作用。此外，羅布麻的稈和麻皮可用于造紙，由麻稈韌皮部纖維制備的織物還具有高透氣性、抗菌性、防紫外線等性能[5-6]。

為實現(xiàn)羅布麻纖用化，提高羅布麻利用率，研究人員做了大量的研究。其中，脫膠已成為羅布麻纖維加工過程中的關(guān)鍵工藝，目前麻纖維的脫膠主要有機械脫膠、化學脫膠、微生物脫膠等方法[7]。機械脫膠是利用麻木質(zhì)部與韌皮部的物理力學性能差異使麻經(jīng)碎莖機、打麻板的作用后其木質(zhì)部碎、爛，膠質(zhì)部分脫落，梳理、分離纖維的過程，纖維柔軟但纖維損傷大，短纖率高，含雜多?；瘜W脫膠是利用原麻中纖維素與膠雜質(zhì)對酸、堿、氧化劑的穩(wěn)定性不同，在不損傷或少損傷纖維原有機械性能的前提下使用化學藥劑去除膠質(zhì)的過程，脫膠高效，工藝參數(shù)易控制，但耗能大，設備投資大，成本高，且廢水排放量大，污染環(huán)境。微生物脫膠就是利用“麻膠育菌、菌株產(chǎn)酶、酶解膠質(zhì)”這一系列生化循環(huán)反應，溫和高效且綠色環(huán)保地脫去麻纖維中的膠質(zhì)[8-9]；但在脫膠過程中菌株的產(chǎn)酶力和脫膠工藝參數(shù)會直接影響脫膠效果甚至纖維的品質(zhì)[10]，因此篩選脫膠效果好，能耗低且對麻纖維損傷小的菌株是微生物脫膠研究中長期且基礎的工作[11-12]。

新疆地區(qū)日照時間長，晝夜溫差大，土地干旱且高鹽堿。野生麻類在此條件下生長，其土壤中的微生物經(jīng)過長期的物競天擇，對環(huán)境的適應性較強，且有些菌株可能會因以麻稈中的膠質(zhì)作為營養(yǎng)來源具有一定的脫膠能力。在篩選新疆地區(qū)野生麻生境土壤中具有脫膠能力的菌株的過程中，可能會發(fā)現(xiàn)新的脫膠菌株或脫膠菌株新的復配方式，從而提高羅布麻微生物脫膠效率，因此，本文試驗采集烏魯木齊南山野生麻生長地土樣，分離、篩選、鑒定了土壤及腐爛麻中具有脫膠效果的細菌，并使用正交試驗優(yōu)化脫膠工藝，以殘膠率、斷裂強度對其脫膠效果進行了表征，以期提高羅布麻的脫膠效率，同時也為麻類微生物脫膠提供更多的選擇。

1 試驗部分

1.1 試驗材料

土樣：6份，采自新疆烏魯木齊南山野生麻生長區(qū)。

基礎材料：3, 5-二硝基水楊酸(DNS)試劑、0.15%剛果紅(CR)溶液(自配)，其余試劑為分析純。

培養(yǎng)基：羅布麻培養(yǎng)基(羅布麻莖粉10 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀1 g，氯化鉀5 g，氯化鈣0.2 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，去離子水1 L，pH值7.2)；分離培養(yǎng)基(果膠4 g，其他無機成分同羅布麻培養(yǎng)基)；果膠固體培養(yǎng)基(果膠4 g，硫酸銨3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.1 g，瓊脂粉18 g，去離子水1 L，pH值7.2)；木聚糖固體培養(yǎng)基(木聚糖 4 g，其他無機成分同果膠培養(yǎng)基)；發(fā)酵培養(yǎng)基(牛肉膏3 g，果膠0.5 g，木聚糖0.5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀1 g，去離子水1 L，pH值7.2)。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物富集

分別稱取土樣和羅布麻莖粉各5 g加入盛有45 mL無菌水且有玻璃珠的三角瓶中，振蕩打散后37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，在羅布麻培養(yǎng)基接入45 mL培養(yǎng)液上清連續(xù)靜置培養(yǎng)傳代，以第3代上清作為富集培養(yǎng)液。

1.2.2 菌株初篩

取富集培養(yǎng)液梯度稀釋10-4、10-5、10-6倍，取各梯度稀釋菌液0.2 mL分別涂布于分離培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h至長出菌落。分離不同形態(tài)的菌株，并挑選單菌落分別接種于羅布麻培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，得到初篩菌液。

1.2.3 透明圈法復篩

將初篩菌液分別涂布于果膠、木聚糖培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h后,加入0.15% CR染液染色處理30 min(覆蓋質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，倒去CR溶液后加入1 mol/L氯化鈉溶液脫色處理30 min，挑選菌落周圍出現(xiàn)明顯透明圈[13]的培養(yǎng)基，用游標卡尺以十字交叉法測量水解圈直徑和菌落直徑，并計算水解圈直徑與菌落直徑的比值(HC)，篩選HC值大的菌株進一步進行酶活測定。

1.2.4 酶活測定

標準曲線制作：配制1 mg/mL木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖溶液，稀釋不同濃度(見表1)后與DNS試劑進行顯色反應，測定540 nm處的吸光度并繪制標準曲線，用于果膠酶、半纖維素酶、纖維素酶活性的計算。

表1 糖標液配制

粗酶液制備：將復篩菌株以2%的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min條件培養(yǎng)14 h，發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、4 000 r/min離心15 min后的上清液即粗酶液。

酶活力測定：采用DNS比色法[14]分別測定木聚糖酶、果膠酶以及纖維素酶的酶活。在25 mL比色管中分別加入1 mL底物(果膠、木聚糖、羧甲基纖維素鈉溶液)、0.2 mL粗酶液，50 ℃水浴反應30 min后加入2.0 mL DNS試劑顯色處理，再檢測540 nm處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算還原糖量，從而計算酶活。最終根據(jù)酶活大小篩出木聚糖酶活、果膠酶活高而低(或無)纖維素酶活的菌株。酶活計算公式如下：

式中：E為酶活力，U/mL；S為還原糖量，mg/mL；T為反應時間30 min；M為酶量，本文為0.2 mL。

1.2.5 菌株鑒定

將酶活測定后篩得的新鮮菌液送至上海生工生物工程股份有限公司進行16 S rRNA測序。采用通用引物27 F(5′-A G A G T T T G A T C M T G G C T C A G-3′)和1492 R(5′-T A C G G Y T A C C T T G T T A C G A C T T-3′)進行擴增，參比GenBank中序列相似性較高的菌株、序列與得到的基因序列進行對比分析。

1.2.6 單菌株脫膠工藝優(yōu)化

對所篩最優(yōu)勢脫膠菌株X7進行單菌株脫膠工藝優(yōu)化。按照正交試驗因素水平表(見表2)設計正交試驗，分別參照GB 5889—1986《苧麻化學成分定量分析方法》和GB/T 5886—1986《苧麻單纖維斷裂強度試驗方法》測試殘膠率和斷裂強度，以殘膠率和斷裂強度作為參考指標分析結(jié)果，并以優(yōu)化后的工藝條件進行脫膠，檢測其殘膠率。

表2 正交試驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離初篩

自然條件下，野生羅布麻生長環(huán)境中微生物可利用的營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，通過長期自然條件的篩選，羅布麻腐爛的葉、莖成為某些微生物生長的主要營養(yǎng)來源，這些菌株可能具有一定的脫膠能力，因此首先采用平板稀釋法從6 份土樣中共分離出112 株菌，分別將其接種于以羅布麻莖粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中，對可能具有脫膠效果的菌株進行初篩，最終初篩得到對羅布麻可能具備一定脫膠能力的菌75 株。

2.2 剛果紅水解圈復篩

羅布麻微生物脫膠主要以去除果膠、半纖維素(包括木聚糖、阿拉伯木聚糖等)等膠質(zhì)為主[15]。果膠、半纖維素都屬于多糖類物質(zhì)，可被菌株產(chǎn)生的果膠酶、木聚糖酶分解為單糖、二糖等小分子物質(zhì)，從而使纖維從膠質(zhì)的包裹中分離出來。果膠、木聚糖瓊脂培養(yǎng)基中因含有果膠、木聚糖這類大分子多聚糖可以和剛果紅染料結(jié)合，從而使平板顯紅色。但在平板中接種具有脫膠效果的菌株后，菌株產(chǎn)生的果膠酶、木聚糖酶會分解培養(yǎng)基中的果膠、木聚糖，培養(yǎng)基無法與剛果紅染料結(jié)合而生成紅色復合物[16]，菌體周圍形成以菌體為中心的透明水解圈。菌體產(chǎn)生的果膠酶、木聚糖酶以菌體為中心向外擴散，濃度逐漸降低，培養(yǎng)基中沒有被分解的果膠、木聚糖就會與剛果紅染料結(jié)合而顯色。通過是否產(chǎn)生透明圈、透明圈與菌落直徑的比值及剛果紅染色的深淺對初篩獲得的75 株菌進行復篩發(fā)現(xiàn)，有51 株菌能夠在木聚糖培養(yǎng)基產(chǎn)生水解圈，28 株菌能夠在果膠培養(yǎng)基產(chǎn)生水解圈，25 株菌在果膠、木聚糖培養(yǎng)基均能產(chǎn)生水解圈，因此初步判斷這25 株菌可能具有生產(chǎn)果膠酶和木聚糖酶的能力。對這25 株菌進行編號以備后續(xù)試驗，如圖1所示。

圖1 菌株剛果紅HC值

2.3 酶活分析

麻微生物脫膠要求在不損傷或低損傷纖維的前提下盡可能地除去膠質(zhì)，因而要求脫膠菌分泌的酶具備高果膠酶活、高木聚糖酶活，低或無纖維素酶活。而果膠、木聚糖、纖維素等大分子經(jīng)微生物分泌的酶催化降解后生成的還原糖(半乳糖醛酸、葡萄糖或低聚木糖等)能使DNS還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，且酶促反應過程中酶活大小與生成的還原糖量呈正比[17-18]，因此通過測量溶液中還原糖的濃度評價各株菌的果膠酶活、纖維素酶活和木聚糖酶活。經(jīng)酶活測定后篩選出優(yōu)勢脫膠菌9株(如表3所示)，所有菌株分泌纖維素酶的能力較低，果膠及木聚糖酶活性較高，理論上具有一定脫膠能力，且除菌株Y8外其余菌株的纖維素酶活均在0.22 U/mL及以下，對纖維損傷較小。

表3 酶活測定結(jié)果

2.4 16 S rRNA測序

經(jīng)測序比對序列后剔除重復菌株，得到優(yōu)勢脫膠菌7株分別如表4所示，其中Y8、YE13、Z4、2-1菌株的16 S rRNA基因序列與芽孢桿菌屬的基因序列同源性分別為100.00%、100.00%、100.00%、99.86%，可被認定為芽孢桿菌屬；L1菌株的16 S rRNA基因序列與大腸桿菌屬的同源性為99.36%，可被認定為大腸桿菌屬；X7菌株的16 S rRNA基因序列與克雷伯菌屬的同源性為100.00%，可被認定為克雷伯菌屬；GAN1的16 S rRNA基因序列與泛菌屬的同源性為98.73%，可被認定為泛菌屬。

表4 菌株基因序列比對結(jié)果

芽孢桿菌屬是目前分離出的能夠降解麻膠質(zhì)的主用菌種之一，可分泌果膠酶、半纖維素酶以及少量的纖維素酶，這與麻脫膠要求菌株高產(chǎn)果膠酶、木聚糖酶，低(或不)產(chǎn)纖維素酶以達到高效降解果膠、半纖維素而不損傷纖維的目的相適應。泛菌屬是腸桿菌科中不被包裹、不形成孢子的革蘭氏陰性細菌，一般定殖于植物根部，具有植物促生特性，經(jīng)過麻生長環(huán)境的長期選擇而具備一定的脫膠能力，也在一些麻脫膠的研究中被應用[19]。細菌鑒定后并未發(fā)現(xiàn)新型菌株，但是也篩到了芽孢桿菌屬這類主用脫膠菌種以及泛菌屬、腸桿菌屬和克雷伯菌屬這幾種較少使用的脫膠菌種，這將有助于突破麻微生物脫膠菌株集中使用黑曲霉、芽孢桿菌、腸桿菌、歐文氏菌等的局限，增加脫膠菌的多樣性。

2.5 正交優(yōu)化結(jié)果分析

以搖床轉(zhuǎn)速(A因素)、脫膠溶液pH值(B因素)、浴比(C因素)對所篩最優(yōu)勢脫膠菌株X7進行單菌株脫膠工藝參數(shù)的優(yōu)化，結(jié)果見表5。

表5 微生物脫膠正交試驗優(yōu)化結(jié)果

由表5可知，A、B、C這3個因素對殘膠率影響的重要程度為：C>A>B，即浴比>搖床轉(zhuǎn)速>脫膠液初始pH值，最佳水平組合為：A2B3C2，對纖維斷裂強度影響的重要程度為：A>B>C，即搖床轉(zhuǎn)速>脫膠液初始pH值>浴比，最佳水平組合為：A2B1C1。

利用方差分析、顯著性檢驗確定三因素對殘膠率和纖維斷裂強度影響的顯著性，從最佳水平組合中確定出最佳工藝參數(shù)，結(jié)果如表6所示。3個因素對殘膠率影響為：C、A對殘膠率影響極顯著，B對殘膠率影響顯著，即搖床轉(zhuǎn)速和浴比對殘膠率影響極顯著，脫膠液初始pH值對殘膠率影響顯著，三因素對斷裂強度的影響為：B、A對纖維斷裂強度影響顯著，而C對纖維斷裂強度的影響不顯著，即搖床轉(zhuǎn)速和脫膠液初始pH值對纖維斷裂強度影響顯著，浴比影響不顯著。綜合搖床轉(zhuǎn)速、脫膠溶液pH值、浴比對殘膠率和斷裂強度影響的顯著性，考慮在不影響纖維斷裂強度的條件下獲得盡可能低的殘膠率，本次試驗最優(yōu)的脫膠工藝參數(shù)為A2B1C2，即當搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min，溶液pH值為7，浴比為1∶40時具有最佳脫膠效果。

表6 方差分析表

2.6 脫膠效果分析

在最佳工藝參數(shù)條件下，對X7單菌株以及X7菌株與本次試驗分離的其他6株菌復配的脫膠效果進行測試，通過檢測殘膠率評價脫膠效果，結(jié)果見表7。

表7 脫膠效果驗證表

由表7可知，在最佳工藝參數(shù)條件下，復配菌株的脫膠效果都要優(yōu)于單菌株脫膠，其中7株菌株復配的脫膠效果最好，殘膠率為30.45%，說明構(gòu)建復合菌系脫膠效果更好，最佳脫膠方式為7菌系復合脫膠。這可能是由于所篩的7株優(yōu)勢脫膠菌的復合系中菌株之間形成了穩(wěn)定的脫膠菌群，且脫膠過程中各菌株發(fā)揮作用不同，存在種間協(xié)同作用且還可能存在菌株之間的拮抗作用，協(xié)同效果大于拮抗效果，從而改變菌群的脫膠能力[20]。此外，C6/1的脫膠能力(殘膠率50.74%)比其組成菌株中的菌株X7、L1、2-1的單一菌株脫膠時的能力弱(即菌株X7、L1、2-1在復合菌群中未發(fā)揮出最佳脫膠效能)，說明復合菌系脫膠時同時存在菌種之間的協(xié)同作用、拮抗作用影響菌系脫膠效果。

3 結(jié) 論

本文以新疆烏魯木齊南山野生麻生長區(qū)土壤為樣篩菌，并用所篩菌株優(yōu)化羅布麻脫膠工藝，以提高羅布麻的微生物脫膠效率，主要得出以下結(jié)論：

1)最終篩得7株菌，主要為芽孢桿菌屬，此外還有腸桿菌屬、克雷伯菌屬和泛菌屬。

2)所篩菌株分泌纖維素酶的能力較低，果膠及木聚糖酶活性較高纖維素酶活低，具備一定脫膠力且對纖維損傷小，這些特點均適用于實際麻微生物脫膠應用。

3)在脫膠液pH值為7，浴比為1∶40，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min的條件下，菌株單獨或復配都能夠有效對麻纖維進行脫膠，且上述7菌系復合脫膠有更好脫膠效果，這將有助于突破麻微生物脫膠菌株集中使用芽孢桿菌、黑曲霉、腸桿菌、歐文氏菌等菌種的局限，豐富麻脫膠菌種多樣性，為麻微生物脫膠提供了更多的選擇。

4)在下階段的研究中將擴大菌種篩選范圍，對新疆其他野生麻生長區(qū)內(nèi)土壤微生物進行篩選，以期從中發(fā)現(xiàn)更適于實際羅布麻微生物脫膠的新型優(yōu)勢脫膠菌株。