鄭桂花,鄒文安,趙 倩
(1.成都工業(yè)學(xué)院材環(huán)學(xué)院,成都 611730;2.華中科技大學(xué)分子生物物理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430074)
L-絲氨酸是一種不帶電、非極性及非必需氨基酸,在食品行業(yè)具有十分重要的作用。在100℃下條件下加熱食品,加熱的過(guò)程能夠散發(fā)出香味,主要是由于氨基酸和糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)和斯特勒克降解反應(yīng),生成產(chǎn)物2-羥基乙醛,使得混合物具有楓糖漿香味,能夠增加食物的風(fēng)味[1]。
L-絲氨酸位于代謝過(guò)程的中間位置,轉(zhuǎn)化較快,不易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。目前,主要采用發(fā)酵法、生物酶法、水解及化學(xué)合成法生產(chǎn)L-絲氨酸[2-4]。生物酶法具有較強(qiáng)的催化專(zhuān)一性、溫和的反應(yīng)條件等優(yōu)點(diǎn)[5]。本文采用基因工程菌E.coli-SRZ018產(chǎn)生的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化甘氨酸(glycine,Gly)轉(zhuǎn)化合成L-絲氨酸,催化該步反應(yīng)的酶是絲氨酸經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT),該酶以5-磷酸毗哆醛(5-pyridoxalphosphate,PLP)作為其輔酶。Gly和絲氨酸之間是互相轉(zhuǎn)換,反應(yīng)的生理方向是L-絲氨酸斷裂成為甘氨酸和N5,N10-亞甲基四氫葉酸,輔酶四氫葉酸(tetrahydrofolic acid,THFA)作為C1基團(tuán)的載體,所以,在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和PLP、THFA兩種輔酶因子共同作用下,甘氨酸和甲醛(formaldehyde,HCHO)反應(yīng)生成L-絲氨酸。在體外,當(dāng)有一定濃度的THFA時(shí),SHMT也可催化HCHO與Gly可逆地合成L-絲氨酸。
隨著酶和細(xì)胞固定化技術(shù)在氨基酸工業(yè)的應(yīng)用,生物酶法合成L-絲氨酸成為研究熱點(diǎn)[6-8]。但生物酶法合成L-絲氨酸存在轉(zhuǎn)化率不高、L-絲氨酸產(chǎn)量不理想等問(wèn)題,而底物甘氨酸的轉(zhuǎn)化率及L-絲氨酸產(chǎn)量受HCHO濃度影響較大。如果HCHO供應(yīng)量超過(guò)L-絲氨酸消耗量,體系中的HCHO逐漸積累,過(guò)量的HCHO和氨基酸的氨基反應(yīng)生成席夫堿和質(zhì)子,溶液pH降低,導(dǎo)致反應(yīng)終止,可能導(dǎo)致底物甘氨酸的轉(zhuǎn)化率不高。因此,本研究旨在從HCHO的供應(yīng)方式入手,針對(duì)酶促轉(zhuǎn)化過(guò)程高濃度HCHO導(dǎo)致的反應(yīng)體系pH下降、抑制底物轉(zhuǎn)化的問(wèn)題,提出了滴加HCHO策略,同步分析其它因素對(duì)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)酸量的影響,為工業(yè)化生產(chǎn)L-絲氨酸提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
1.1.1 試驗(yàn)材料
菌株E.coli-SRZ018為基因工程菌,系本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。種子培養(yǎng)基:玉米漿、硫酸鎂、谷氨酸鈉;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘油、硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、玉米漿、磷酸氫二鉀、氯化鐵;玉米漿是由本實(shí)驗(yàn)室自有玉米粉經(jīng)過(guò)高溫煮沸配置而成。
1.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)與生物量測(cè)定
配置種子培養(yǎng)基,經(jīng)過(guò)滅菌處理、冷卻,按照5%的體積比接種,37℃條件下,放置于200 rpm/min的搖床培養(yǎng),間隔1 h取樣一次,測(cè)定菌體生物量。分析不同的碳氮源、金屬離子和氨基酸等不同成分的培養(yǎng)基,在37℃,pH 6.8,裝液量為30 mL/250 mL的條件下,對(duì)微生物SRZ018生長(zhǎng)和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響。其中,生物量的測(cè)定采用蒸餾水稀釋發(fā)酵液至適當(dāng)倍數(shù),然后利用紫外分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)定OD600作為菌體量[9]。
1.2.1 試驗(yàn)器材
Gly由美國(guó)BIOSHARP公司生產(chǎn);磷酸吡哆醛、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、十六烷基三甲基溴化銨和HCHO等由國(guó)藥集團(tuán)提供;THFA是由美國(guó)Sigma公司銷(xiāo)售提供;高純度>96%甲酸由天津光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)提供;以上試劑均為分析純級(jí)別。
Thermo SCIENTIFIC離心機(jī),美國(guó)賽默飛公司;ZHWY-2102培養(yǎng)箱,上海智城;YM-50高壓蒸汽滅菌鍋,上海三申;IMS-50制冰機(jī),常熟市雪科;JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝;DK-S22電熱恒溫水浴鍋、真空干燥箱,上海精宏。
1.2.2 SRZ018酶活檢測(cè)
SHMT是L-絲氨酸合成中的關(guān)鍵酶,催化甘氨酸和L-絲氨酸的相互轉(zhuǎn)化[10]。細(xì)胞濕重即取一定量的發(fā)酵液,6 000 rpm離心10 min收集菌體;以蒸餾水充分洗滌菌體沉淀后,使用分析天平稱(chēng)取菌體重量。發(fā)酵液中SHMT單位重量菌體酶活力大小的酶比活SA(specific activity,SA)計(jì)算公式如下所示,比活SA單位U/mg。
比活SA=0.971×A279/菌體重量
1.2.3 菌體處理及酶促轉(zhuǎn)化
催化Gly合成L-絲氨酸的SHMT屬于胞內(nèi)酶,培養(yǎng)發(fā)酵一定時(shí)間后,離心收集菌體,對(duì)菌體進(jìn)行破壁處理,于5 000 rpm離心10 min,保留上清液,取一定量,依次加入不同濃度的底物甘氨酸、四氫葉酸和磷酸吡哆醛等物質(zhì),按照一定速度,滴加甲醛,調(diào)整酶促轉(zhuǎn)化混合溶液pH,30℃條件下開(kāi)始酶促轉(zhuǎn)化,每隔一定時(shí)間取樣,采用HPLC-ESI/MS確定甘氨酸、L-絲氨酸的含量[5],并計(jì)算底物甘氨酸的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率是反應(yīng)物反應(yīng)程度的重要表征指標(biāo)[11-12],是參與反應(yīng)的某種物質(zhì)的量占總加入量的百分率,也表示可逆反應(yīng)到達(dá)平衡時(shí),某反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率等于某反應(yīng)物甘氨酸的初始濃度和平衡濃度的差與該反應(yīng)物的起始濃度比值的百分比。
2.1.1 不同碳源對(duì)SRZ018發(fā)酵的影響
碳源是培養(yǎng)基的重要組成,作為生命過(guò)程中的能源物質(zhì)參與菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成。本研究重點(diǎn)分析葡萄糖、果糖、麥芽糖和甘油4種不同碳源對(duì)于工程菌SRZ018的影響如圖1所示,發(fā)現(xiàn)不同糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)應(yīng)微生物SRZ018生長(zhǎng)量為:果糖(5.17)>麥芽糖(4.01)>甘油(3.50)>葡萄糖(3.20),由葡萄糖為碳源構(gòu)成的培養(yǎng)基,SRZ018生物量顯著低于其它糖類(lèi)為主的培養(yǎng)基??赡苁怯捎谄咸烟且种莆⑸锷L(zhǎng)可能是由于培養(yǎng)基的高滲透壓和發(fā)酵過(guò)程中分解產(chǎn)生乙酸的抑制作用所致。進(jìn)一步分析不同濃度的果糖、麥芽糖、葡萄糖和甘油對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成的影響(圖1),可知果糖對(duì)微生物生長(zhǎng)的促進(jìn)效果并不明顯,果糖濃度為15.0 g/L的時(shí)候,生物量增幅較小,提高了5.6%;麥芽糖為5.0 g/L的時(shí)候,菌體OD600由6.51提高到8.61,提高了32.2%,說(shuō)明麥芽糖能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng),可用作種子培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)基中的速效碳源;向培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖后,無(wú)論是微生物的生長(zhǎng)還是酶活力均受到明顯抑制;甘油為8.0 g/L時(shí),OD600為7.042,以甘油為碳源對(duì)應(yīng)菌株SRZ018生物量大于葡萄糖的,酶活差異不明顯。隨著甘油濃度持續(xù)增加至15.0 g/L,表現(xiàn)出抑制作用,超過(guò)細(xì)胞氧化能力,造成“Crabtree”效應(yīng),同時(shí)報(bào)道發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基組分種用甘油代替葡萄糖,有助于減少乙酸物質(zhì)的合成[13],由此確定采用8.0 g/L的甘油作為唯一碳源。
圖1 不同濃度麥芽糖、葡萄糖、果糖和甘油對(duì)SRZ018發(fā)酵影響Figure 1 Different concentrations of fructose,maltose,glucose and glycerinum have effect on SRZ018 fermentation
2.1.2 不同氮源對(duì)SRZ018發(fā)酵的影響
氮源是微生物生長(zhǎng)繁殖所需的一類(lèi)重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),用于構(gòu)成微生物細(xì)胞并參與生理代謝活動(dòng),常用的氮源物質(zhì)中,通常無(wú)機(jī)化合物被微生物吸收利用較快,有時(shí)也被稱(chēng)為速效氮源,其被利用后會(huì)引起體系酸堿度的變化,可起到調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程的作用。由結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中加入蛋白胨后,微生物SRZ018的生長(zhǎng)和酶活均顯著增加。蛋白胨濃度為5 g/L時(shí),菌株OD600達(dá)到8.387,增加28.7%,此時(shí)酶活達(dá)到0.361 U/mg。蛋白胨含有豐富的氨基酸和維生素成分,能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)代謝。向培養(yǎng)基中添加玉米漿濃度為20.0 g/L時(shí),SRZ018微生物OD600為11.215,增幅超70%。培養(yǎng)基中玉米漿濃度保持增加,生物量持續(xù)上升,因此,培養(yǎng)基中添加玉米漿后,無(wú)論是微生物的生長(zhǎng)還是酶活均顯著增加。玉米漿含有豐富的氨基酸和維生素成分,能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)代謝[14],而硫酸銨濃度為10.0 g/L時(shí),對(duì)應(yīng)酶活最高為0.4,硫酸銨濃度為15.0 g/L時(shí),菌體OD600超過(guò)7.5,促進(jìn)微生物生長(zhǎng)作用顯著。硝酸鈉對(duì)微生物SRZ018生長(zhǎng)和SHMT產(chǎn)酶的作用,濃度范圍為5~10 g/L時(shí)變化顯著,在其他濃度范圍內(nèi)變化不顯著。結(jié)合已有研究,某大腸桿菌在分批次補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中,添加多種氮源,促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)作用顯著[15]。綜上,蛋白胨、玉米漿對(duì)SRZ018作用較為顯著,選擇5 g/L蛋白胨和35.0 g/L玉米漿作為氮源。
圖2 不同濃度的硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、玉米漿對(duì)SRZ018發(fā)酵影響Figure 2 Different concentrations of fructose,maltose,glucose and glycerinum have effect on SRZ018 fermentation
2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)SRZ018發(fā)酵影響
金屬離子對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和酶的活性具有重要的影響,在微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶的過(guò)程中也經(jīng)常會(huì)在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的金屬離子。一般在配培養(yǎng)基時(shí),鈉、鉀、鈣、鎂、硫和磷等元素常以其鹽類(lèi)的形式進(jìn)行添加,K+是許多酶的激活劑,能夠促進(jìn)糖代謝,適宜的K+濃度,既能夠保證菌體增殖,也能保證菌體酶活。鐵是過(guò)渡元素,存在于細(xì)胞色素、鐵氧還原蛋白和其他鐵硫蛋白、酶的輔助因子中,作為輔酶或活化劑參與許多酶反應(yīng),是大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的必要因素。磷是核酸、蛋白質(zhì)尤其是三隣酸腺苷(ATP)的必需構(gòu)成元素,參與多種代謝途徑的調(diào)節(jié)。鋅、鈷、錳、銅、鐵和鉑等元素大多作為酶的輔基和激活劑,需求量相對(duì)較小,往往一些有機(jī)氮源中含有,因而無(wú)需額外加入。依據(jù)前述結(jié)果,向含有玉米漿35 g/L、甘油13.60 g/L、MgSO41 g/L以及蛋白胨10 g/L的培養(yǎng)基中,加入不同濃度的磷酸氫二鉀等物質(zhì),結(jié)果(圖3)顯示K2HPO4濃度為0.8 g/L時(shí),發(fā)酵液酶活達(dá)到最大,此時(shí)發(fā)酵液濁度OD600約為10。K2HPO4濃度繼續(xù)升高為2 g/L時(shí),SRZ018的OD600達(dá)最大10.176,提高了13%。而當(dāng)K+濃度繼續(xù)上升,將抑制微生物的生長(zhǎng),因此,選擇培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀濃度為0.8 g/L。
圖3 不同濃度的磷酸氫二鉀、氯化鐵對(duì)菌株SRZ018發(fā)酵的影響Figure 3 Different concentration of K2HPO4and FeCL3effects on SRZ018 fermentation
Fe3+促進(jìn)微生物生長(zhǎng),當(dāng)Fe3+濃度為2.5 g/L時(shí),SRZ018的OD600達(dá)到最大值14.53,相比提高123%,比活0.38 U/mg,相比提高11.6%。與此相反Fe3+對(duì)發(fā)酵液中SHMT的合成影響不顯著,當(dāng)濃度超過(guò)2.5 g/L時(shí),抑制發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的合成。有研究表明大腸桿菌對(duì)Fe3+耐受濃度約為0.5 mmol/L[16],試驗(yàn)所得最適濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)該數(shù)值,推測(cè)可能Fe3+與培養(yǎng)基中其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)變化,生成沉淀。
2.2.1 不同濃度甘氨酸對(duì)產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率的影響
反應(yīng)溫度對(duì)底物甘氨酸的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響(圖4),發(fā)現(xiàn)隨著甘氨酸濃度的增大,最終反應(yīng)液中L-絲氨酸的濃度也不斷增大,甘氨酸為15 mmol/L時(shí),單位時(shí)間生成L-絲氨酸的量為6.02 g/L,此時(shí)轉(zhuǎn)化率為90.6%,甘氨酸的氨基與HCHO發(fā)生反應(yīng),生成席夫堿,理論上起降低反應(yīng)體系中HCHO濃度的作用,隨著甘氨酸濃度增加,甘氨酸抑制產(chǎn)物的合成,導(dǎo)致產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率下降[17-19]。
圖4 甘氨酸對(duì)轉(zhuǎn)化率及L-絲氨酸的產(chǎn)量影響Figure 4 The effect of glycine on conversion rate and the yield of L-serine
2.2.2 磷酸吡哆醛對(duì)產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率的影響
由磷酸吡哆醛對(duì)轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響結(jié)果(圖5),發(fā)現(xiàn)磷酸吡哆醛濃度由0.2 mmol/L增加到0.4 mmol/L時(shí),產(chǎn)酸量、轉(zhuǎn)化率均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),磷酸吡哆醛濃度為0.4 mmol/L時(shí),單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸量達(dá)到峰值7.94 g/L,相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高88.4%。磷酸吡哆醛濃度由0.4~1.0 mmol/L,單位時(shí)間內(nèi)L-絲氨酸產(chǎn)量依遞減,由6.73 g/L減至5.68 g/L。
圖5 磷酸吡哆醛對(duì)轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響Figure 5 The impact of different phosphopyridoxal concentration on conversion rate and the yield of L-serine
2.2.3 不同濃度四氫葉酸對(duì)產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率的影響
四氫葉酸對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響如圖6所示??芍臍淙~酸濃度為5 mmol/L時(shí),單位時(shí)間內(nèi)合成的L-絲氨酸量為2.57 g/L,四氫葉酸濃度增加至7 mmol/L,合成L-絲氨酸為8.24 g/L。四氫葉酸濃度7 mmol/L時(shí),產(chǎn)酸量、轉(zhuǎn)化率達(dá)到峰值,四氫葉酸濃度大于7 mmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)酸量均快速減小,如果體系中不添加四氫葉酸,同樣Gly、HCHO可以反應(yīng)生成L-絲氨酸,但前者反應(yīng)速度是后者的1 000倍。
圖6 四氫葉酸對(duì)轉(zhuǎn)化率及L-絲氨酸產(chǎn)量的影響Figure 6 The impact of THFA on conversion rate and the yield of L-serine
2.2.4 HCHO添加對(duì)產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率的影響
酶促轉(zhuǎn)化混合溶液中含甘氨酸15 mmol/L、磷酸吡哆醛0.4 mmol/L和THFA 7 mmol/L,通入一定量氮?dú)猓尤爰兹?0°C,150 rpm條件下,連續(xù)酶促轉(zhuǎn)化,由試驗(yàn)結(jié)果(圖7、圖8),可知酶促轉(zhuǎn)化1~4 h,HCHO與THFA快速反應(yīng)合成N5-N10亞甲基四氫葉酸,體系中HCHO被消耗,同時(shí),在SHMT作用下,N5-N10亞甲基四氫葉酸與甘氨酸生成L-絲氨酸,N5-N10亞甲基四氫葉酸上亞甲基轉(zhuǎn)移到甘氨酸結(jié)構(gòu)上生成新的THFA[20],生成的THFA也可與反應(yīng)體系中的HCHO反應(yīng),因此,根據(jù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系始終維持在7.5左右上下略微浮動(dòng),此處結(jié)果未提供);5~8 h時(shí),隨著反應(yīng)進(jìn)行,由于可逆反應(yīng)及產(chǎn)物逐漸積累產(chǎn)生抑制作用,L-絲氨酸合成速率逐漸下降,THFA更新速率逐漸下降,體系中THFA濃度減少,體系中HCHO有所剩余,剩余的HCHO與甘氨酸氨基反應(yīng),導(dǎo)致pH下降,酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)逐漸終止,體系中甘氨酸與L-絲氨酸濃度保持不變,此時(shí)轉(zhuǎn)化率最高為85.1%[20-21]。據(jù)此,推測(cè)需要改變HCHO供應(yīng)方式,嘗試HCHO滴加,如果酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)的體系pH有所下降,即HCHO有所剩余時(shí),減少HCHO供應(yīng);如果反應(yīng)體系pH超過(guò)初始pH時(shí),選擇增加HCHO供應(yīng)量,依據(jù)反應(yīng)信號(hào)阻止由HCHO逐漸累積引起的L-絲氨酸合成反應(yīng)條件的惡化。
圖7 未采取甲醛滴加時(shí)反應(yīng)體系中組分及轉(zhuǎn)化率變化Figure 7 The trend of composition and conversion rate when HCHO titration wasn′t used.
圖8 甲醛滴加時(shí)反應(yīng)體系中組成成分及底物轉(zhuǎn)化率變化Figure 8 The change of reaction system composition and conversion rate with HCHO titration
為此,開(kāi)展了驗(yàn)證甲醛滴加方法的敏感性實(shí)驗(yàn),將含有1 mol/L甘氨酸的溶液,向溶液中加入不同量的甲醛,由結(jié)果(圖9)發(fā)現(xiàn)初始pH為6.53時(shí),向溶液中滴加0.1 mL甲醛溶液,終pH為5.90,單位pH變化需要滴加17.2 mmol/L甲醛,溶液初始pH為7.05或7.5時(shí),調(diào)整溶液終pH為6.70和7.10時(shí),單位pH變化需要更多的甲醛(27 mmol/L、37 mmol/L)。
圖9 酶促轉(zhuǎn)化溶液中含甘氨酸量為1 mol/L時(shí)滴加甲醛Figure 9 Formol titration when 1 mol/L glycine contained in mixture
酶促轉(zhuǎn)化混合溶液中含有1 mol/L L-絲氨酸和0.75 mol/L甘氨酸,由結(jié)果(圖10),發(fā)現(xiàn)酶促轉(zhuǎn)化溶液初始pH基本一致的情況下,含L-絲氨酸的溶液下降單位pH需要更多(27.8 mmol/L)的甲醛,因此L-絲氨酸對(duì)甲醛滴加方式的敏感性不如甘氨酸。進(jìn)一步驗(yàn)證了酶促轉(zhuǎn)化溶液中溶液含有1 mol/L甘氨酸與5 mmol/LTHFA時(shí)對(duì)甲醛滴加是否敏感的試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)首次滴加甲醛至濃度為5 mmol/L,溶液初始pH保持不變,溶液初始pH為7.02與7.50時(shí),滴加甲醛止?jié)舛葹? mmol/L,pH同樣保持不變,再次滴加甲醛,溶液初始pH略微下降,因此,甲醛滴加是一種檢測(cè)反應(yīng)體系中甲醛含量的敏感的有效方式。
圖10 溶液中含1 mol/L L-絲氨酸和0.75 mol/L甘氨酸時(shí)滴加甲醛Figure 10 Formol titration when 1 mol/L L-serine and 0.75 mol/L glycine were contained
酶促轉(zhuǎn)化混合溶液中含甘氨酸15 mmol/L、磷酸吡哆醛0.4 mmol/L,THFA 7 mmol/L,通入一定量氮?dú)?,滴加HCHO,30°C,150 rpm條件下,連續(xù)酶促轉(zhuǎn)化,由試驗(yàn)結(jié)果(圖7、圖8)可以看出,酶促轉(zhuǎn)化時(shí)間反應(yīng)0~8 h,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系pH變化,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系pH在7.46~7.53之間浮動(dòng);pH>7.5時(shí),開(kāi)始滴加HCHO,滴加HCHO終濃度為10 mmol/L,隨著反應(yīng)進(jìn)行,酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中甘氨酸量逐漸降低,HCHO與THFA反應(yīng)合成N5-N10亞甲基四氫葉酸,體系中HCHO被消耗,在SHMT作用下,N5-N10亞甲基四氫葉酸與甘氨酸生成L-絲氨酸,L-絲氨酸量逐漸增加,底物甘氨酸轉(zhuǎn)化率逐漸增加,8 h時(shí),轉(zhuǎn)化率達(dá)到峰值95.6%。
通過(guò)對(duì)L-絲氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)葡萄糖為碳源構(gòu)成的培養(yǎng)基,SRZ018生物量顯著低于其它糖類(lèi)為主的培養(yǎng)基,葡萄糖抑制SRZ018的生長(zhǎng)和SHMT的表達(dá)。而甘油對(duì)SRZ018的發(fā)酵最有利,最佳添加量為8.0 g/L;蛋白胨、玉米漿對(duì)對(duì)SRZ018的發(fā)酵過(guò)程作用顯著。磷酸氫二鉀促進(jìn)SRZ018的發(fā)酵和產(chǎn)酶,最適添加濃度為0.8 g/L。
進(jìn)一步優(yōu)化生物酶法轉(zhuǎn)化合成L-絲氨酸條件,發(fā)現(xiàn)30℃時(shí),甘氨酸為15 mmol/L,磷酸吡哆醛為0.4 mmol/L,四氫葉酸為7 mmol/L時(shí),對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高,針對(duì)酶促轉(zhuǎn)化過(guò)程高濃度HCHO導(dǎo)致的反應(yīng)體系pH下降、抑制底物轉(zhuǎn)化的問(wèn)題,提出了滴加HCHO至終濃度為10 mmol/L的方法,維持反應(yīng)體系pH7.5,最終底物甘氨酸轉(zhuǎn)化率為95.6%,比未采取滴加甲醛時(shí)提高了10.5%。