惡性腫瘤嗜神經(jīng)浸潤的體內(nèi)外模型研究進(jìn)展

駱驚濤

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻喉腫瘤科國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300000

惡性腫瘤嗜神經(jīng)浸潤（PNI）指腫瘤細(xì)胞侵及神經(jīng)外膜、神經(jīng)周膜或神經(jīng)內(nèi)膜并出現(xiàn)局部侵襲和沿其延伸方向轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞存在于任何3 層神經(jīng)膜內(nèi)或包繞神經(jīng)外膜1/3 周長以上均可視為PNI［1］。PNI 常見于胰腺癌、頭頸部癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等，可以導(dǎo)致癱瘓、疼痛，并且與癌癥復(fù)發(fā)率增加和患者生存率降低有關(guān)，是導(dǎo)致預(yù)后不良的重要因素［2］。PNI 可在沒有淋巴或血管侵犯的情況下發(fā)生，并被認(rèn)為是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的初始步驟［3］。針對惡性腫瘤的PNI的治療可以防止腫瘤向脊髓的局部擴(kuò)展，保護(hù)神經(jīng)功能，減少神經(jīng)侵犯引起的疼痛，最終延長患者生存率［4］。近年研究發(fā)現(xiàn)，PNI 中存在多種分子和途徑，可通過神經(jīng)生長因子等因子的驅(qū)動(dòng)來影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而由于缺乏一致的、可重復(fù)性的研究方法，很難對PNI相關(guān)通路的機(jī)制進(jìn)行體外及體內(nèi)研究，建立合理的嗜神經(jīng)浸潤模型對PNI 相關(guān)機(jī)制的研究至關(guān)重要?；诖耍狙芯烤蚉NI 的體內(nèi)、體外模型作一綜述，以期為PNI提供更加精確合理的研究方法。

1 PNI的體外模型

1.1 腫瘤細(xì)胞與背根神經(jīng)節(jié)（DRG）體外共培養(yǎng)模型 DRG 是一種細(xì)胞體，參與糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展，DRG 感覺神經(jīng)元的胞體是研究軸突再生的模型之一［5-6］。HUYETT 等［7］建立了頭頸部鱗癌細(xì)胞Fadu與小鼠DRG 共培養(yǎng)模型，該模型對頭頸部鱗癌細(xì)胞的培養(yǎng)方法、小鼠DRG 的解剖、培養(yǎng)基的制備、如何將DRG 插入到半固態(tài)基質(zhì)液滴、如何放置頭頸部鱗癌細(xì)胞作了詳細(xì)介紹。該模型最重要的步驟是精確解剖和提取DRG，脊柱的適當(dāng)橫斷和中線—縱向分成兩個(gè)半棘是獲得大量DRG 的關(guān)鍵。在解剖單個(gè)DRG 時(shí)，切勿直接處理神經(jīng)節(jié)，而應(yīng)用顯微鏡鉗夾住周圍的筋膜。DRG 的擠壓損傷是軸突生長失敗的主要原因，過度處理DRG 可導(dǎo)致軸突難以生長。該模型的優(yōu)點(diǎn)是具有非常高的成功率和可重復(fù)性，總實(shí)驗(yàn)時(shí)間也相對較短，使用活細(xì)胞成像可以在時(shí)間推移視頻形式下觀察軸突生長過程和頭頸部鱗癌細(xì)胞侵襲。該模型在細(xì)胞接種前1 h 加入熒光細(xì)胞染色劑，可以自由穿過細(xì)胞膜，而在與細(xì)胞內(nèi)的巰基反應(yīng)后，染色仍留在細(xì)胞內(nèi)，并傳遞到子細(xì)胞。熒光染色可促進(jìn)檢測中的可視化，因?yàn)闊晒饽軌虼嬖?～3 d，與頭頸部鱗癌細(xì)胞Fadu 發(fā)生神經(jīng)浸潤的時(shí)間框架相同。同時(shí)，該模型在熒光染色時(shí)還允許使用多種不同的顏色，并且不需要?jiǎng)?chuàng)建熒光蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，熒光染色細(xì)胞的加入在腫瘤細(xì)胞和背景物質(zhì)之間產(chǎn)生了非常明顯的分化，更加易于觀察。但該模型也存在技術(shù)局限性：①由于該模型采用非常細(xì)小的神經(jīng)突起替代大量的神經(jīng)浸潤，因此目前尚不能明確軸突相對于神經(jīng)元在活體中的作用；②研究中缺乏體外腫瘤環(huán)境中固有的外源性因子；③由于成纖維細(xì)胞外流和基質(zhì)完整性的喪失，可以研究PNI的時(shí)間被限制在48 h內(nèi)。這些局限性的存在可能導(dǎo)致某些具有神經(jīng)侵襲功能但分裂或侵襲緩慢的細(xì)胞系被遺漏，并被推定為不具備PNI 的能力。該模型還介紹了一種量化PNI 結(jié)果的評分系統(tǒng)，將檢測圖像分為具有垂直線和水平線的四個(gè)象限，如果任一象限至少具有一串腫瘤細(xì)胞由基質(zhì)邊緣向GRG延伸而發(fā)生PNI則計(jì)1分，若發(fā)生PNI的腫瘤細(xì)胞從基質(zhì)邊緣延伸到DRG 的路徑超過50%則計(jì)2分，通過這種方式，可以分配0～8 分的分?jǐn)?shù)。該分析方法主要優(yōu)點(diǎn)為能夠快速分析出許多PNI細(xì)胞的分?jǐn)?shù)，缺點(diǎn)為不能充分表達(dá)PNI的程度（一個(gè)象限有1 個(gè)神經(jīng)突起，侵犯到DRG 的距離為100%，得到的分?jǐn)?shù)為2 分，與有10 個(gè)類似侵襲軸突的象限所得到的分?jǐn)?shù)相同）。該模型常用于體外研究神經(jīng)元與腫瘤細(xì)胞間旁分泌的相互作用，其可根據(jù)測試假設(shè)對微環(huán)境進(jìn)行修改，如在培養(yǎng)皿中加入第三種細(xì)胞培養(yǎng)物（例如非癌細(xì)胞）使研究人員能夠比較不同細(xì)胞的嗜神經(jīng)遷移能力；此外，研究人員還可以應(yīng)用不同的條件（溫度、濕度、可溶性因素等）并檢測其對細(xì)胞侵襲能力的影響。但由于該模型使用的是小鼠DRG，小鼠細(xì)胞可能與人類細(xì)胞不相容，所以當(dāng)使用人類腫瘤細(xì)胞時(shí)，并不是總會(huì)表現(xiàn)出鼠—人蛋白—蛋白的相互作用。因此，當(dāng)計(jì)劃對兩個(gè)不同的物種使用該模型時(shí)，應(yīng)測試所檢查蛋白質(zhì)的同源性，若同源性高，則該模型可適用于評估蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用。

1.2 腫瘤細(xì)胞與神經(jīng)外植體共培養(yǎng)模型 ABIATARI 等［8］在無菌條件下解剖大鼠迷走神經(jīng)頸部約5 mm 的部分，并距離室底0.7 mm 放置在專門設(shè)計(jì)的神經(jīng)侵犯室中；將培養(yǎng)箱放置在含有標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)板上，將胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞PDAC 胰蛋白酶化，再懸浮于培養(yǎng)基中，將細(xì)胞懸液灌入培養(yǎng)箱，以此方法獲得三種神經(jīng)浸潤侵襲性胰腺癌細(xì)胞；將神經(jīng)從侵入室取出，10% 甲醛固定并用石蠟包埋；免疫組織化學(xué)法檢測神經(jīng)中的腫瘤細(xì)胞侵入情況。需要注意的是，為了避免該模型出現(xiàn)“假克隆”，神經(jīng)室中的培養(yǎng)基水平要保持高于板中的培養(yǎng)基水平，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行控制，以排除培養(yǎng)基/細(xì)胞懸浮液從神經(jīng)室中泄漏的情況。

1.3 腫瘤細(xì)胞與施萬細(xì)胞共培養(yǎng)模型 施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其可能是促進(jìn)腫瘤生長和疼痛的炎癥介質(zhì)的主要來源［9］。研究顯示，腫瘤細(xì)胞可利用施萬細(xì)胞的典型功能促進(jìn)PNI［10］。SU 等［11］建立了腫瘤細(xì)胞與人施萬細(xì)胞之間的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。將5×105個(gè)人施萬細(xì)胞接種在六孔板的底部，同時(shí)將5×105個(gè)腫瘤細(xì)胞（人轉(zhuǎn)移胰腺腺癌細(xì)胞AsPC-1、人胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2）加入孔徑為0.4 μm 的上部Transwell 嵌件。將共培養(yǎng)系統(tǒng)與完整培養(yǎng)基分別保持24 h 或48 h 用于RNA提取或共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基收集。該模型模擬了腫瘤細(xì)胞與施萬細(xì)胞之間的相互作用，使研究者能夠觀察其生物學(xué)行為的變化，重現(xiàn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞神經(jīng)轉(zhuǎn)移的過程。但體內(nèi)微環(huán)境很難復(fù)制，該系統(tǒng)未能模擬體內(nèi)兩種細(xì)胞相互作用時(shí)的酸堿度、CO2濃度、營養(yǎng)等情況，有待于后期進(jìn)一步改善。

1.4 腫瘤細(xì)胞與PC-12 神經(jīng)元細(xì)胞/50B11 神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)模型 PC-12 是經(jīng)典的神經(jīng)元模型，而50B11 是永生的DRG 感覺神經(jīng)元細(xì)胞系，兩者均適用于模擬 PNI 的臨床觀察［12］。YIN 等［13］在 Matrigel中培養(yǎng)分化的PC-12/50B11 細(xì)胞，然后將熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞添加到培養(yǎng)基中，使腫瘤細(xì)胞廣泛分散，以增加與大量單個(gè)神經(jīng)突起相互作用的機(jī)會(huì)。同時(shí)，在空白基質(zhì)凝膠周圍種植熒光腫瘤細(xì)胞，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，獨(dú)立于與神經(jīng)細(xì)胞的外部相互作用。該模型可評估自主腫瘤細(xì)胞侵襲，通過定量測定局限于腫瘤—神經(jīng)細(xì)胞的含神經(jīng)突基質(zhì)凝膠中的熒光癌細(xì)胞來確定癌細(xì)胞的神經(jīng)侵襲能力。

2 PNI的體內(nèi)模型

2.1 小鼠原位胰腺腫瘤的神經(jīng)侵襲和轉(zhuǎn)移模型JURCAK 等［3］將小鼠剖腹，將懸浮于20 mL 磷酸鹽緩沖鹽水中的胰腺導(dǎo)管腺癌基因工程小鼠腫瘤細(xì)胞注入小鼠胰腺，注射后第10 天對胰腺腫瘤區(qū)進(jìn)行HE染色、蘇木精和神經(jīng)特異性標(biāo)記物TUJ1免疫組化染色，觀察并分析神經(jīng)密度及神經(jīng)數(shù)量。

2.2 將同基因胰腺癌細(xì)胞注射到坐骨神經(jīng)中進(jìn)行神經(jīng)侵襲的活體小鼠模型 ZHANG 等［14］將同基因胰腺癌細(xì)胞注射到小鼠坐骨神經(jīng)中建立了PNI的體內(nèi)模型，該模型使用異氟醚麻醉4周大小的裸鼠，暴露麻醉小鼠的坐骨神經(jīng)并注射胰腺癌細(xì)胞，使胰腺癌細(xì)胞從注射點(diǎn)向脊髓近端侵入神經(jīng)，然后評估小鼠肢體功能和坐骨神經(jīng)功能指數(shù)以評估PNI的嚴(yán)重程度。在該模型的制備過程中需要仔細(xì)處理3個(gè)關(guān)鍵步驟：①腫瘤細(xì)胞注射：注射腫瘤細(xì)胞時(shí)要非常小心，刺穿神經(jīng)的后壁會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞損失。一旦針頭就位，注射應(yīng)緩慢而穩(wěn)定地進(jìn)行5 s 以上，以防止液壓力將腫瘤細(xì)胞從注射點(diǎn)向前推進(jìn)得太遠(yuǎn)。注射后應(yīng)在神經(jīng)上留置針3 s，可減少回流和腫瘤細(xì)胞滲漏。②提取侵入的神經(jīng)：在坐骨神經(jīng)提取過程中，由于被侵犯的坐骨神經(jīng)非常脆弱，解剖時(shí)需非常輕柔，以防止被侵犯的神經(jīng)斷裂。③采集神經(jīng)的處理：神經(jīng)的整個(gè)長度必須完全平放在模具上。該模型同時(shí)也存在一定的局限性：①雖然在手術(shù)過程中對神經(jīng)的處理盡量輕柔，但仍不可避免神經(jīng)拉伸和擠壓可能會(huì)對神經(jīng)造成損害；②很難控制進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的確切數(shù)量；③該模型僅限于對已經(jīng)侵入神經(jīng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，而不能夠研究神經(jīng)與位于原發(fā)腫瘤中的腫瘤細(xì)胞相互作用，缺乏評估PNI 早期階段的能力；④與胃腸道神經(jīng)相比，使用坐骨神經(jīng)的主要缺點(diǎn)是坐骨神經(jīng)不是胰腺癌的轉(zhuǎn)移部位，神經(jīng)纖維的組成和性質(zhì)的不同可能影響神經(jīng)的侵襲，但是胰腺神經(jīng)很難獲得并且體積非常小，不允許這樣的研究。該模型具有較強(qiáng)的通用性，可以應(yīng)用于各種PNI 研究，可以使用具有不同基因修飾或不同類型腫瘤細(xì)胞的小鼠來研究PNI 的細(xì)胞和分子機(jī)制。HUANG 等［15］在此模型的基礎(chǔ)上利用氧化鐵納米顆粒和磁共振成像建立了一種敏感、無創(chuàng)的神經(jīng)侵犯監(jiān)測方法，該方法在一定程度上克服了現(xiàn)有的體內(nèi)PNI 評估方法的局限性，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。此外，通過對研究小鼠進(jìn)行治療，此模型可以研究治療藥物對神經(jīng)侵襲的影響。

2.3 雞胚絨毛膜尿囊膜（CAM）體內(nèi)模型 SCHMITD等［16］使用CAM 在體模型評價(jià)頭頸部腫瘤神經(jīng)周圍浸潤。該模型將大鼠DRG 和人頭頸部鱗狀癌細(xì)胞移植到雞胚絨毛上皮，用于評估腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)侵襲神經(jīng)組織的能力。該模型可以通過熒光標(biāo)記DRG 和腫瘤細(xì)胞，更加便于觀察，采用Image J6 圖像分析儀測量腫瘤細(xì)胞與DRG 的距離和腫瘤面積，并用t檢驗(yàn)評估各組之間的差異；使用石蠟包埋的CAM 組織切片，對其進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色評估結(jié)締組織內(nèi)的侵襲性。該模型的優(yōu)點(diǎn)是可以評估PNI 以及腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成，比坐骨神經(jīng)注射腫瘤細(xì)胞的小鼠模型更加經(jīng)濟(jì)。而該模型存在的局限性為：①在將腫瘤細(xì)胞移植到DRG 附近時(shí)的距離不好掌握，腫瘤細(xì)胞與DRG 之間的距離過近或過遠(yuǎn)可能會(huì)損害腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)之間的分子相互作用。②如果胚胎年齡大于該方案中的規(guī)定年齡，胚胎運(yùn)動(dòng)可能會(huì)取代腫瘤細(xì)胞，因此一定要使用與受精后第10 天一致的雞胚進(jìn)行細(xì)胞移植。③由于雞胚免疫系統(tǒng)在18 d 之前還沒有完全發(fā)育，因此，該模型不適用于評估免疫細(xì)胞在腫瘤發(fā)展中的作用。④可用于雞胚的試劑如抗體、細(xì)胞因子和引物比較有限。目前在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平上，小鼠異種移植模型是用于評估藥物行為的最常見模型，由于嚙齒動(dòng)物臨床前模型既昂貴又耗時(shí)，并引起倫理關(guān)注，使得雞絨毛尿囊膜試驗(yàn)成為常用動(dòng)物模型的有效替代方法，該模型也廣泛應(yīng)用于血管生成作用的研究［17-18］。

綜上所述，腫瘤細(xì)胞與DRG、神經(jīng)外植體、施萬細(xì)胞、PC-12 神經(jīng)元細(xì)胞/50B11 神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)模型等PNI體外模型以及小鼠原位胰腺腫瘤的神經(jīng)侵襲和轉(zhuǎn)移模型、將同基因胰腺癌細(xì)胞注射到坐骨神經(jīng)中進(jìn)行神經(jīng)侵襲的活體小鼠模型、CAM 體內(nèi)模型等PNI 體內(nèi)模型已被應(yīng)用于腫瘤學(xué)的研究中，在腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲及藥物治療等研究領(lǐng)域發(fā)揮作用。每個(gè)PNI 研究模型都有其不同的優(yōu)勢和劣勢，建立合理的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯M(jìn)一步研究惡性腫瘤PNI的機(jī)制及治療方案是十分必要的。