外泌體復(fù)合支架用于口腔組織工程的研究進(jìn)展

蔡超瑩 陳學(xué)鵬 胡濟(jì)安

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院正畸科，浙江大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，浙江省口腔生物醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310006；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院病理科，浙江大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，浙江省口腔生物醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310006

臨床常見的頜面部組織缺損包括骨缺損、關(guān)節(jié)損傷、牙體及牙周組織破壞等，這會嚴(yán)重影響患者的美觀與功能，甚至威脅機(jī)體健康?？谇唤M織工程的發(fā)展為頜面部軟硬組織修復(fù)提供了可能。組織工程的三大要素為支架、生長因子和干細(xì)胞[1]，其中干細(xì)胞復(fù)合支架被廣泛應(yīng)用于組織再生。但大量研究表明，干細(xì)胞存在提取、儲存、運(yùn)輸困難等問題[2]，同時細(xì)胞突變[3]、倫理問題[4]也限制了其臨床應(yīng)用。對此，有學(xué)者[5]提出將外泌體等細(xì)胞旁分泌產(chǎn)物與支架復(fù)合，提高組織再生的效率。

口腔內(nèi)不同組織再生機(jī)制存在差異，本文就外泌體復(fù)合支架在口腔頜面部組織再生中的研究作一綜述。

1 外泌體與支架

1.1 外泌體的獲取與生物學(xué)特性

外泌體是細(xì)胞分泌的包含mRNA、蛋白質(zhì)等生物活性分子的細(xì)胞外囊泡結(jié)構(gòu)[6]，其體積?。ㄖ睆綖?0～150 nm）、可用率高，產(chǎn)量及功能受細(xì)胞種類、培養(yǎng)、分離及儲存條件的影響。外泌體可由免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等分泌得到，并廣泛分布于血清、唾液、尿液等體液中[7]。干細(xì)胞是外泌體的主要來源，其中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)得到的外泌體產(chǎn)量最高[8]；免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞來源的外泌體分別在炎癥調(diào)節(jié)、腫瘤監(jiān)控上具備優(yōu)勢。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，雙室生物反應(yīng)器、3D培養(yǎng)基、適宜的細(xì)胞接種密度（60%～90%）、缺氧預(yù)處理、高或低含量葡萄糖均有利于外泌體的產(chǎn)生；熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激以及西他沙星等藥物處理也能提高產(chǎn)量；表皮生長因子則會降低產(chǎn)量[9-10]。可用于外泌體分離的方法包括超速離心、超濾、尺寸排阻色譜、聚合物沉淀、微流體分離和免疫捕獲等[11]。超速離心是使用最廣泛的分離方法[12]，但存在雜質(zhì)共分離、重現(xiàn)性低等問題；切向流技術(shù)可提高超濾過程中膜的使用率及外泌體產(chǎn)量[13]；微濾離心結(jié)合了超濾及超速離心技術(shù)，可獲得高純度、高產(chǎn)量的外泌體[14]。分離外泌體后，需對其進(jìn)行有效的體外儲存，溫度和時間均會影響外泌體的穩(wěn)定[15]，4℃適用于1周內(nèi)的短期儲存，-80℃則利于長期保存[16]。獲取外泌體的各個環(huán)節(jié)都需要嚴(yán)格把控，但建立標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞培養(yǎng)條件是獲得充足且穩(wěn)定的外泌體的重要前提[9]。

體內(nèi)研究[17]表明外泌體易通過毛細(xì)血管循環(huán)，將攜帶的生物信息準(zhǔn)確遞送至靶組織；同時，外泌體免疫原性低，不易引起人體的排斥反應(yīng)[18]。此外，已有大量的研究報道了外泌體在血管生成[19-20]、免疫調(diào)節(jié)[21]、成骨[22-23]、成牙[24]、神經(jīng)保護(hù)及再生[25]等方面的效能及特性。但外泌體在體內(nèi)移植時存在缺陷，巨噬細(xì)胞會清除經(jīng)靜脈注射進(jìn)入體液循環(huán)的外泌體，使到達(dá)靶組織的外泌體濃度低于有效治療濃度[26]，導(dǎo)致治療效果不佳；而在肝臟、肺等其他組織中的無效積累有可能造成機(jī)體負(fù)擔(dān)[27]，這些問題均限制了外泌體的臨床應(yīng)用。

1.2 支架的材料與結(jié)構(gòu)

支架作為組織工程學(xué)的另一重要元素，通過模擬細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性來實(shí)現(xiàn)受損組織的修復(fù)或再生。理想的支架需要具備幾大特性：良好的生物相容性、足夠的機(jī)械強(qiáng)度、適宜的表面活性以及合適的孔隙率[28]。

目前，可用于口腔組織工程的支架材料包括合成聚合物、天然聚合物和生物陶瓷等。最常用的合成聚合物包括聚己內(nèi)酯、聚丙交酯、聚乙醇酸等[28-29]。它們的優(yōu)勢在于物理化學(xué)性能可控[30]，調(diào)整分子量、結(jié)晶度或共混比例可改變其降解速率，多用于骨、軟骨、牙體和牙周組織再生。天然聚合物如蛋白多肽、多糖等因其結(jié)構(gòu)與天然的糖胺聚糖相似[31]，具有良好的生物相容性及潛在的生物活性，被廣泛用于關(guān)節(jié)軟骨的再生。磷酸鈣類的生物陶瓷材料與骨骼中的無機(jī)成分相似，機(jī)械性能良好，多用于骨和軟骨再生[32]。水凝膠代表一類具有親水性三維聚合物網(wǎng)絡(luò)的材料[33]，可由多糖等天然材料或聚乙二醇等合成聚合物通過化學(xué)交聯(lián)、光聚合、熱塑或冷凍等方法制得，具備良好的彈性、生物相容性、可調(diào)的降解性和機(jī)械性能，多用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)或生物遞送[34]。非共價交聯(lián)形成的水凝膠具有應(yīng)力松弛、剪切稀化等特性，便于注射，可用于軟骨、牙體和牙周再生[35]。將羥磷灰石或納米黏土加入水凝膠可增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度及抗降解性，適用于骨和軟骨再生[36-37]。

支架應(yīng)起到介導(dǎo)細(xì)胞和組織浸潤、支持血管和神經(jīng)生長的作用，因此需具備合適的孔徑、孔隙率等。有研究[38-39]表明：孔徑300～500 μm的多孔支架有利于成骨，40%～90%的孔隙率可促進(jìn)骨整合，孔隙互連能促進(jìn)細(xì)胞向內(nèi)均勻生長及分布[40]。此外，組織缺損通常累及多層解剖結(jié)構(gòu)，為了實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的組織再生，支架已從最初的單相支架衍生出雙相、三相支架，近年來多相梯度及連續(xù)梯度支架已成為支架設(shè)計(jì)的熱點(diǎn)[31]。單相支架由單一材料或一種復(fù)合材料組成，孔徑、孔隙率等特性較為單一[29]。雙相、三相支架結(jié)合了2～3種不同的材料、復(fù)合材料或架構(gòu)形成多層結(jié)構(gòu)，各層之間的孔徑、孔隙率及互連性不同[41]，已用于仿生分層組織如關(guān)節(jié)軟骨及牙周缺損。多相離散梯度和連續(xù)梯度表現(xiàn)為化學(xué)及結(jié)構(gòu)組成在整個構(gòu)架區(qū)域內(nèi)的廣泛梯度分布，包括排列、分散、尺寸、方向等[31]，更利于支架與宿主的整合。

1.3 外泌體與支架的復(fù)合

外泌體對組織工程的發(fā)展具有重要價值，但體內(nèi)環(huán)境的干擾限制了其臨床應(yīng)用。而針對不同材料和結(jié)構(gòu)的支架的特性研究已較為深入，可為外泌體的體內(nèi)遞送提供安全、穩(wěn)定的載體。因此，研究者將外泌體與支架復(fù)合，以實(shí)現(xiàn)外泌體的裝載、遞送及緩釋。目前已有文獻(xiàn)報道了多種復(fù)合技術(shù)，包括物理吸附[42-43]、化學(xué)交聯(lián)[44-45]、特異性結(jié)合[46-47]、凍干[48-49]、3D打印[50]等。直接吸附通常難以控制外泌體的突釋[42]，利用聚乙烯亞胺、聚多巴胺（poly dopamine，PDA）等對支架表面進(jìn)行化學(xué)改性可有效改善這一點(diǎn)[43,51]。化學(xué)交聯(lián)包括離子交聯(lián)、光交聯(lián)等方法，強(qiáng)化學(xué)鍵可實(shí)現(xiàn)外泌體與支架的長期穩(wěn)定結(jié)合，但易破壞外泌體膜及支架結(jié)構(gòu)[44]。利用錨定肽、生物特異性肽等介導(dǎo)外泌體與支架復(fù)合的方法不僅能保持外泌體的完整性，還實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定裝載[47]。凍干法能將外泌體固定在多孔支架中且不影響其形態(tài)和生物活性[48]，3D打印則使外泌體均勻分布于多孔支架內(nèi)。

緩釋能力是衡量復(fù)合技術(shù)可行性的重要指標(biāo)。有研究[43,51]發(fā)現(xiàn)：經(jīng)皮下注射的外泌體在1 d內(nèi)即被清除殆盡，直接吸附于支架的外泌體可在4 d內(nèi)釋放完全，而與表面改性的支架復(fù)合的外泌體在體內(nèi)釋放1周后仍可保留30%～50%。經(jīng)離子交聯(lián)裝載外泌體的藻酸鹽水凝膠在3 d內(nèi)釋放外泌體超過50%，之后緩慢釋放至完全[44]。生物特異性肽介導(dǎo)的外泌體復(fù)合支架在12 h內(nèi)快速釋放外泌體達(dá)30%，1周總釋放量為70%[47]。裝載外泌體的凍干支架在第1周表現(xiàn)出快速釋放，14和28 d的釋放量分別為71.4%和75.4%[48]。3D打印徑向支架在體外14 d時仍保留了超過56%的外泌體，體內(nèi)緩釋總時長超過1周[50]。以上研究表明：與支架復(fù)合的外泌體的釋放曲線呈初期快速大量釋放、后趨于平緩穩(wěn)定，體內(nèi)緩釋時長普遍超過1周，與直接注射的外泌體保留時長存在顯著差異?；诙鄻踊膹?fù)合技術(shù)及其良好的緩釋性能，外泌體復(fù)合支架具有可行性及臨床意義，有望提高組織再生效率。

2 外泌體復(fù)合支架與組織再生

2.1 外泌體復(fù)合支架用于頜骨再生

頜面部骨缺損的傳統(tǒng)修復(fù)方法包括自體或異體骨移植、牽張成骨等，在臨床中能達(dá)到一定的修復(fù)效果，但存在免疫排斥、美觀不足等缺陷。骨組織工程的發(fā)展有望解決以上問題，實(shí)現(xiàn)骨的“重生”。血管生成和成骨是骨再生的關(guān)鍵[52]。在骨缺損區(qū)，骨組織呈現(xiàn)高度血管化，大量血管分布在成骨細(xì)胞周圍，促進(jìn)骨基質(zhì)的合成與礦化，因此骨的重塑側(cè)重于誘導(dǎo)血管形成。

多項(xiàng)體外研究[42-43,53]結(jié)果表明：生物陶瓷、聚合物等材料與外泌體的復(fù)合可以促進(jìn)干細(xì)胞的增殖遷移、成骨分化，誘導(dǎo)骨的礦化及血管形成。當(dāng)前外泌體用于顱頜面骨再生的體內(nèi)研究模型主要為顱骨、牙槽骨缺損模型等[54]。一些學(xué)者[42,55]分別在顱骨缺損及牙槽骨缺損大鼠模型中研究了外泌體/β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）復(fù)合支架的骨再生效能，結(jié)果顯示復(fù)合支架增強(qiáng)了成骨及血管形成。Chen等[56]將外泌體與水凝膠置入顱骨缺損區(qū)原位交聯(lián)，其新骨形成范圍顯著大于純水凝膠組。PDA涂層可有效改善聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]的緩釋性能[57]，Li等[43]將外泌體吸附于PLGA/PDA支架并植入小鼠顱骨缺損區(qū)，PLGA/PDA-外泌體組較對照組形成了更多新骨。Swanson等[58]設(shè)計(jì)了聚乳酸羥基乙酸-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-聚乳酸羥基乙酸共聚物包裹外泌體形成微球，將聚合物微球吸附于3D聚L-乳酸多孔納米支架并植入顱骨缺損模型，觀察到缺損區(qū)生成了含骨髓的骨組織并在8周時與宿主整合，實(shí)驗(yàn)中未表現(xiàn)出任何炎癥反應(yīng)，提示支架及其降解產(chǎn)物的生物相容性良好。Liu等[48]開發(fā)了分層介孔生物活性玻璃支架對外泌體進(jìn)行凍干遞送，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明骨形成顯著增加，成骨相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)增強(qiáng)。

在多種復(fù)合技術(shù)的依托下，多相支架能以微球或微孔的形式有效保留和緩釋外泌體，但材料間相互作用可能衍生的新特性仍需進(jìn)一步探索。此外，當(dāng)前用于外泌體復(fù)合支架骨再生研究的體內(nèi)模型大多為小型哺乳動物的顱骨缺損模型，有必要建立兔、犬等大型動物頜骨缺損模型進(jìn)行臨床前研究。

2.2 外泌體復(fù)合支架用于顳下頜關(guān)節(jié)軟骨再生

頜面部的主要軟骨組織位于顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)，當(dāng)顳下頜關(guān)節(jié)病變持續(xù)進(jìn)展，關(guān)節(jié)軟骨及其下方骨質(zhì)會發(fā)生不同程度的破壞。針對骨關(guān)節(jié)炎造成的軟骨破壞，臨床早期主要通過物理、藥物或穩(wěn)定咬合板等方式進(jìn)行保守治療，嚴(yán)重者酌情介入治療，包括關(guān)節(jié)腔封閉、灌洗、微斷裂手術(shù)等[59]。軟骨再生是骨關(guān)節(jié)病治療的終極目標(biāo)，不同于骨組織再生，軟骨組織中無血管分布、自我修復(fù)能力弱，因此軟骨細(xì)胞與基質(zhì)是其再生的基礎(chǔ)。

目前，外泌體用于關(guān)節(jié)軟骨再生的方式包括靜脈或關(guān)節(jié)腔直接注射、結(jié)合支架注射等[60]，在支架材料中，水凝膠以其獨(dú)特的物理化學(xué)性能得到了研究者的高度關(guān)注。外泌體復(fù)合支架用于顳下頜關(guān)節(jié)軟骨再生的體內(nèi)研究尚少，而膝關(guān)節(jié)與顳下頜關(guān)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)及神經(jīng)分布高度相似[61]，因此基于膝關(guān)節(jié)的研究具有重要的參考價值。Liu等[45]通過光誘導(dǎo)亞胺交聯(lián)將外泌體與水凝膠結(jié)合形成脫細(xì)胞組織補(bǔ)片用以修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示：脫細(xì)胞組織補(bǔ)片可誘導(dǎo)并促進(jìn)軟骨再生，且與天然軟骨無縫整合。目前，臨床上的軟骨修復(fù)技術(shù)以誘導(dǎo)纖維軟骨生成為主，存在楊氏模量低、耐久性差等缺點(diǎn)[62]。Jiang等[37]利用脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)吸附外泌體，得到了楊氏模量更高、膠原更豐富的再生軟骨。Chen等[50]應(yīng)用光固化成形（stereo lithography apparatus，SLA）技術(shù)制造了具有徑向通道的脫細(xì)胞軟骨外基質(zhì)/甲基丙烯酸化水凝膠/外泌體3D復(fù)合支架，顯著促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的遷移并修復(fù)了軟骨線粒體的功能障礙，增強(qiáng)了軟骨再生。

關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)由表及里依次為關(guān)節(jié)軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨，已有大量研究利用干細(xì)胞與多相支架復(fù)合實(shí)現(xiàn)骨軟骨區(qū)的分層再生，未來有望通過外泌體復(fù)合多相梯度支架實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)仿生。此外，當(dāng)前有關(guān)外泌體復(fù)合支架用于軟骨再生的體內(nèi)研究多集中于膝關(guān)節(jié)炎[63]。顳下頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，有必要進(jìn)行基于該區(qū)域缺損模型的體內(nèi)研究，以探索顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)軟骨再生的理想條件。

2.3 外泌體復(fù)合支架用于牙髓再生

牙體組織再生的關(guān)鍵是牙髓樣組織的再生，包括細(xì)胞的增殖遷移、細(xì)胞分化、血管形成及神經(jīng)再生[64]。臨床處理牙髓壞死的方法是將壞死的牙髓摘除后，利用生物材料進(jìn)行嚴(yán)密的根管充填，但存在根管消毒不徹底、牙體組織破壞性大等風(fēng)險[65]，且去除牙髓會使患者無法感知齲的進(jìn)展。因此，保留牙髓對患者感知創(chuàng)傷及牙本質(zhì)的修復(fù)具有重要價值。目前，臨床已通過血運(yùn)重建來實(shí)現(xiàn)牙髓“再生”，但這僅適用于根尖發(fā)育不全的年輕恒牙發(fā)生牙髓壞死的情況，其根本在于誘導(dǎo)形成骨樣、牙骨質(zhì)樣及牙周膜樣組織，無法實(shí)現(xiàn)功能性的牙髓再生[66]。

有效的再生依賴于徹底的根管消毒及細(xì)胞歸巢等內(nèi)源因素，臨床效果難以預(yù)測，但組織工程的發(fā)展為牙髓再生提供了新思路。研究者[67]針對外泌體復(fù)合纖維蛋白凝膠對牙髓干細(xì)胞的募集及增殖能力進(jìn)行體外研究，結(jié)果顯示：外泌體和纖維蛋白均增強(qiáng)了干細(xì)胞的募集，且具有累加效果[68]；外泌體顯著增強(qiáng)細(xì)胞增殖。Huang等[69]利用精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸類多肽介導(dǎo)外泌體與Ⅰ型膠原膜復(fù)合填充于根管切片并植入大鼠體內(nèi)，觀察到牙髓樣組織特別是血管的形成。Zhang等[70]的研究表明：外泌體與纖維蛋白凝膠共注射交聯(lián)可促進(jìn)血管化，包括加速膠原蛋白基質(zhì)沉積、細(xì)胞凋亡和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）釋 放。兩 親 性 三 嵌 段PLGA-PEG-PLGA共聚物作為一種三相支架用于裝載外泌體，體內(nèi)研究證實(shí)緩釋的外泌體可在病損區(qū)域持續(xù)促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成[71]。

復(fù)雜與封閉的牙髓環(huán)境導(dǎo)致再生牙髓存在很大挑戰(zhàn)，利用支架精準(zhǔn)遞送外泌體進(jìn)入髓腔并控制緩釋是治療的關(guān)鍵[72]，可注射支架材料及多相結(jié)構(gòu)有望實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。

2.4 外泌體復(fù)合支架用于牙周再生

對于牙周病、根尖周炎或囊腫造成的牙周組織缺損，臨床常通過引導(dǎo)組織再生術(shù)（guided tissue regeneration，GTR）、自體骨移植和異體骨充填進(jìn)行修復(fù)[73]。研究[74]表明：牙釉質(zhì)基質(zhì)衍生物誘導(dǎo)和促進(jìn)垂直型骨吸收患牙牙周再生的效果良好；自體或異體骨移植可為大范圍的骨吸收患牙提供空間支撐，實(shí)現(xiàn)血凝塊的穩(wěn)定[75]。這些方法豐富了傳統(tǒng)的牙周治療手段，但仍存在適用范圍窄、技術(shù)敏感性高[76]、組織繼發(fā)缺損[77]及免疫排斥等問題，治療效果不明確。

隨著外泌體的優(yōu)勢被逐步發(fā)掘，研究者[78]利用膠原蛋白海綿吸附外泌體植入牙周缺損區(qū)，促進(jìn)了牙槽骨及牙周膜的再生，但表現(xiàn)為上皮沿根面向下生長。Liu等[79]將5%明膠和10%合成鋰皂石共混得到適合牙周臨床應(yīng)用的水凝膠，實(shí)驗(yàn)表明：經(jīng)改建的水凝膠與外泌體交聯(lián)，在牙周炎大鼠模型中抑制了炎癥的進(jìn)展、牙槽骨的吸收及膠原纖維的破壞，上皮沿根面生長情況有所改善。Shen等[80]將殼聚糖水凝膠與外泌體共注射入牙周炎小鼠實(shí)現(xiàn)原位交聯(lián)，減輕了小鼠因牙周炎誘發(fā)的上皮病變及牙槽骨喪失，并揭示了其抑制炎癥的機(jī)制，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由促炎表型轉(zhuǎn)化為抗炎表型。

牙周組織再生對牙周、正畸、種植等臨床工作的意義重大，但目前利用外泌體復(fù)合支架進(jìn)行牙周再生的體內(nèi)外研究尚少。長上皮結(jié)合是目前臨床牙周愈合的主要形式，隨著牙周組織工程理念的不斷更新，現(xiàn)已研發(fā)出與牙周復(fù)合體包括牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)相對應(yīng)的三相支架，用以精準(zhǔn)恢復(fù)缺損的分層組織，但仍需要大量研究證實(shí)其臨床可行性。

3 小結(jié)

自口腔組織工程引入無細(xì)胞療法后，外泌體的高效利用一直是臨床應(yīng)用的難點(diǎn)，利用支架進(jìn)行裝載、遞送及緩釋具有可行性。外泌體與支架在口腔組織再生中協(xié)同作用，展現(xiàn)出優(yōu)異的生物及物理化學(xué)性能。在骨、軟骨再生方面，外泌體復(fù)合支架有效提高了再生效能并提供結(jié)構(gòu)支撐，多相支架及3D打印技術(shù)推動組織工程實(shí)現(xiàn)了高度仿生。牙體、牙周組織因其環(huán)境的復(fù)雜性，相關(guān)研究較少，安全的支架材料及高效的復(fù)合技術(shù)將是未來研究的重要方向。此外，各材料與外泌體間的相互作用可能獲得的新特性仍需進(jìn)一步探索。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。