線粒體鈉鈣交換蛋白在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用研究進(jìn)展

張曉靜，李曉燕，成其發(fā)，?；荻Y，陸婉霞，歐幸彤

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東清遠(yuǎn) 511500；2 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

心血管疾?。–VDs）已為我國居民的首位死因，《中國心血管健康與疾病報告2020 概要》顯示我國CVDs患病人數(shù)約3.30億［1］。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變對調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞代謝、促進(jìn)CVDs 發(fā)展具有重要作用［2］。線粒體Ca2+（mCa2+）穩(wěn)態(tài)由低親和力的Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MCU）介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和線粒體鈉鈣交換蛋白（NCLX）介導(dǎo)的Ca2+外排組成，Ca2+內(nèi)流和外排之間的平衡受損會導(dǎo)致mCa2+紊亂，進(jìn)而引起疾病發(fā)生。因此，作為mCa2+的流出通道，NCLX 在調(diào)控mCa2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［3］。NCLX由位于染色體12q24.13 區(qū)域的人類SLC8B1 基因編碼，含584 個氨基酸，其結(jié)構(gòu)包含13 個螺旋跨膜片段、7 個細(xì)胞內(nèi)外拓?fù)洚悩?gòu)結(jié)構(gòu)閾［4］。NCLX 在心肌組織中含量較高，主要表達(dá)于心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、混合免疫細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，NCLX 蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜、線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中均有分布［5-6］。在特定環(huán)境下，NCLX 的電流具有雙向性：①正向型，即mCa2+外排，這種功能對于舒張期Ca2+及時排出細(xì)胞、恢復(fù)靜息電位非常重要；②反向型，即mCa2+內(nèi)流，一些病理狀態(tài)如缺血再灌注可導(dǎo)致反向NCLX 激活，促進(jìn)線粒體對Ca2+的攝取，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載［7］。NCLX 不具有Ca2+調(diào)節(jié)位點，NCXL的陽離子選擇性和抑制敏感性明顯不同于其余質(zhì)膜鈣鈉交換體（NCX）家族成員［8］。本研究對NCLX 在CVDs 中的作用作一綜述，為開發(fā)針對NCLX 調(diào)控mCa2+穩(wěn)態(tài)的治療策略奠定基礎(chǔ)。

1 NCLX在心肌缺血再灌注（MIRI）中的作用

MIRI 發(fā)生過程中線粒體會產(chǎn)生大量活性氧自由基（ROS），啟動氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體損傷及細(xì)胞死亡，還會引起細(xì)胞內(nèi)mCa2+超載，促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，引起潛在的心室纖維性顫動等致死性心律失常和心力衰竭（HF）［9］。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)扎左冠狀動脈24 h的再灌注動物模型中，心臟組織NCLX 過表達(dá)可降低ROS 水平，并在左冠狀動脈永久閉塞4 周后表達(dá)趨于平穩(wěn)，有助于改善心肌細(xì)胞凋亡、纖維化和收縮功能障礙等［10］。研究還發(fā)現(xiàn)，抗凋亡基因Bcl-2 可通過影響NCLX 來調(diào)節(jié)mCa2+水平，以實現(xiàn)對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。ZHU等［11］研究表明，過表達(dá)Bcl-2的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中NCLX 活性降低，mPTP 開放被抑制，同時伴隨基質(zhì)Ca2+水平、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）形成和丙酮酸氧化增強(qiáng)。

CRUZ 等［12］研 究 發(fā) 現(xiàn)，敲 除 調(diào) 控mCa2+轉(zhuǎn) 運(yùn) 的HeLa 細(xì)胞線粒體內(nèi)膜基因SLP-2 會導(dǎo)致NCLX 活性增強(qiáng)，mCa2+排出速率增加，加入NCLX 抑制劑CGP-37157 后這種作用消失；同樣，升高SLP-2 表達(dá)則會抑制NCLX 活性。因此，通過調(diào)控與NCLX 相關(guān)的基因或蛋白表達(dá)可影響MIRI的發(fā)展過程，并對心肌細(xì)胞產(chǎn)生良好的保護(hù)效益。研究發(fā)現(xiàn)，在離體兔心臟梗死實驗中，缺血前或再灌注后分別給予心肌細(xì)胞膜上的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NCX 抑制劑KB-R7943，同樣可減少梗死面積，證明NCX 也是造成心肌梗死的原因之一［13］。

2 NCLX在肥厚型心肌?。℉CM）中的作用

HCM 是一種以左心室肥厚為突出特征的原發(fā)性心肌病，是最常見的遺傳性CVDs，也是導(dǎo)致CVDs患者發(fā)生HF 和猝死的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，心臟能量學(xué)和線粒體功能改變是HCM 患者常見的致病機(jī)制［14］。心臟不斷地向全身泵送血液，是由ATP 水解所驅(qū)動的，在健康成人心臟中，ATP合成主要依賴于線粒體氧化磷酸（OXPHOS）。Ca2+可以激活OX?PHOS 中的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDHC）、異檸檬酸脫氫酶和2-氧戊二酸脫氫酶（OGDH），導(dǎo)致NADH在電子傳遞鏈中發(fā)生氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而通過F1Fo ATP 合酶合成ATP。因此，作為決定mCa2+水平的NCLX在心臟能量學(xué)中具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，NCLX 抑制劑CGP-37157 可抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的mCa2+積累，并升高NADH 水平［15］。細(xì)胞質(zhì)Na+含量增加也是HF 的生理學(xué)特征。研究發(fā)現(xiàn)，在β 腎上腺素能受體刺激主動脈收縮建立的豚鼠HF模型中，Na+指示探針SBFI 的激發(fā)光比率檢測到細(xì)胞質(zhì)Na+濃度為15 mmol/L，顯著高于對照組的5 mmol/L，同時會導(dǎo)致mCa2+和NADH 水平增加；而加入NCLX 抑制劑CGP-37157 后，這些變化恢復(fù)到正常水平［15］。因此，NCLX 在HF 的病理過程中發(fā)揮重要作用，阻斷NCLX 可能是一種治療HF 的新策略［16］。

有研究通過Langendorff 灌注小鼠心臟，并采用23Na、31P、13C-NMR 和1H-NMR 等代謝組學(xué)分析，研究慢性和急性心肌Na+負(fù)荷對其能量學(xué)的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制Na+-K+ATP 酶及慢性或急性超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟肥大均可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)Na+增加，并將氧化底物偏好從脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓衔?，這是衰竭心臟中經(jīng)常觀察到的特征［17］。Na+升高通過影響依賴于Ca2+的三羧酸循環(huán)（TCA）脫氫酶活性，導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝改變，如降低TCA 中間體代謝物水平等。使用NCLX 抑制劑CGP-37157 可將氧化底物偏好從碳水化合物轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅?，并引起消耗的代謝物水平正?；?，表明CGP-37157 在代謝重編程方面具有治療潛力［17］。相反，在心臟特異性過表達(dá)NCLX 的小鼠中，并沒有發(fā)現(xiàn)NCLX 對心臟能量學(xué)的不利影響［10］。

3 NCLX在糖尿病性心血管疾病中的作用

氧化應(yīng)激是高糖引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一。mCa2+是線粒體功能調(diào)控的關(guān)鍵因子，通過OXPHOS 產(chǎn)生ATP，與呼吸鏈電子傳遞和調(diào)控早期凋亡信號等密切相關(guān)。高糖誘導(dǎo)刺激可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS 產(chǎn)生和激活NLRP3 炎癥小體，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，而過表達(dá)NCLX 對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。研究證明，在早期糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中，NCLX 表達(dá)升高有助于維持線粒體功能和穩(wěn)定性［18］。研究還發(fā)現(xiàn)，抑制NCLX 表達(dá)可以增加mCa2+流入，阻止細(xì)胞去極化導(dǎo)致的葡萄糖依賴性胰島素分泌延遲［19］。

4 NCLX在HF中的作用

HF是由各種原因所引起的心肌受損，導(dǎo)致心臟收縮與舒張功能發(fā)生障礙，心排出量不足以維持機(jī)體代謝需要的一種病理狀態(tài)。研究顯示，細(xì)胞能量代謝改變會伴隨線粒體形態(tài)及功能受損，影響線粒體功能，造成細(xì)胞凋亡，從而誘發(fā)HF，HF 又可進(jìn)一步導(dǎo)致mCa2+超載并導(dǎo)致病情加重［20-21］。mCa2+通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)而維持心肌細(xì)胞功能的高效性，抑制mCa2+超載可有效減輕HF［22-24］。研究顯示，在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠HF 模型中，HF 大鼠NCLX 水平顯著低于對照大鼠［25］。mCa2+超載介導(dǎo)的mPTP 開放和ROS 水平增加均與HF 密切相關(guān)。在他莫昔芬誘導(dǎo)的成年小鼠HF 模型中，敲除心臟中的NCLX 基因會引起小鼠猝死（只有不到13%的小鼠在14 d 后存活），其死亡原因可能與mPTP 開放和過量ROS 產(chǎn)生，引起心肌重構(gòu)和心肌纖維化，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌功能障礙和暴發(fā)性HF 有關(guān)［22］。NCLX 過表達(dá)可增加心肌細(xì)胞對mCa2+的清除，但并不會影響mCa2+的攝取，同時可抑制mCa2+超載介導(dǎo)的mPTP 開放，從而預(yù)防或減輕缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死和HF［10］。

但也有研究發(fā)現(xiàn)，理論上負(fù)荷增加會導(dǎo)致mCa2+增加減少、NADH 不足、OXPHOS 和ATP 產(chǎn)生減少，導(dǎo)致心肌細(xì)胞抗氧化能力降低；在衰竭的心室肌細(xì)胞中，升高的細(xì)胞質(zhì)Na+通過NCLX 從線粒體釋放Ca2+，引起ROS 水平顯著升高，這可能是衰竭心肌細(xì)胞NAD（P）H 水平降低導(dǎo)致ROS 清除能力降低的原因之一，而加入CGP-37157 則可完全抑制ROS 的產(chǎn)生［26］。此外，在動物中長期給予CGP-37157 可改善肥大性重塑、間質(zhì)纖維化、收縮功能障礙和心律失常等，有效防止動物發(fā)生HF［16］。HF 是MIRI 的一種危險并發(fā)癥，心肌肥大以及左心室肥厚對HF 的發(fā)展起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，肥大的心肌組織功能障礙可能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+循環(huán)紊亂有關(guān)。洋地黃類因子激活NCLX 可能在HF 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。KAMIMURA 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，在洋地黃類因子誘導(dǎo)的Sprague-Dawley 大鼠HF 模型中，給予NCLX 抑制劑SEA0400 可抑制大鼠心臟成纖維細(xì)胞中H-脯氨酸的生成，減輕HF 大鼠左心室纖維化，從而提高大鼠的存活率。以上研究說明，NCLX 介導(dǎo)mCa2+外流對于維護(hù)心肌細(xì)胞內(nèi)mCa2+穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，是心肌細(xì)胞生存的基礎(chǔ)，增加mCa2+外流可能是一種治療HF 的新策略［10］。

5 NCLX在心律失常中的作用

心臟節(jié)律性是在心肌內(nèi)以重復(fù)和穩(wěn)定的方式發(fā)生的自發(fā)去極化和復(fù)極化事件，心功能不全或HF患者節(jié)律性通常異?；騿适?。心律失常多伴隨心肌傳導(dǎo)性和興奮性改變，是CVDs 患者的常見表現(xiàn)，而線粒體在心律失常的發(fā)生過程中具有重要作用，特別是線粒體能量代謝和氧化應(yīng)激被認(rèn)為是心律失常的常見原因［28］。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心房肌細(xì)胞HL-1中，敲低NCLX 表達(dá)可以顯著減緩細(xì)胞動作電位和Ca2+濃度瞬變的提高，并延長心動周期長度，但NCLX敲低并沒有改變Indo-1最大熒光比值（反映細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平）［29］?？Х纫蚩梢酝ㄟ^結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)（SR）的雷諾丁受體（RyR），或結(jié)合三磷酸肌醇，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2＋穩(wěn)態(tài)。有研究使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）蛋白Cameleon D1ER 進(jìn)行實驗，結(jié)果顯示敲低NCLX 可降低咖啡因引起的SR Ca2+含量，并延緩SR Ca2+再攝取率；進(jìn)一步分析表明，HL-1 細(xì)胞的自動性是由“Ca2+時鐘”驅(qū)動，其中來自SR 的Ca2+泄漏，增強(qiáng)了內(nèi)向電流，引起肌膜Na+-Ca2+交換并促進(jìn)膜去極化；NCLX 敲低降低了mCa2+到SR 的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減緩了SR Ca2+泄漏，抑制通過肌膜Na+-Ca2+交換增加的內(nèi)向電流，從而延遲電壓依賴性Na+和Ca2+電流激活，導(dǎo)致循環(huán)長度延長［29］。以上研究證明，NCLX 可能與心房撲動和心房異位、心動過速等心房異常自律性有關(guān)。

此外，NCLX 功能異常還可能與室性心律失常有關(guān)。NCLX 敲低可引起由線粒體釋放到細(xì)胞內(nèi)的Ca2+減少，導(dǎo)致SR Ca2+釋放和攝取降低，引起鈣瞬變延遲和自發(fā)動作電位周期延長。在小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的心室肌細(xì)胞及人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的心室肌細(xì)胞中，NCLX 活性異常參與了節(jié)律性改變［30］。此外，在他莫昔芬誘導(dǎo)的心臟特異性條件性NCLX敲除小鼠中，同樣發(fā)生了QRS 間期延長的心律失常［10］。而NCLX 是否參與正常起搏細(xì)胞即竇房結(jié)（SA node）細(xì)胞的自律性目前仍不明確。研究發(fā)現(xiàn)，NCLX 抑制劑CGP-37157 可減慢兔和小鼠SA node細(xì)胞的放電速率；但是該研究對小鼠SA node 成像結(jié)果顯示，有些SA node 單元只產(chǎn)生了肌漿網(wǎng)Ca2+釋放（LCR），并沒有產(chǎn)生動作電位誘導(dǎo)的Ca2+瞬變，有些只產(chǎn)生動作電位誘導(dǎo)的Ca2+瞬變，并沒有產(chǎn)生LCR，還有一些在舒張期產(chǎn)生LCR，然后發(fā)生動作電位誘導(dǎo)Ca2+瞬變［31］。在他莫昔芬誘導(dǎo)成年小鼠3 天后，小鼠心臟組織中的NCLX 蛋白表達(dá)降低了70%，沒有顯示竇性節(jié)律改變［10］。

HAMILTON 等［32］研究證明，在大鼠心室肌細(xì)胞中NCLX 參與了ROS 產(chǎn)生、SR Ca2+處理和心律失常的發(fā)生，NCLX 抑制劑CGP-37157 可增強(qiáng)在異丙腎上腺素存在下由2 Hz 電流刺激觸發(fā)的mCa2+蓄積，導(dǎo)致四甲基羅丹明甲酯（TMRM）熒光值增大，即線粒體膜電位去極化更明顯。氧化還原傳感器發(fā)現(xiàn)線粒體-SR 微區(qū)中ROS 和RyR 氧化增加，這種級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步加劇了由胸主動脈束帶引起的肥大心臟中促心律失常的觸發(fā)活動。25%的缺血性心律失常和75%的再灌注心律失常是由非折返機(jī)制［如延遲后除極（DAD）］引起的，當(dāng)SR Ca2+釋放發(fā)生在正常的興奮—收縮耦聯(lián)周期之外時，SR 釋放Ca2+期間的內(nèi)向電流（Ca2+流出）會導(dǎo)致延遲后去極化，引起心律失常。

綜上所述，NCLX 可調(diào)節(jié)mCa2+外流，影響mCa2+穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致線粒體功能和ROS 含量改變，在MIRI、HF及心律失常等CVDs 中均發(fā)揮重要作用。NCLX 可直接調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)和線粒體中Na+、Ca2+濃度及膜電位，并可能通過不同調(diào)控途徑平衡與ROS 的關(guān)系。因此，不同實驗條件或疾病狀態(tài)下的離子條件和線粒體活力差異會導(dǎo)致NCLX 的作用不同?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，NCLX 在HF 中的作用不同，可能就是不同條件下的調(diào)控機(jī)制不同導(dǎo)致的，未來需進(jìn)一步檢測NCLX 過表達(dá)對HF 心臟mCa2+水平、細(xì)胞質(zhì)Na+水平和代謝組譜的影響，確定是否存在代償機(jī)制減少mCa2+內(nèi)流。同時，NCLX 是否參與SA node 細(xì)胞的自律性仍不明確，應(yīng)進(jìn)一步研究NCLX 敲除小鼠SA node 的體內(nèi)成像，闡明NCLX 在起搏活動中的定量作用。