兔出血癥病毒2型檢測技術的研究進展

肖 璐，鄔旭龍，王 印，江地科，張鵬飛，楊 蓉

（1.四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066；2.成都農業(yè)科技職業(yè)學院畜牧獸醫(yī)學院，寵物營養(yǎng)與健康研究中心，四川 成都 611130；3.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 成都 611130；4.四川省夾江縣動物疫病預防控制中心，四川 夾江 614100）

兔出血癥（RHD）又稱“兔瘟”，是由嵌杯病毒科（Caliciviridae）兔病毒屬（Lagovirus）的兔出血癥病毒（RHDV）感染后，引起家兔的一種急性、高傳染性、高致死性疫病［1］。RHDV 經(jīng)典毒株于1984年在我國江蘇首次報道［2］，2010年法國首次報道RHDV 的新型變異毒株［3］，將其命名為RHDV2，此后，多個國家相繼報道了RHDV2的傳播與流行。RHDV2與經(jīng)典毒株的不同之處在于：自然條件下RHDV2 能感染不同年齡階段的兔群，包括乳兔、幼兔及成年兔；感染范圍更廣，能感染家兔和野兔；此外，RHDV2 的致死率較經(jīng)典株稍低［4］，但其發(fā)病速度更快。

2020 年4 月，我國首次報道四川某兔場確診一起RHDV2 病例［5］，為我國養(yǎng)兔業(yè)敲響了警鐘。由于目前尚無有效的RHDV2 疫苗和治療措施，為了阻止疫情在國內蔓延及波及鄰國養(yǎng)兔業(yè)安全，需及時篩查陽性病原，撲殺感染動物，阻斷疫情傳播。本文概述了近年來國內外RHDV2檢測方法和診斷技術的研究進展，旨在為RHDV2 的早診、監(jiān)測和控制提供科學依據(jù)。

1 病原學檢測技術

1.1 實時熒光定量PCR 該技術通過在普通PCR 技術的基礎上加入熒光標記探針或熒光染料實現(xiàn)核酸的定量檢測，與傳統(tǒng)PCR 技術相比，實時熒光定量PCR 技術更快速、靈敏，結果更加直觀且不用進行凝膠電泳等繁瑣操作，更加便捷、準確和安全，因此，該技術被廣泛地應用于RHDV2 的監(jiān)測或者家兔恢復期RHDV2 的監(jiān)測。王波［6］根據(jù)RHDV2 VP60 基因序列，利用SYBR Green I 技術，建立了一種RHDV2 的SYBR Green I 熒光定量PCR 檢測方法，該方法特異、靈敏，經(jīng)換算，其最低檢測限度可達68 拷貝/μL。Duarte 等［7］也基于VP60 基因設計特異性引物和探針，建立了一種RHDV2 的Taqman 熒光定量PCR，該方法的重復性和重現(xiàn)性都較高，其組間變異系數(shù)低于2.4%，最低檢測限度可達9 拷貝/μL。Fitzner 等［8］利用Taqman 熒光定量PCR 成功在兔子肝臟中檢測到波蘭地區(qū)的首例RHDV2。Camacho等［9］利用該方法對采自西班牙南部96個地區(qū)的190份病死野兔樣品進行了RHDV2檢測，結果其陽性檢出率達到了97.4%（185/190），表明RHDV2在西班牙地區(qū)傳播廣泛。

1.2 RT-PCR 普通RT-PCR 檢測方法的普適性更強，適用于多數(shù)實驗室。楊澤曉等［10］根據(jù)RHDV 和RHDV2 VP60 基因中的保守片段設計特異性鑒別引物，建立了可區(qū)分RHDV和RHDV2的復合型RT-PCR，其對RHDV2的最低檢測限度達到230拷貝/μL。Harcourt 等［11］利用PCR 對195份采自英國地區(qū)的寵物兔肝臟進行了RHDV 和RHDV2 檢測，結合病理學觀察結果，共計檢出188份陽性樣品，陽性率達96.4%（188/195），所有樣品均為單一感染，未發(fā)現(xiàn)RHDV 和RHDV2 的混合感染，其中RHDV2 的陽性率達到66.5%（125/188），高于經(jīng)典毒株的陽性率，可見RHDV2已取代經(jīng)典毒株成為英國寵物兔身上的新流行毒株。Hall 等［12］開發(fā)了一種可以鑒別診斷GI.1c（RHDV）、GI.2（RHDV2）、GI.1a-K5、GI.1a-Aus 4種不同基因型RHDV 的多重RT-PCR，該方法對RHDV2的最低檢測靈敏度可達10拷貝/μL。

1.3 其他病原學檢測技術 Yang 等［13］基于環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP），選擇RHDV2 VP60 基因的保守序列進行引物設計，通過反應條件優(yōu)化，建立了RHDV2 的RT-LAMP 檢測方法，該方法特異、靈敏、快速、成本低，可通過肉眼判讀檢測結果，其最低檢測限度可達到180 拷貝/μL，適用于RHDV2 的快速檢測。Miao 等［14］利用電子顯微鏡（EM），采用“點滴法”對純化的RHDV2 病毒樣顆粒進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)病毒是直徑約為30 nm 的球形顆粒，形態(tài)類似于RHDV，該方法可在其他方法得出可疑結果時作為RHDV2診斷的補充方法。最適合進行RHDV2鑒定的電鏡方法是免疫電鏡技術（IEM），該方法可以用兔抗RHDV2 高免血清（兔或其他動物）或單克隆抗體（MAb）與相應抗原進行檢測，能提升正確鑒定病毒粒子和病毒蛋白的準確度。

2 血清學檢測技術

2.1 酶聯(lián)免疫吸附技術 酶聯(lián)免疫吸附技術（ELISA）是一種可以檢測RHDV2 抗原或抗體的技術，也是實驗室最常用的檢測技術，是國際貿易和OIE 所推薦的檢測方法。Baratelli 等［15］為了研究RHDV2滅活疫苗是否能有效地傳遞給免疫種兔的后代，通過競爭ELISA 和固相ELISA 檢測該病毒的抗體水平情況，結果顯示RHDV2 抗體在育種過程中可持續(xù)長達一年之久，其母源抗體可以持續(xù)28 d，由此分析獲知RHDV2可能主要是通過胎盤機制傳播。Dalton 等［16］使用RHDV2 特異性單克隆抗體進行抗原捕捉和羊抗RHDV2制備，采用夾心ELISA 技術對兔肝臟中的抗原進行檢測，結果顯示該ELISA 靈敏度接近100%，能成功檢測RHDV2 和RHDV2 重組病毒體，與RHDV G1 病毒未產生交叉反應，具有較好的重復性，最低檢測濃度為6 ng/mL。Strive 等［17］使用RHDV2特異性單克隆抗體與澳大利亞病毒（RHDV，RHDV2 和兩株不同的RHDVa）抗原相結合對競爭ELISA 進行調整，RHDV2 的IgA 和IgM 同型實驗比原來RHDV的滴度提高了4倍?？椎律?8］使用原核表達技術進行RHDV2表達和單克隆抗體的制備，最后將純化的蛋白包被于酶標板，然后進行抗RHDV2 單克隆抗體的雜交瘤細胞篩選，篩選到4 株能夠識別RHDV2 的單抗株。ELISA可以在病毒感染早期進行病原檢測，或對后期疫苗免疫后的抗體水平進行監(jiān)測。

2.2 膠體金免疫層析技術 膠體金免疫層析技術（GICT）是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型免疫標記技術，近年來已應用于各種動物疫病抗原和抗體的快速檢測，該方法操作簡單、快速、靈敏，且不需要其他昂貴儀器，可在10 min 內完成檢測，非常適用于基層工作者和養(yǎng)殖場的全場普篩，目前該技術用于檢測RHDV 的較多。周麗軍［19］將RHDV VP60截段蛋白包被于金標墊，用兔抗重組多克隆抗體標記C線，以HRP羊抗兔IgG標記T線，建立了RHDV的膠體金檢測方法，臨床樣品陽性檢出率為97.4%（150/154）。武玉香等［20］將VP60-2F4單克隆抗體包被于金標墊，VP60-9D4 和羊抗鼠分別作為檢測線（T 線）和質控線（C 線），進行臨床樣品（100份）檢測，結果與紅細胞凝集試驗（HA）結果一致，并且與兔巴氏桿菌、大腸桿菌、兔球蟲、新城疫、豬瘟病毒等無交叉反應。GICT技術不僅可以檢測血清，還可檢測抗原，其生產成本較低，檢測時間較短，在未來開發(fā)RHDV2 檢測技術時可將該方法作為備用方法之一。

2.3 免疫印跡技術 免疫印跡技術（WB）是在SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫測定技術基礎上發(fā)展起來的一種新型免疫生化技術，在HA、ELISA 等試驗出現(xiàn)可疑結果或懷疑樣品中有RHDV2 存在時，可利用該技術進行最終診斷。Kong 等［21］利用桿狀病毒表達系統(tǒng)進行RHDV2 VP60 的表達與純化，以單克隆抗體作為一抗，HRP 羊抗鼠作為二抗進行WB 驗證，結果顯示有兩種單克隆抗體可以與RHDV2 VP60 反應，但這兩種單抗是否能夠用于臨床樣品檢測還需驗證。Qi等［22］利用pFastBac 雙重表達載體，分別表達了經(jīng)典RHDV 和RHDV2 的VP60 基因。通過IFA 和蛋白免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)重組VP60 蛋白在感染SF9 細胞中能夠有效表達，且在72 h 時重組蛋白的表達水平最高，96 h 之后開始下降。WB 技術一般用于驗證目的蛋白產生抗體是否具有反應原性，在蛋白表達及純化中我們都加入相應蛋白標簽，最后通過檢測標簽判定是否是目的蛋白。該技術常與IFA 技術結合，通過熒光增強效應和底物顯色來確定目的蛋白所產生的抗體。

3 討論與結論

養(yǎng)兔業(yè)是我國畜牧業(yè)的重要組成部分，四川是全國最大的養(yǎng)兔大省，2019年兔出欄量占到了全國的39.66%，養(yǎng)兔業(yè)是全省畜牧業(yè)發(fā)展的重要支柱產業(yè)之一，在養(yǎng)殖業(yè)中具有不可替代的地位。RHDV2 作為一種新型兔瘟病毒，在國內于2020 年4 月首發(fā)于四川省金堂縣，導致感染場死亡率達60%以上，與RHDV 相比，RHDV2 的傳播速度更快、傳染性更強、感染宿主范圍更廣，且RHDV 經(jīng)典株的疫苗對RHDV2 幾乎沒有防控作用，給養(yǎng)兔業(yè)帶來了極大的威脅。當前，四川已有多起該病毒存在的報道，似有擴散的趨勢和風險，且當前仍無針對性疫苗進行有效防控。為避免RHDV2 的傳播，迫切需要快速、準確、高效的檢測手段。病毒分離是檢測RHDV2 的金標準，但分離病毒耗時較長，難度較大，且該病毒在體外尚無穩(wěn)定的細胞材料，導致該方法不適用于疾病快速檢測，在此基礎上核酸檢測技術迅速崛起，類似于RT-PCR、RT-qPCR 等技術，可以對多種混合感染的病原進行檢測，樣品可以是唾液、組織或血液等。

目前暫無RHDV2 疫苗進行有效防控，無需進行疫苗毒和野毒區(qū)分，只需進行抗體檢測就能判定兔群是否感染RHDV2，其中類似膠體金技術可供基層工作者使用，能快速確定病原，及時清除病原，切斷傳播途徑，防止疫情擴散。ELISA技術在前期可對大量樣品進行檢測，后續(xù)疫苗上市后可對兔群的抗體水平進行監(jiān)測。RT-PCR技術可以先進行RHDV2 的檢測，確定樣品為陽性后再通過全基因組測序、基因比對、進化樹分析等技術確定毒株的基因型和溯源，為接下來的防控做準備。