布氏桿菌病鑒別診斷技術(shù)以及疫苗研究進展

楊曉霞，孫桂珍，王兆麗

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，山東 泰安 271018；2.泰安市中心醫(yī)院醫(yī)聯(lián)體辦公室，山東 泰安）

布氏桿菌病（Brucellosis）是由布氏桿菌屬引起的可以同時在牲畜與人群中進行傳播的全身癥狀傳染病?；疾∪巳和ㄟ^食用疫病肉食或直接接觸疫病牲畜的排泄物遭到感染。感染后的病菌經(jīng)由人體消化道迅速作用于肝脾組織造成局部臟器的充血腫大，并在全身引起發(fā)熱、盜汗、疼痛等炎癥反應(yīng)，其臨床診斷標志在于病人的關(guān)節(jié)異常疼痛。畜牧業(yè)是我國GDP穩(wěn)定發(fā)展的主要因素，而以病情鑒別診斷與疫苗研究為代表的畜牧獸醫(yī)動物防疫工作事關(guān)我國食品安全和經(jīng)濟安全。當前，我國大部分區(qū)域關(guān)于布氏桿菌病鑒別診斷技術(shù)以及疫苗研究進展緩慢，亟須總結(jié)相關(guān)診斷經(jīng)驗與研究技術(shù)，為布氏桿菌病的防疫提供技術(shù)支撐。

1 布氏桿菌病鑒別診斷技術(shù)

1.1 分離培養(yǎng)鑒定法

分離培養(yǎng)鑒定法在布氏桿菌病鑒別診斷工作中權(quán)威性極高，曾被業(yè)內(nèi)稱之為相關(guān)病菌檢定的“金標準”[1]。在實際檢驗過程中需要從目標病患體液、組織器官、分泌物及排泄物中進行取樣，置于專業(yè)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)，并在溫室條件下幫助病菌大量繁殖，待目標細菌單位達到檢測標準后對其進行分離與鑒定工作[2]。

1.2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法是伴隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在基因?qū)用娴膭?chuàng)新而出現(xiàn)的細菌鑒別診斷技術(shù)，該方法重點觀察目標抗原及抗體在細菌入侵后的特異性反應(yīng)，從而得出具有較高時效性且不為其他病菌干擾的診斷鑒別信息[3]。在實際檢測過程中，檢測人員對受檢對象采用血檢方式，通過離心提取病人血清，檢測參照物對待檢病菌間的特異性反應(yīng)，從而快捷簡單地確定受檢對象是否受到相應(yīng)病菌的侵襲[4]。但免疫學(xué)方法高度依賴于參照物對目標病菌特異反應(yīng)的靈敏度，同時也受病菌本身與參照物之間的吸引力及融合程度影響，故需要不斷為布氏桿菌尋找高靈敏度、高特異性及高融合吸引能力的免疫參照反應(yīng)物質(zhì)。目前該方法中診斷鑒別效果較好的免疫參照抗體為其多克隆抗體，但由于其高昂的費用與嚴苛的儲存條件，尚不能做到向基層全局推廣[5]。

1.3 人工免疫與自然感染區(qū)別鑒定

為了及時掌握疫情及疫區(qū)的病情發(fā)展情況，在病情診斷過程中，需要對病人或病畜作出人工免疫與自然感染的種型鑒定[6]。依托于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展歷史中豐富的病例記載與數(shù)據(jù)信息，可以在對樣品進行檢測的同時獲取多種致病菌信息，通過對不同致病菌的分類及鑒定，從而判定其人工免疫與自然感染的種型。但大量的病菌信息反應(yīng)中還囊括了失活菌群，診斷結(jié)果極易受到失活病菌的干擾，從而造成假陽性的誤診結(jié)果[7]。

1.4 液相芯片

液相芯片技術(shù)依據(jù)基因蛋白芯片，利用分子生化技術(shù)與計算機模擬技術(shù)，將布氏桿菌參照物選定為存在熒光編碼反應(yīng)的微型球體，并置于目標受檢對象的體液樣本之中，通過觀察熒光編碼微球發(fā)生的具體特異性反應(yīng)，從而確定受檢對象是否受到布氏桿菌的侵襲[8]。（1）液相芯片技術(shù)的引入剔除了取樣培養(yǎng)處理環(huán)節(jié)，使得鑒別與診斷工作的時效性與便捷性大幅提升。（2），該技術(shù)繼承了免疫學(xué)檢驗方法的優(yōu)點，選用具有高靈敏性、高融合性及高特異性表面的新型化合參照物，大幅提升了診斷鑒別工作的準確性。（3）液相芯片技術(shù)可將檢測的具體數(shù)值信息帶入計算機模擬系統(tǒng)進行二次驗算，有效克服了其他檢測方法中病菌針對性較差的缺點。（4）液相芯片所采用的參照物編碼球體積較小，可以對目標病菌的大分子結(jié)構(gòu)進行精準檢測與重點分析。液相芯片技術(shù)的應(yīng)用是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)防疫工作領(lǐng)域內(nèi)的重要成果，已在其他疾病病菌的鑒定與診斷中已經(jīng)積累了相當程度上的臨床經(jīng)驗[9]。值得注意的是，相液芯片內(nèi)部編碼球的特異性反應(yīng)是以熒光染料變色的形式進行展現(xiàn)的，其對高技術(shù)染色物質(zhì)的需求量較大，需要編碼微球?qū)ψ陨淼墓饣瘜W(xué)反應(yīng)進行控制，避免在未接觸待檢致病菌前被漂白與分解。（5）編碼球自身的技術(shù)含量較高，其編碼球的變色標記功能專利始終被國外所壟斷，尚不能做到在畜牧業(yè)基層防疫區(qū)域的推廣[10]。為此，我國當前主要任務(wù)就是加大布氏桿菌液相芯片診斷技術(shù)的自我獨立開發(fā)能力，打破國外在技術(shù)層面的壟斷，為區(qū)域防疫診斷鑒別工作的推進創(chuàng)造出新的應(yīng)用方式[11]。

2 布氏桿菌疫苗研究

2.1 弱毒疫苗

布氏桿菌弱毒疫苗研發(fā)的重點在于對細菌原有毒性弱化，距今已經(jīng)存在近百年的研究歷史，在實際研發(fā)中主要采用羊、牛、豬作為疫苗菌體的培養(yǎng)來源[12]。從上世紀60年代，我國東北獸醫(yī)研究所就開始了羊型弱毒疫苗的研發(fā)，通過對從羊機體中采樣取得的馬耳他布魯氏菌的強度型號菌株反復(fù)經(jīng)由雞減毒處理，從而減弱強度毒性來制備弱毒疫苗。該類弱毒疫苗最為顯著的優(yōu)勢在于其接種方式較為靈活，既可以通過皮下注射接種，也可以采用氣溶膠吸入的方式接種，適用于大面積的養(yǎng)殖基地。但該型號弱毒疫苗并不適用于人類，一旦發(fā)生誤吸，則會在人的機體內(nèi)引起較為強烈的過敏反應(yīng)[13]。

2.2 滅活疫苗

布氏桿菌滅活疫苗是為了解決布氏桿菌弱毒疫苗毒性控制力較差的問題而開始研究的，其接種目標更多地放置在疫苗的安全性、長效性及診斷抗干擾性之上[14]。其分別以牛、羊作為疫苗菌體的培養(yǎng)來源，通過滅活處理后可以與生物差異較大的動物群體形成防疫互通[15]。同時，在接種該疫苗后，由于其細菌本體已經(jīng)呈現(xiàn)出失活狀態(tài)，故不會影響血清診斷。但該類型疫苗的缺陷在于有效免疫周期較短，一定時期內(nèi)需要反復(fù)接種，以避免由于免疫失效造成的患病及傳染。

2.3 亞單位疫苗和DNA疫苗

布氏桿菌亞單位疫苗是通過篩選出布氏桿菌中具有免疫活性片段制成的疫苗，而DNA疫苗則是亞單位疫苗中較為重要的一種。DNA疫苗指將目的抗原基因插入到載體中形成的重組載體，直接作用于動物體內(nèi)并表達天然抗原，刺激機體發(fā)生免疫應(yīng)答，從而起到保護的作用[16]。常見的布氏桿菌DNA疫苗包括重組蛋白L7/L12、p39、Bp26、Omp16、Omp19、Omp25、Omp31、SurA和細菌鐵蛋白等[17-18]，但其主要缺點為保護力相對較低，需要幾次加強免疫或加大劑量來提高保護力。

2.4 合成肽疫苗

布氏桿菌合成肽疫苗是一種相對安全的疫苗，由人工方法合成具有免疫作用的保護性短肽作為含有免疫決定簇的組分，通過與載體連接和添加佐劑所制成的疫苗。這些特定序列的肽能優(yōu)先被細胞免疫系統(tǒng)所識別，激活T細胞從而發(fā)揮作用[19-20]，但當前合成肽疫苗的保護力也并不理想。

3 結(jié)語

目前，通用的布氏桿菌病鑒別診斷技術(shù)有分離培養(yǎng)鑒定法、免疫學(xué)方法、人工免疫與自然感染區(qū)別鑒定法與液相芯片四種，而布氏桿菌疫苗研究已在弱毒疫苗、滅活疫苗、合成肽疫苗、亞單位疫苗與DNA疫苗等方面取得了巨大的成果與進展。本文通過對布氏桿菌病鑒別診斷技術(shù)及疫苗研發(fā)狀態(tài)進行總結(jié)，分析相關(guān)技術(shù)方法的優(yōu)缺點，從而為畜牧業(yè)大規(guī)模集約式發(fā)展中布氏桿菌病的防疫提供技術(shù)支撐。