番石榴多酚提取及其抗氧化作用與抑制α -葡萄糖苷酶活性研究

徐金瑞，侯方麗，胡 勇，黃建蓉

（廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，廣東中山 528458）

生物體內(nèi)自由基過(guò)量堆積引發(fā)的氧化損傷，是導(dǎo)致生物衰老及誘發(fā)Ⅱ型糖尿病等相關(guān)代謝性疾病發(fā)生的主要原因之一。如果給予適當(dāng)自由基清除劑及時(shí)清除體內(nèi)多余的自由基，可以減少細(xì)胞的氧化損傷，從而預(yù)防或防止這些重大疾病的發(fā)生發(fā)展[1-3]?？茖W(xué)研究證實(shí)，植物組織內(nèi)許多活性物質(zhì)具有較好的抗氧化作用。α -葡萄糖苷酶可促進(jìn)腸道食物中碳水化合物（如淀粉、蔗糖、麥芽糖等）分解成單糖，引起餐后血糖升高，如果α -葡萄糖苷酶活性被抑制或降低，可減緩葡萄糖的生成吸收，在一定程度上降低餐后血糖值。因此，臨床上常通過(guò)對(duì)α -葡萄糖苷酶活性抑制作用的檢測(cè)，初步判斷藥物有無(wú)降糖活性[4]。

番石榴是華南地區(qū)較為暢銷(xiāo)的水果之一，果實(shí)清甜可口，維生素、果糖、葡萄糖、谷氨酸、膳食纖維，以及鈣、磷、鐵等人體所需的微量元素含量豐富，是各種果蔬之冠，常吃番石榴具有抗衰老、調(diào)節(jié)生理機(jī)能、治療糖尿病、抗病毒、抗輻射等功效[5]。目前，有關(guān)番石榴果實(shí)的功效評(píng)價(jià)還較少，且多集中在化學(xué)成分方面的研究[6-9]。利用超聲波提取活性物質(zhì)的過(guò)程中，由于物料受到超聲波的沖擊，再加上超聲波的空化作用，使得流體的相接觸面大大增加，從而強(qiáng)化了傳質(zhì)過(guò)程。另外，超聲波被介質(zhì)吸收后，轉(zhuǎn)化為熱能，進(jìn)一步使得物料內(nèi)部溫度升高，加速了多酚等有效成分的溶解，故而已在很多研究中被應(yīng)用。

基于此，擬采用超聲波輔助萃取法優(yōu)化番石榴中多酚物質(zhì)的提取工藝，并對(duì)其體外清除自由基（DPPH·）和抑制α -葡萄糖苷酶的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，可為番石榴及其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1）材料。番石榴洗凈、切片，于50 ℃下烘干，粉碎，過(guò)40 目篩，備用。

（2）主要試劑。三吡啶三吖嗪（TPTZ），F(xiàn)luka公司提供；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Sigma 公司提供；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）和α -葡萄糖苷酶（1KU），北京索萊寶科技有限公司提供。

1.2 儀器設(shè)備

pHS-3C 型酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；V-1200 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-2000 型旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；FD-1E-80 型冷凍干燥機(jī)，上海楚定分析儀器有限公司產(chǎn)品；DFY-500 型高速中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；SB25-12DT 型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚含量的測(cè)定-酒石酸亞鐵比色法[10]

吸取1 mL 待測(cè)樣液于25 mL 比色管中，加入4 mL 蒸餾水和5 mL 酒石酸亞鐵溶液，混合后，用pH 值7.5 磷酸鹽緩沖液定容，混勻；同時(shí)以蒸餾水代替樣品提取液作空白，于波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)定吸光度。另以0～50 μg/mL 的焦性沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=2.669X-0.008 9，R2=0.999 5。

1.3.2 總抗氧化能力（TAC）測(cè)定[11]

實(shí)際加樣量擴(kuò)大20 倍，即0.2 mL 樣品+0.6 mL水+6 mL 37 ℃的FRAP 工作液（10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L FeCl3、0.3 mmol/L 醋酸鈉緩沖液以1∶1∶10 的質(zhì)量比混合），搖勻后放置4 min，于波長(zhǎng)593 nm處測(cè)定吸光度。另以0.1～1.0 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=0.311 7X-0.006，R2=0.999 4。樣品的總抗氧化能力以FeSO4提取物表示，單位mmol/g。

1.3.3 番石榴多酚提取工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)。①料液比的選擇，取1 g 樣品4 份，設(shè)置超聲波溫度50 ℃，提取時(shí)間20 min，60%乙醇作為溶劑，考查料液比1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL）對(duì)多酚含量和總抗氧化能力的影響。②乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇，取1 g 樣品5 份，設(shè)置超聲波溫度50 ℃，提取時(shí)間20 min，料液比1∶40（g∶mL），考查乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，50%，60%，70%，80%對(duì)多酚含量和總抗氧化能力的影響。③超聲溫度的選擇，取1 g 樣品4 份，按料液比1∶40（g∶mL）加入70%乙醇溶液，提取時(shí)間20 min，考查溫度40，50，60，70 ℃對(duì)多酚含量和總抗氧化能力的影響。④提取時(shí)間的選擇，取1 g 樣品4 份，設(shè)置超聲波溫度50 ℃，按料液比1∶40（g∶mL）加入70%乙醇溶液，考查提取時(shí)間10，20，30，40 min 對(duì)多酚含量和總抗氧化能力的影響。

（2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多酚含量為考查指標(biāo)，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度和超聲波作用時(shí)間等4 個(gè)因素作為自變量進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 番石榴多酚的制備

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化方案，設(shè)置超聲溫度為50 ℃，按料液比1∶50（g∶mL）將適量番石榴粉加入60%乙醇溶液中，提取30 min，收集濾液，濃縮、冷凍、干燥，用于1.3.5 和1.3.6 試驗(yàn)。

1.3.5 清除DPPH·的能力[12]

用無(wú)水乙醇作參比空白液，于0.2 mmol/L DPPH·溶液2 mL 中加入0～100mg/L 樣品2 mL，搖勻于室溫下放置30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定其吸光度A1，同時(shí)測(cè)2 mL 樣品與2 mL 無(wú)水乙醇反應(yīng)后的吸光度A2，再測(cè)定0.2 mmol/L 的DPPH·溶液2 mL與無(wú)水乙醇2 mL 反應(yīng)后的吸光度A3。根據(jù)以下公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH·的抑制率：

式中：A1——DPPH·溶液與樣品溶液反應(yīng)后的吸光度；

A2——樣品溶液與空白溶劑反應(yīng)后的吸光度；

A3——DPPH·溶液與空白溶劑反應(yīng)后的吸光度。

1.3.6 α -葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)[13]

以0.1 mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 值6.8）為溶劑，分別配制1.0 U/mL α -葡萄糖苷酶溶液和1.0 mmol/L PNPG 溶液。將1.0 U/mL α -葡萄糖苷酶600 μL、pH 值6.8 磷酸鈉緩沖液200 μL，不同質(zhì)量濃度（20～100 mg/L）番石榴多酚溶液200 μL 混勻后，于37 ℃下保持10 min，加入1.0 mmol/L PNPG 溶液200 μL，混勻后于37 ℃下保溫30 min，再加入0.5 mol/L Na2CO3溶液2 mL 終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)400 nm 處測(cè)定濃度梯度番石榴多酚作用下的吸光度。

式中：A1——加番石榴多酚抑制劑和α -葡萄糖苷酶反應(yīng)后的吸光度；

A2——只加番石榴多酚抑制劑不加α -葡萄糖苷酶的吸光度；

A3——不加番石榴多酚抑制劑只加α -葡萄糖苷酶反應(yīng)后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 番石榴多酚提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)提取效果的影響

料液比對(duì)提取效果的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)提取效果的影響

從圖1 可以看出，隨著料液比逐漸加大，多酚含量和總抗氧化能力逐漸增大，且變化趨勢(shì)基本一致，推測(cè)番石榴多酚可能是其抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。當(dāng)料液比增至1∶40 后，多酚含量和總抗氧化能力增量趨于平緩，從成本考慮，料液比選擇1∶40比較適宜。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

從圖2 可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高，番石榴多酚含量和總抗氧化能力均表現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增至70%時(shí)達(dá)到峰值，之后多酚含量和總抗氧化能力都相應(yīng)下降，特別是總抗氧化能力下降趨勢(shì)明顯。可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增高，提取體系的極性降低，此時(shí)番石榴中一些極性較小的成分也競(jìng)相溶出，加上溶劑化及其熱效應(yīng)的共同作用，造成多酚含量及其抗氧化能力降低。

通過(guò)對(duì)識(shí)字教學(xué)方式的對(duì)比，可以影射出教學(xué)方法背后教學(xué)目的的差異。教材編寫(xiě)目標(biāo)是不斷嬗變的。人教版語(yǔ)文教材的編寫(xiě)理念依據(jù)課程標(biāo)準(zhǔn)（2001年版），“在語(yǔ)文學(xué)習(xí)過(guò)程中，培養(yǎng)愛(ài)國(guó)主義感情、社會(huì)主義道德品質(zhì)，逐步形成積極的人生態(tài)度和正確的價(jià)值觀，提高文化品位和審美情趣”。[1]因此多通過(guò)傳統(tǒng)人文經(jīng)典、祖國(guó)壯美山河、科技重大進(jìn)步等話題編排識(shí)字材料，通過(guò)此類(lèi)話題分支下的教學(xué)達(dá)到識(shí)字與培育民族向心力的雙重目的。

2.1.3 超聲溫度對(duì)提取效果的影響

超聲溫度對(duì)提取效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)提取效果的影響

從圖3 可以看出，隨著提取溫度的逐步升高，多酚含量和總抗氧化能力開(kāi)始增大，但溫度升至50 ℃后，多酚含量和總抗氧化能力均呈下降趨勢(shì)，可能是溫度過(guò)高造成多酚類(lèi)物質(zhì)被破壞，同時(shí)較高濃度時(shí)乙醇溶液部分揮發(fā)所致。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

從圖4 可以看出，在最初一段時(shí)間，隨著超聲波作用時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，多酚含量及抗氧化能力均表現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，當(dāng)超過(guò)30 min 后，多酚含量和總抗氧化能力的增量均趨于平緩，從節(jié)約能耗角度考慮，提取時(shí)間30 min 左右較為適宜。以往文獻(xiàn)資料中對(duì)活性物質(zhì)采用常規(guī)方法提取時(shí)間較長(zhǎng)，說(shuō)明超聲波具有在短時(shí)間內(nèi)明顯加速多酚類(lèi)有效成分溶出的作用。

綜合上述研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，番石榴中多酚含量和總抗氧化能力變化趨勢(shì)一致，為了簡(jiǎn)化研究，后續(xù)正交試驗(yàn)中僅以多酚含量作為考查指標(biāo)。

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

以多酚含量為考查指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間等4 個(gè)因素按照L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表2 可優(yōu)化得到超聲提取番石榴多酚的最佳因素水平組合為A2B2C2D3，即料液比1∶50，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度50℃，超聲時(shí)間30 min。通過(guò)比較極差值，各因素對(duì)提取效果的影響主次順序?yàn)镃＞D＞B＞A，說(shuō)明提取溫度對(duì)多酚提取的影響最大，其次分別是超聲時(shí)間，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比。由于最佳試驗(yàn)組合并沒(méi)有出現(xiàn)在試驗(yàn)方案中，進(jìn)一步對(duì)最佳提取條件進(jìn)行了驗(yàn)證，測(cè)得的多酚含量為53.54 mg/g，均高于9 組方案的試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明正交試驗(yàn)所得最優(yōu)條件合理可行。

2.3 對(duì)DPPH·的清除效果

番石榴多酚清除DPPH·的能力見(jiàn)圖5。

圖5 番石榴多酚清除DPPH·的能力

從圖5 可以看出，在0～100 mg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，番石榴多酚提取物對(duì)DPPH·的清除能力逐漸增強(qiáng)，通過(guò)線性擬合得到回歸方程Y=0.875 8X+3.686 4，R2=0.979 2，將Y=50 代入可計(jì)算出IC50=52.88 mg/L。對(duì)比前期研究[10]得到的抗壞血酸IC50=46.76 mg/L，番石榴多酚清除DPPH·的能力稍弱于抗壞血酸，這可能與多酚純度較低有關(guān)，還需進(jìn)一步純化后再做比較，但這一結(jié)果同時(shí)也說(shuō)明了番石榴多酚清除自由基的能力較強(qiáng)，可以作為抗氧化活性資源來(lái)利用。

2.4 對(duì)α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用

番石榴多酚對(duì)α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用見(jiàn)圖6。

圖6 番石榴多酚對(duì)α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用

從圖6 可以看出，在0～10 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，番石榴多酚提取物對(duì)α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用隨著濃度增大逐漸增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度增大至8 mg/mL 后，抑制作用趨于平緩。通過(guò)線性擬合得到回歸方程Y=6.812 6X+2.5，R2=0.970 9，將Y=50 代入可計(jì)算出IC50=6.97 mg/mL。張鐘等人[14]在荔枝多糖抑制α -葡萄糖苷酶活性的研究中發(fā)現(xiàn)，40 mg/mL的阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率為69.23%。根據(jù)研究得到的回歸方程，可計(jì)算出同樣抑制率時(shí)番石榴多酚質(zhì)量濃度僅為9.80 mg/mL，說(shuō)明番石榴多酚對(duì)α -葡萄糖苷酶活性具有很強(qiáng)的抑制作用，可以作為α -葡萄糖苷酶抑制劑來(lái)開(kāi)發(fā)。

3 結(jié)論

番石榴多酚的最佳提取工藝為料液比1∶50，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，溫度50 ℃，超聲時(shí)間30 min?？寡趸鸵种痞?-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)表明，番石榴多酚具有較強(qiáng)的清除DPPH·能力和抑制α -葡萄糖苷酶活性作用，說(shuō)明番石榴多酚具有較強(qiáng)抗氧化作用，且是良好的α -葡萄糖苷酶抑制劑，表明番石榴多酚可作為抗氧化與降血糖功效因子加以開(kāi)發(fā)利用。