基于唾液檢測(cè)病毒感染性生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

余舒星 鄒靜 李雨慶

1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院 成都 610041；2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院兒童口腔科 成都 610041

口腔中各大小腺體分泌的唾液具備緩沖、潤(rùn)濕、清潔、消化和抑菌等多種功能。唾液中除了常見的有機(jī)物及無(wú)機(jī)物外，隨著機(jī)體健康狀態(tài)的變化（如病毒、細(xì)菌、真菌等感染），唾液成分也可發(fā)生相應(yīng)的改變。由于唾液成分的動(dòng)態(tài)變化、獲得唾液樣本的便捷性，加上相關(guān)檢測(cè)技術(shù)（包括微生物組學(xué)、唾液基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等）的快速發(fā)展，使得唾液樣本在病毒感染的診斷中具有重要的參考價(jià)值[1]。雖然唾液樣本相比于血液樣本的靈敏度和特異性較低，在常規(guī)臨床診療中也尚未廣泛應(yīng)用，但唾液具有便于采集和取樣無(wú)創(chuàng)等優(yōu)勢(shì)。因此，唾液樣本有望作為常規(guī)體檢篩查手段之一，協(xié)助識(shí)別病毒感染的高危人群，做到早預(yù)防、早治療[2-4]。

本文將基于唾液樣本檢測(cè)病毒感染性生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 皰疹病毒（herpesviruses）

含包膜的皰疹病毒為雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒科，有8種類型可致病。

1.1 巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）

CMV為DNA病毒，亦稱細(xì)胞包涵體病毒，屬皰疹病毒組。新生兒感染CMV可造成患兒智力和聽力下降，極大影響患兒的生長(zhǎng)發(fā)育。目前，感染CMV的新生兒約占新生兒總數(shù)的0.2%～2%[5-6]。先天感染CMV新生兒的及時(shí)識(shí)別有助于疾病的早期干預(yù)和抗病毒治療。Boppana等[7]通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 在先天感染CMV新生兒的唾液中，檢測(cè)出該病毒的特異性和靈敏度可高達(dá)99.9%和100%。研究[8]發(fā)現(xiàn)：唾液樣本與尿液樣本的檢測(cè)結(jié)果一致性高達(dá)91%。唾液樣本具有隨時(shí)采集的優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)于新生兒來(lái)說(shuō)，唾液取樣易于操作。但唾液采集時(shí)易被同樣感染CMV母親的乳汁、以及分娩時(shí)母親的其他分泌物污染。因此，所有唾液檢測(cè)陽(yáng)性的結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證[9-11]。未來(lái)可探索如何使唾液樣本的采集避免上述問(wèn)題的發(fā)生，以降低假陽(yáng)性率[12]。

1.2 EB病毒（epstein-barr virus）

EB病毒屬γ皰疹病毒亞科，是一種含包膜的DNA病毒，大部分通過(guò)侵襲B淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞感染機(jī)體[13]。研究[14-15]表明：EB病毒通過(guò)感染B淋巴細(xì)胞得以長(zhǎng)時(shí)間生存，而口腔上皮細(xì)胞感染可使EB病毒分泌到唾液中。研究發(fā)現(xiàn)：EB病毒與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)。鼻咽癌患者體內(nèi)通常存在較高水平的EB病毒特異性抗體。相比于正常健康體檢者的唾液而言，以酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)EB病毒感染的鼻咽癌患者的唾液后發(fā)現(xiàn)：其病毒抗原免疫球蛋白A（virus antigen immunoglobulin A，VCA/IgA）和病毒早期抗原免疫球蛋白A（viral early antigen immunoglobulin A，EA/IgA）抗體的平均水平顯著升高。因此，唾液中EB病毒特異性抗體VCA/IgA以及EA/IgA的檢出水平對(duì)鼻咽癌有較高的診斷價(jià)值[16]。對(duì)于免疫力低下者，如伴有獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）或腎臟移植后的患者，其唾液中EB病毒載量明顯高于普通感染者[17-19]。唾液樣本不僅可用于檢測(cè)該病毒及其抗體，還可以用于患者的預(yù)后評(píng)估。Fagin等[20]利用qRT-PCR技術(shù)在患者唾液樣本中檢測(cè)出調(diào)控EB病毒裂解復(fù)制的早期即刻蛋白BZLF1的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA），并且發(fā)現(xiàn)該類患者病情較重。因此，唾液中EB病毒及其危險(xiǎn)因子的檢出可輔助判斷口腔內(nèi)各種上皮細(xì)胞的感染狀態(tài)，對(duì)臨床治療提供指導(dǎo)。

1.3 水痘帶狀皰疹病毒（varicella zoster virus，VZV）

VZV是一種嗜神經(jīng)細(xì)胞性的皰疹病毒。首次感染引起水痘后，病毒多隱藏于神經(jīng)細(xì)胞，受外界刺激，感染可再次復(fù)發(fā)，使機(jī)體出現(xiàn)帶狀皰疹[21]。Park等[22]在52例帶狀皰疹患者（herpes zoster）中，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)：46例患者唾液中可檢測(cè)到VZV的DNA，而這46例中只有28%（13/46）的患者血漿中存在VZV。該結(jié)果提示：檢測(cè)唾液中VZV的DNA可能對(duì)帶狀皰疹患者診斷有一定的潛在價(jià)值。但該研究納入病例數(shù)量較少，結(jié)果可能存在偏倚，還有待大樣本研究驗(yàn)證。此外，有研究[23]發(fā)現(xiàn)：帶狀皰疹病毒感染者唾液中VZV的DNA檢出率較高，且相對(duì)于抵抗力較強(qiáng)的年輕患者，年齡大、臨床癥狀重的患者唾液中該病毒的DNA含量更高。因此，唾液有望成為篩選VZV感染者以及評(píng)估患者病情的樣本選擇[24]。

1.4 單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）和人類皰疹病毒（human herpes virus，HHV）

HSV-1、2感染可引起生殖器皰疹和口唇皰疹等疾病[25]。HHV-6和HHV-7與紅疹、玫瑰疹等皮膚疾病相關(guān)[26]。人類卡波西肉瘤（Kaposi’s sarcoma，KS）和某些B細(xì)胞淋巴瘤等則是由HHV-8感染所致[27]。研究[28]表明：唾液中HSV-1反復(fù)脫落可能是由于HSV-1毒株重新激活所致。且相比人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者，單純帶狀皰疹病毒患者的HSV-1脫落量更多。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)發(fā)現(xiàn)：HSV-2也可以在口腔中脫落并進(jìn)入唾液[29]。HHV-6、7、8感染者的唾液中同樣能檢測(cè)到相應(yīng)病毒的DNA[30-31]。因此，在HSV和HIV感染者中，特別是針對(duì)伴發(fā)其他感染以及免疫力低下的患者，利用PCR技術(shù)檢測(cè)唾液樣本中病毒的DNA載量可用于監(jiān)測(cè)病毒脫落量及隨訪病毒是否重新激活，進(jìn)而輔助指導(dǎo)臨床[32]。

2 HIV

HIV是獲得性免疫缺陷綜合征的病原體，為逆轉(zhuǎn)錄病毒。目前認(rèn)為，HIV感染可導(dǎo)致各種并發(fā)癥的發(fā)生[33-34]。感染人類的病毒類型主要為HIV-1型和HIV-2型，其中HIV-1型毒力較強(qiáng)[35]。自20世紀(jì)80年代中葉起，唾液樣本因可能用于HIV患者的篩查和診斷而廣受關(guān)注[36]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，在唾液中檢測(cè)HIV抗體具有潛在可能。文獻(xiàn)[37-38]顯示：HIV唾液篩查試劑盒可通過(guò)免疫分析法實(shí)現(xiàn)患者唾液中的HIV抗體與試劑盒中被標(biāo)記的HIV抗原結(jié)合，且檢測(cè)靈敏度和特異性分別高達(dá)93%和99%。唾液中HIV抗體作為獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）篩查試劑盒的檢測(cè)標(biāo)志物，相對(duì)安全、方便、快速。因此，該篩查試劑盒可用于疫情暴發(fā)及AIDS高發(fā)的地區(qū)。此外，Yamada等[39]發(fā)現(xiàn)：在接受治療的AIDS患者中，唾液中某些抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物（如阿巴卡韋、替諾福韋、達(dá)蘆那韋等）的濃度可反映血漿中游離藥物的濃度，從而有利于間接監(jiān)控血藥濃度，指導(dǎo)臨床合理用藥。

3 肝炎病毒（hepatitis virus）

肝炎病毒是人類病毒性肝炎的病原體。其感染人類的主要類型為甲型（hepatitis A virus，HAV）、乙型（hepatitis B virus，HBV） 和丙型（hepatitis C virus，HCV）。HAV主要通過(guò)糞-口途徑傳播，也可通過(guò)受污染的食物、水等傳播[40]。HBV及HCV可由血液和受污染的體液等媒介進(jìn)行傳播[41-42]。研究者[43]對(duì)HAV感染者在確診后180 d內(nèi)唾液中HAV的免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、總抗體以及病毒載量水平進(jìn)行了縱向比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HAV的IgM和總抗體在HAV感染診斷后的90 d達(dá)到峰值，而在診斷后的30 d，病毒載量在抗體水平稍高時(shí)到達(dá)峰值。該研究提示：可通過(guò)檢測(cè)唾液中不同的標(biāo)志物（抗體及病毒載量）獲得較高的人群診斷覆蓋率。研究[44]發(fā)現(xiàn)：通過(guò)優(yōu)化的酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)（enzyme immunoassay，EIA） 來(lái)檢測(cè)唾液中乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），其特異性和靈敏度分別為92.6%和93.6%。既往的研究[45]從HBV、HCV患者以及健康人群中分別抽取20人，通過(guò)分析3組人群的唾液蛋白組發(fā)現(xiàn)：HBV和HCV患者唾液蛋白種類比健康者多，部分蛋白含量有所降低。此外，有研究[46]顯示：對(duì)唾液樣本中HBV的DNA檢測(cè)有利于隱匿性乙型肝炎患者的識(shí)別。唾液中HCV的RNA的檢測(cè)也有利于識(shí)別HCV患者[47-50]。

4 冠狀病毒（coronavirus，CoV）

CoV是一種具有囊膜的正鏈RNA病毒，屬CoV科?；蚪M分析顯示：2019年出現(xiàn)的新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）與2003年出現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）同屬于CoV中的β屬[51]，均可引起重癥甚至致命性的感染。SARS的診斷依賴于流行病史和精確的實(shí)驗(yàn)室檢查，其中最常用的是分子檢測(cè)，如提取呼吸道樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）或qRT-PCR[52]。qRT-PCR分析唾液和喉洗液顯示：唾液中SARS-CoV病毒量多于喉洗液。在進(jìn)行SARS的診斷時(shí)，唾液可考慮用作輔助診斷樣本[53]。多項(xiàng)研究[54-58]發(fā)現(xiàn)：可在唾液中檢測(cè)到SARS-CoV-2，提示唾液樣本在SARS-CoV-2感染的診斷和治療效果的動(dòng)態(tài)評(píng)估中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

5 其他病毒

5.1 登革熱病毒（dengue virus，DENV）

DENV是一種以節(jié)肢動(dòng)物為媒介感染人類的RNA病毒。該病毒可通過(guò)血液傳播、母嬰垂直傳播以及黏膜皮膚等途徑傳播[59-61]。ELISA和RT-PCR可分別從感染者的唾液中檢測(cè)到DENV的非結(jié)構(gòu)蛋白1（dengue virus-nonstructural protein，DENVNS1）和DENV的RNA[62-63]。此外，研究[64]發(fā)現(xiàn)：在繼發(fā)感染DENV患者的唾液中可檢測(cè)到IgG抗體。因此，在免疫分析法與聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)技術(shù)的輔助下，當(dāng)受試者拒絕或無(wú)法采集常規(guī)檢測(cè)樣本（血液樣本）時(shí)，收集唾液樣本后對(duì)DENV相關(guān)蛋白和核酸進(jìn)行檢測(cè)則成為一種可替代的選擇。

5.2 流行性感冒病毒（influenza virus）

流行性感冒病毒簡(jiǎn)稱流感病毒，人類、家禽和豬是該病毒常見的感染對(duì)象。人與人之間傳播的流感病毒一般為季節(jié)性流感病毒[65]，可導(dǎo)致急性發(fā)熱性呼吸道感染，甚至伴隨危及生命的并發(fā)癥，尤其是對(duì)于幼兒、老年人和免疫功能低下的患者[66-67]。多項(xiàng)研究[68-70]基于聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)的檢測(cè)方法對(duì)流感患者的唾液樣本與鼻咽拭子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)：兩種樣本檢出流感病毒的一致性較高（＞80%），流感病毒的基因拷貝數(shù)也幾乎相當(dāng)。有研究[71]指出：唾液與鼻咽拭子樣本聯(lián)合使用提高了檢測(cè)的靈敏度，比單獨(dú)的鼻咽拭子具有更高的價(jià)值。

5.3 人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）

HPV為一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒。該病毒主要侵襲人體皮膚及各黏膜的上皮細(xì)胞，包括肛門、生殖器、尿道、喉、口腔黏膜等的上皮細(xì)胞，引起尋常疣、生殖器疣、肛門癌、陰道癌、宮頸癌、呼吸道乳頭狀瘤病、鱗狀上皮內(nèi)病變等疾病[72]。腫瘤抑制基因P16過(guò)度表達(dá)可作為HPV感染的生物學(xué)標(biāo)志之一[73-74]。HPV感染可分為高危型與低危型。高危型HPV可導(dǎo)致P16蛋白過(guò)表達(dá)[75]。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinom，HNSCC）常由HPV高危型所誘發(fā)，且其感染部位大多位于舌根及扁桃體處[76]。由于HNSCC患者HPV感染位置具有一定的特異性，因此，利用唾液樣本檢測(cè)該病毒的相關(guān)生物標(biāo)志物逐漸受到關(guān)注。此外，HNSCC患者如果過(guò)表達(dá)P16基因，則對(duì)治療更敏感[77]。Cohen等[78]發(fā)現(xiàn)：利用HNSCC患者唾液初篩HPV的DNA可鑒別出高危亞型患者，其特異性為100%，此時(shí)，對(duì)初篩患者的腫瘤活體樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)P16均表達(dá)陽(yáng)性。從而證實(shí)可利用唾液樣本間接篩選出表達(dá)P16的HNSCC和對(duì)治療敏感的患者。同樣，有研究者[79-80]認(rèn)為：利用唾液樣本診斷口咽部鱗狀細(xì)胞癌有較高的特異性（≥90%）。因此，唾液樣本對(duì)于HPV高危型的檢測(cè)結(jié)果可信度較高，有助于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的輔助診斷。

綜上所述，通過(guò)研究病毒感染者唾液中的多種生物標(biāo)志物，研究者發(fā)現(xiàn)：多數(shù)標(biāo)志物不僅能夠經(jīng)過(guò)目前應(yīng)用廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)靈敏檢出，還能根據(jù)其含量的變化等間接判斷疾病的發(fā)生和發(fā)展。除以上病毒外，寨卡病毒（zika virus，ZIKV）、基孔肯亞病毒（chikungunya virus，CHIKV）、其余類型的肝炎病毒等感染后產(chǎn)生的標(biāo)志物都有望在唾液中檢出，從而達(dá)到輔助診斷和監(jiān)測(cè)預(yù)后的目的[81-86]。目前，由于唾液成分動(dòng)態(tài)變化大，采集過(guò)程易被污染造成假陽(yáng)性，導(dǎo)致唾液樣本的檢測(cè)結(jié)果仍然不是以上各種病毒的常規(guī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，當(dāng)單獨(dú)應(yīng)用唾液樣本時(shí)，可考慮隨病情發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行唾液樣本跟蹤檢測(cè)。未來(lái)仍需進(jìn)一步統(tǒng)一唾液采集、保存與檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，設(shè)定診斷相關(guān)疾病標(biāo)志物濃度的閾值等，進(jìn)而提高唾液樣本的臨床應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。