黃曲霉毒素B1 對動物危害作用研究

馬浩海 袁正寧 劉靜 張西鋒

（青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東青島 266109）

1 黃曲霉毒素簡介

1.1 黃曲霉毒素的基本概述

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是一類由曲霉菌屬的真菌，如黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus Niger）、寄生曲霉（Aspergllu parasiticus）等在生長繁殖過程中產(chǎn)并分泌的一類結構相似次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于豆類、花生、玉米等糧食作物以及奶制品、植物油等動植物產(chǎn)品中[1,2]。目前已發(fā)現(xiàn)鑒定的種類多達20 余種，包括黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素B2a（AFB2a）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、黃曲霉毒素M1（AFBM1）、黃曲霉毒素M2（AFM2）、黃曲霉毒素P1（AFP1）、黃曲霉毒素H1、黃曲霉素GM、黃曲霉毒醇等。

1.2 黃曲霉毒素的理化性質

黃曲霉毒素（AFT）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的一種真菌毒素，黃曲霉毒素無色、無味、無嗅，基本結構為二呋喃環(huán)和香豆素（氧雜萘鄰酮）組成，二呋喃環(huán)為基本毒理結構，香豆素則于致癌有關[3]。AF 難溶于水、石油醚、乙醚和己烷，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、氯仿等有機溶劑，分子量為312～346，在弱酸性和中性溶液中穩(wěn)定，在強酸溶液中稍有分解，在pH 9～10 的強堿性環(huán)境中黃曲霉毒素的內(nèi)酯環(huán)被打開毒性消失[4]。因黃曲霉毒素內(nèi)含大環(huán)共軛體系熱穩(wěn)定性極高，分解溫度為237～299℃，其中AFB1分解溫度為268℃。在波長365nm 的紫外光照下AF 可產(chǎn)生熒光，AFB1、AFB2呈現(xiàn)藍色熒光，AFG1、AFG2呈現(xiàn)黃綠色熒光。紫外光照還對低濃度黃曲霉毒素具有一定破壞作用[5]。1993 年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）癌癥研究機構劃定為Ⅰ類天然致癌物，黃曲霉毒素的各種代謝產(chǎn)物的毒性由高到低依次為：AFB1＞AFM1＞AFG1＞AFB2＞AFM2＞AFG2[6]。

1.3 黃曲霉毒素B1 的生物合成、吸收、代謝

黃曲霉毒素的生物合成較為復雜，在合成過程中包括27 個酶促反應，以丙二酰輔酶A 和乙酰CoA 為底物，在聚酮合酶AflC（polyketide synthase，PKS）的催化下形成聚酮骨架，在經(jīng)多步脫氫、加氧等修飾過程最終形成高度氧化的黃曲霉毒素[7]。AFB1進入機體后，通過小腸吸收效率多達50%，經(jīng)門靜脈進入肝臟。經(jīng)Ⅰ相代謝酶細胞色素P450 酶系代謝產(chǎn)生多種產(chǎn)物，如AFM1、AFP1、AFB1-EXO-8，9-環(huán)氧化物（AFBO）等，其中AFBO 是介導肝癌發(fā)生的主要致癌代謝物[8]。AFBO 經(jīng)體內(nèi)Ⅱ相代謝酶代謝而后形成AFB1-GSH，最終以AFB1-硫醇尿酸形式經(jīng)尿液排出[9]，另一部分沒有排除的AFBO 與細胞DNA 形成AFB1-DNA 加合物導致DNA 損傷，誘發(fā)癌癥[10]。

2 黃曲霉毒素B1 的危害

在農(nóng)作物的生長收獲、運輸、貯存及加工過程中均有可能發(fā)生黃曲霉毒素的污染。極易污染的農(nóng)作物包括花生、大米、大豆、食用油等農(nóng)副產(chǎn)品包括動物飼料，并通過食物鏈進入動物性食品中，造成肉、蛋、奶等動物性產(chǎn)品的污染，最終威脅人體健康[11]。黃曲霉毒素對畜禽的毒性大小于攝入量、持續(xù)時間、動物種類、性別、年齡、健康狀態(tài)、生長階段、飼養(yǎng)管理水平等因素相關。在黃曲霉毒素的多種結構中黃曲霉毒素B1的毒性最強，是砒霜的68 倍，氰化鉀的10 倍。AFB1對動物的各組織器官均有毒害作用，主要是通過抑制動物機體內(nèi)蛋白質、酶和有機物的合成及細胞DNA、RNA 的合成干擾，進而干擾各相代謝過程最終造成全身性的傷害。長期攝入AFB1污染的日糧會導致動物免疫、造血和合成分解代謝等功能不同程度的損傷，臨床表現(xiàn)主要有：畜禽精神沉郁、采食量下降、消化吸收功能紊亂、多器官出血、生產(chǎn)性能下降、繁殖障礙，生長遲滯，導致癌變等[12]。

2.1 黃曲霉毒素B1 對畜禽機體的毒性作用

黃曲霉毒素B1對機體的毒害作用包括免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等多方面，研究表明，經(jīng)AFB1處理的小鼠肝臟系數(shù)明顯升高、血清ALT、AST 及造成肝組織氧化損傷，造成肝組織變性、壞死、細胞凋亡[13]。AFB1還可造成小鼠血清白蛋白和總蛋白含量的顯著下降，這側面反映了AFB1影響肝臟內(nèi)蛋白質合成的能力[14]，此外最新的研究表明AFB1誘導的小鼠肝損傷與線粒體功能障礙有關[15]。家禽連續(xù)采食含5mg/kg 的AF 日糧可導致肝臟重量增加，采食量和體重增加（BWG）明顯下降[16]。飼喂3ppm 的AFB1可導致家兔肝組織壞死、增重、平均日增重、飼料轉化率、營養(yǎng)物質消化系數(shù)和氮平衡降低，黃曲霉毒素污染的家兔血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、總膽固醇和甘油三酯水平降低，尿素、肌酐和轉氨酶濃度升高[17]。這些試驗都印證了AFB1對動物肝功能的嚴重損害。長期攝入AFB1還可導致腎臟損傷和腎臟功能變化[18]，飼喂450μg/kg 的AFB1可導致小鼠腎間質充血、腎小管空泡樣變性，腎小管上皮細胞壞死脫落形成管型，血清尿酸、肌酐及尿素氮顯著升高[19]。AFB1還可造成神經(jīng)毒性，研究表明，經(jīng)AFB1處理的人星形膠質細胞增殖受阻，使線粒體去極化、產(chǎn)生氧化應激，此外，AFB1還降低了轉基因斑馬魚胚胎大腦和軸突中gfap、mbp 和olig2 的表達，導致胚胎發(fā)育受阻[20]。研究表明，AFB1暴露大鼠可導致氧化應激和DNA 損傷，具體表現(xiàn)為GSH 顯著降低、FAS 基因mRNA 表達上調(diào)、DNA 片段增加、PHGPx 基因mRNA 表達下調(diào)等[21]。在一項關于圍產(chǎn)期暴露于AFB1的大鼠研究中，研究發(fā)現(xiàn)在斷奶（3 周齡）和停止暴露后進入成年（3 月齡）均有不同程度的損害，包括體重減輕，血脂改變、性激素水平降低等[22]，一些研究還證明，較低的出生體重可能增加成年后患肝臟疾病和原發(fā)性肝癌（HCC）的風險[23]。體外暴露于50uM AFB1可破壞豬卵母細胞成熟，并誘導表觀遺傳修飾、氧化應激和凋亡[24]。體外暴露于40μg/L AFB1后，導致著床前牛胚胎發(fā)育受阻[25]。有調(diào)查顯示在不育男性精液樣本中發(fā)現(xiàn)1.66μg/mL 的AFB1，并且與精子形態(tài)異常及精子濃度和活力降低有關[26]。

2.2 黃曲霉毒素B1 對雄性生殖生理的影響

雄性生殖系統(tǒng)由睪丸、附睪及副性腺及生殖管道共同組成。睪丸是主要的雄性生殖器官，其主要負責精子發(fā)生和性激素合成分泌[27]。哺乳動物睪丸分實質部分和間質部分，實質部分主要由管周肌樣細胞（Myoid cells）、生精細胞（Spermatogenic cells）和睪丸支持細胞（Sertoli cells）組成一個曲細精管。生精細胞從精元干細胞（SSCs）分化形成成熟的功能性單倍體精子，睪丸支持細胞包繞并支持發(fā)育中的各級雄性生殖細胞，睪丸支持細胞間的細胞連接與間質中的毛細血管上皮、結締組織、基膜共同圍繞成血-睪屏障（blood testis barrier，BTB）。血生精小管屏障賦予了細胞形態(tài)和功能的兩極化，創(chuàng)造了有利于精子發(fā)育的獨特微環(huán)境[28]。睪丸間質（Leydig cells）是曲細精管間的結締組織，包括間質細胞、微血管、神經(jīng)纖維、淋巴管、巨噬細胞、成纖維細胞、淋巴細胞和結締組織[29]。睪丸間質細胞是睪丸間質中最主要的成分負責合成分泌睪酮（Testosterone）。

睪丸生理的完整性對于成功產(chǎn)生精子至關重要[30]，但睪丸易受各種外、內(nèi)源性毒物刺激，進而引起組織結構損傷、精子發(fā)生異常，甚至導致雄性生殖功能喪失[31]。AFB1對生殖系統(tǒng)具有較強的毒性作用，其可以穿過BTB，引起睪丸變性和生殖細胞死亡，從而影響精子產(chǎn)量、濃度和運動能力，導致受精過程中激素代謝紊亂。Zamir-Nasta T 等研究表明黃曲霉毒素可導致精母細胞嚴重的DNA 碎片化，導致p21、p53 等凋亡基因過表達，引起細胞周期蛋白D1 和Cdk4 和ERa表達下調(diào)，進而造成細胞周期停滯[32]。Solomon E Owumi 等證明通過連續(xù)口服28d 50μg/kg 及5 和10mg/kg AFB1可誘導大鼠下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamic-pituitary-gonadal axis）失調(diào)，進而導致精子數(shù)量和質量的下降[33]。Anas Ashraf 等在給予白來航公雞更低計量的AFB1（100～400ppb）實驗中檢測到了相同的變化，此外還檢測到睪丸體積減小、壞死，精子發(fā)生部分或完全停止，免疫系統(tǒng)遭到嚴重破壞[34]。Lin LX 等通過給予6 個月大綿羊灌胃1mg/kg AFB1的急性毒性實驗中檢測到睪丸組織的毒素殘留，以及睪丸組織病理學損傷，刺激了睪酮合成相關基因（StAR、3β-HSD、CYP11A1、CYP17A1）和血清睪酮水平的提高，同時伴有氧化應激和細胞凋亡相關物質的分泌，且該實驗觀察到暴露于AFB1的綿羊瘤胃微生物菌群失調(diào)部分菌群相對豐度降低，且于睪酮合成相關基因呈負相關，發(fā)現(xiàn)AFB1可通過改變瘤胃微生物群豐度影響全身循環(huán)進而對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用[35]。

3 黃曲霉毒素B1 的限量標準

在全球黃曲霉毒素的分布呈現(xiàn)一定的季節(jié)性和區(qū)域性，隨著全球化農(nóng)副產(chǎn)品貿(mào)易的發(fā)展其分布的區(qū)域性越來越不明顯[36]。在我國春季溫度高、濕度大的南方地區(qū)污染較為嚴重。在世界范圍內(nèi)也是如此，如美國南部地區(qū)、澳大利亞、亞洲、拉丁美洲和非洲的一些國家普遍存在。鑒于此世界各國和地區(qū)相繼推出了黃曲霉毒素在食品及飼料中的限量安全標準[37]。

4 黃曲霉毒素B1 的檢測方法

食品和飼料中AFB1檢測和分析是確保生產(chǎn)安全和剔除、控制受污染食品及飼料的關鍵環(huán)節(jié)，隨著儀器設備、技術研發(fā)的迭代更新從最初使用的薄層層析法檢測黃曲霉毒素至今已經(jīng)發(fā)展出多種方法，其中最常見的方法使用描述如下。

4.1 免疫學技術

免疫學技術主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、測流免疫層析技術（LFIA）、熒光偏振免疫檢測法（FPIA）。ELISA 是一種常用的檢測大量食品樣本中真菌毒素免疫分析的方法，其原理利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應對樣本中的AFB1定性或定量檢測方法。該方法具有檢出限相對低、特異性強、應用方便等優(yōu)點。LFIA 是利用ELISA 的原理設計的可對特定霉菌毒素進行視覺定性檢測，同時也可使用便攜式光度條讀取器進行半定量檢測。該方法是一種操作簡單、快速、低成本的快速一部篩選工具，可用于現(xiàn)場即使霉菌毒素分析[38]。FPIA 是通過測定溶液中熒光團在樣品中游離黃曲霉毒素與標記的黃曲霉毒素中的比率間接測定毒素的定量檢測[39]。FPIA 需要專用的熒光偏振測定儀，靈敏度較差，但相比于ELISA 和LFIA速度更快，無需分離和洗滌方法，可作為測定糧食中總AFT 含量的初篩方法[40]。

4.2 色譜技術（CTs）

色譜技術是一種廣泛應用于化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等學科領域重要的分離分析技術，其分離分析效果好，結果高度精確、靈敏，是目前最廣泛應用于食品和飼料樣品中霉菌毒素定量分析的技術，其結果的精確、靈敏也用去驗證其他方法的有效性[41]。其中薄層層析法（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）是分析樣品黃曲霉毒素含量的常用方法，目前在國內(nèi)使用的比較廣泛。HPLC 結合紫外（UV）和質譜（MS）檢測器以及減少柱填料的UHPLC 檢測技術也已經(jīng)被應用[42]。通過將液相色譜技術與質譜聯(lián)用，霉菌毒素的分析得到了極大的進步[43]。在所有未使用質譜的色譜技術中，HPLC-FLD 結合有效的提取和凈化法方法經(jīng)常用于真菌毒素的定量分析，尤其是AFs。

4.3 生物傳感器和納米技術

與上述傳統(tǒng)技術先比，生物傳感器方法已經(jīng)被證實在食品霉菌毒素檢測中具有快速、高靈敏度、便攜、實時檢測能力和成本低高效益等潛力[44]。例如將金/銀納米顆粒（Au/Ag NPs）、碳基納米顆粒（CBN）、磁性納米顆粒（MNPs）、量子點（QDs）等新型納米材料與傳統(tǒng)檢測方法結合，開發(fā)出高靈敏度、快速的新型檢測方法，作為多重分析和納米跟蹤系統(tǒng)的微/納米傳感器技術，作為食品跟蹤的微/納米系統(tǒng)，電化學免疫傳感器、微陣列等新型技術都已經(jīng)被使用[45,46]。

5 黃曲霉毒素B1 的脫毒技術

目前在霉菌毒素污染的治理中，正在實行許多策略來預防或消除污染，預防霉菌毒素的污染是目前公認的首要控制措施。治理措施分為收獲前和收獲后技術，收獲前主要策略包括轉基因作物、作物輪作和選擇合適的種植時機，收貨后可采用包裝、干燥、使用防腐劑等，這些方法可以作為預防策略，但在防治污染方面并不奏效，因此開發(fā)和應用在收獲后受污染食品及飼料的解毒策略及技術變得尤為重要[47]。這就包括物理方法、化學方法及生物學/生物添加劑等方法。

5.1 物理脫毒技術

物理脫毒技術對AFB1污染去除方法主要包括分離，洗滌、溶劑萃取、加熱、輻照和吸附等技術。最常用的是加熱與γ 射線照射，通過劇烈的加熱有效地去除黃曲霉毒素。Arzandeh S 等[48]研究表明，150℃加熱12min 可以去除大量AFB1，降解效率達78.4%±4.80。Prado G 等[49]利用Y 射線照射（60Co）照射食品（電離范圍在6-60kGy）可破壞AFB1，在10kGy的輻射劑量下花生樣品中霉菌生長可被完全抑制，同時在15、20、25 及30kGy 的劑量下足以將AFB1破壞55%～74%。此外在飼料中添加一些吸附劑，可明顯減少動物對霉菌毒素的吸收，降低毒性。物理方法去除飼料中的霉菌毒素或防止毒素吸收效果較好，但也存在諸多問題，如物理脫毒可能會影響飼料品質、改變適口性、破壞營養(yǎng)成分，存在安全使用問題。

5.2 化學脫毒技術

化學脫毒法的原理是通過水解、氧化、還原等某種化學反應來破壞霉菌毒素的化學結構來起到脫毒的效果。以證明具有良好脫毒效果的化學試劑種類較多，例如銨鹽或氨氣、酸性電解水（AcEW）、臭氧、腐殖酸鈉等。腐殖酸鈉是一種有機化合物具有較強的絡合力和螯合力，葉盛群發(fā)現(xiàn)在體外模擬動物胃腸道環(huán)境中腐殖酸鈉對AFB1的具有一定的脫毒效果，且結合穩(wěn)定[50]。Geovana D 等[51]研究表明，在試驗筒倉小麥中通入40～60mg/L 的臭氧30～180min 黃曲霉毒素降解效率高達81%～95%。酸性電解水（AcEW）是將低濃度的NaCl 溶液（＜0.1%）加入水中通過電解制成的消毒劑（曹授俊等，2016）。Qian Zhang 等[52]研究表明AcEW 對天然污染花生中AFB1的清除率高達85%，同時對花生中的營養(yǎng)成分影響較小。氫氧化銨或氨氣可改變AF 的化學結構，從而起到脫毒效果[53]。在現(xiàn)代脫毒技術的選擇上，化學脫毒法并不是很好的選擇，主要原因是化學試劑成本高、加入食品或飼料中可能會破壞某些營養(yǎng)成分，且化學脫毒試劑對不同飼料原材料的反應效果是不同的，某些有機化學試劑還具有腐蝕性，在進行脫毒時還要根據(jù)原材料的性質來選擇脫毒試劑等問題，同樣限制了其在實際生產(chǎn)中的應用。

6 小結

在農(nóng)作物的生長收獲、運輸、貯存及加工過程中均能可能發(fā)生黃曲霉毒素B1的污染。極易污染的農(nóng)作物包括花生、大米、大豆、食用油農(nóng)副產(chǎn)品包括動物飼料，并通過食物鏈進入動物性食品中，最終威脅人體健康。黃曲霉毒素B1對畜禽的毒性大小于攝入量、持續(xù)時間、動物種類、性別、年齡、健康狀態(tài)、生長階段、飼養(yǎng)管理水平等密切相關。該文綜述了黃曲霉毒素B1的基本概述、理化性質、對畜禽機體和雄性生殖生理的危害作用、以及限量標準和脫毒方法，以期為制定更嚴格的限量標準、研制更有效的降解途徑和方式提供參考。