白芷美白凝膠的制備及其體外透皮吸收

朱琪，程紅稜，譚敏慧，王曉慧，曾立

(邵陽學(xué)院 藥學(xué)院，湖南 邵陽，422000)

白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根,具有美白、散風(fēng)除濕、通竅止痛的功效[1]。白芷中主要成分為香豆素類化合物，其中歐前胡素可能是白芷發(fā)揮美白功效的活性成分之一[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，白芷能消除色素在組織中的過度堆積，能治療黃褐斑、白癜風(fēng)、痤瘡等多種皮膚病[3]。白芷醇提物對(duì)酪氨酸酶有較好的抑制作用[4-5]。

凝膠劑具有緩釋的特點(diǎn)，給藥次數(shù)少、峰谷血藥濃度波動(dòng)小、安全、外觀晶瑩透亮，無油膩感，易清洗，使用方便，因此受到使用者們的喜愛。傳統(tǒng)中藥因成分復(fù)雜，劑量難以控制，可能會(huì)不同程度地影響制劑的透皮吸收從而降低藥物療效。

本試驗(yàn)將使用白芷醇提物為原料制備白芷凝膠，以乳膏為對(duì)照，在優(yōu)化促滲劑的前提下制備白芷美白凝膠和乳膏。采用Franz擴(kuò)散池，結(jié)合小鼠離體皮膚為透皮屏障，考察含不同促滲劑(2%丙二醇、2%月桂醇氮酮、2%薄荷醇)的凝膠和乳膏在規(guī)定時(shí)間內(nèi)單位面積透皮吸收累積滲透量Q24的差異。

1 材料與方法

1.1 儀器

Spectrumlab 752Pro 紫外可見分光光度計(jì)；CP214 電子分析天平(奧豪斯(常州)有限公司)；ZTY智能透皮吸收試驗(yàn)儀TP2A(鞏義市英峪予華儀器廠)；KQ-500B超聲波清洗機(jī) (昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

白芷飲片(市售，購于邵陽市飲片廠)；歐前胡素對(duì)照品(濟(jì)寧天之藍(lán)生物科技有限公司，批號(hào)20190126)；卡波姆940(浙江一諾生物科技有限公司，批號(hào)20190312)；甲醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180624)；三乙醇胺(西隴科學(xué)化工有限公司，批號(hào)20190324)；月桂醇氮酮(上海山浦化工有公司，批號(hào)20190422)；桉葉油(湖北康純香料有限公司，批號(hào)20190122)；薄荷油(湖北康純香料有限公司，批號(hào)20190302)；水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，體重(20±2) g，購自湖南斯萊克景達(dá)試驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004。

1.4 方法

1.4.1 白芷中歐前胡素的提取

稱取白芷飲片(60 ℃恒溫干燥后碾成粉末，過40目篩)100 g，置于圓底燒瓶中，加入75%乙醇1 500 mL，超聲(50 Hz，100 W)20 min，60 ℃～70 ℃回流提取30 min，趁熱減壓過濾，合并濾液，旋蒸至無醇味，繼續(xù)濃縮至100 mL，即為白芷歐前胡素初提液，4 ℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.4.2 白芷凝膠和乳膏的制備

1.4.2.1 白芷凝膠的制備

稱取卡波姆940 1.0 g，均勻分散于48 mL蒸餾水中，使其充分濕潤后加入磷酸緩沖鹽溶液(pH 6.8)4 mL，加入1 %尼泊金乙酯甲醇液作為防腐劑，加入2 %的月桂醇?xì)渫贊B劑，充分?jǐn)嚢?，三乙醇胺調(diào)整 pH 至 6.0～6.8，溶脹過夜，得到凝膠基質(zhì)。取白芷歐前胡素初提液10 mL，加入75%乙醇溶液50 mL溶解。與凝膠基質(zhì)等量混合得到凝膠。

1.4.2.2 乳膏的制備

取白芷歐前胡素初提液10 mL，按照乳劑的制備方法，做成O/W型乳膏100 g。

1.4.2.3 制備方法

1.4.2.3.1 色譜條件

以0.01 moL/L的鹽酸甲醇溶液為空白對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)溶液在紫外分光光度計(jì)上200～400 nm 處掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.4.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取歐前胡素對(duì)照品5 mg，配制成50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液100 mL。精密量取儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL用甲醇溶液稀釋10倍，得到5～25 μg/mL五個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，甲醇溶液為空白，在最大吸收波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度A。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸后得到回歸方程。

1.4.2.3.3 精密度試驗(yàn)

配制得到低、中、高濃度(5、10、25 μg/mL)的歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄吸光度，計(jì)算日內(nèi)、日間RSD。

1.4.2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

移取準(zhǔn)確配制的濃度一定的樣品溶液1 mL，按50%、100%、150%的比例加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照含量測(cè)定的方法，記錄吸光度，計(jì)算回收率和RSD值。

1.4.2.3.5 含量測(cè)定

白芷歐前胡素初提液1 mL，稀釋到標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)，記錄稀釋倍數(shù)，在最大吸收波處測(cè)量吸光度。按公式(1)計(jì)算白芷中歐前胡素的含量。

白芷中歐前胡素的含量=A×C×V

(1)

其中，A為吸光度；C為供試液的濃度；V為供試液定容后體積。

1.4.3 不同促滲劑對(duì)透皮吸收累積滲透量的影響

1.4.3.1 制備含不同促滲劑的凝膠

按1.4.2.3的制備方法分別制備4份凝膠50 g，其中1份為空白組，其余3份按試驗(yàn)要求分別取1.0 g月桂醇氮酮、1.0 g桉葉油、1.0 g薄荷油加到上述含藥凝膠中，得到含有2%月桂醇氮酮、2%桉葉油、2%薄荷油3種不同促滲劑的凝膠。置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.2 離體皮膚的制備

小鼠斷頸處死，用脫毛劑(硫化鈉)對(duì)小鼠腹部進(jìn)行脫毛處理，剪下小鼠腹部皮膚，剝離脂肪組織及乳液組織，不傷角質(zhì)層，將皮膚用新鮮生理鹽水沖洗干凈，4 ℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.4.3.3 體外透皮吸收試驗(yàn)

用改良 Franz 擴(kuò)散裝置[6-7]，將小鼠皮膚固定在給藥池與接受池之間，擴(kuò)散池有效滲透面積為2.80 cm2，角質(zhì)層面向供給室，真皮層面向接收室。稱取樣品劑1 g，置于給藥池中，在大小相同的離體鼠皮上涂勻。將上下兩室固定，恒溫(37±0.5) ℃下持續(xù)攪拌，并分別于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0 h后取2.0 mL接收液，同時(shí)補(bǔ)足同溫、等體積接收液，接收液離心，取上清液微孔濾膜過濾，濾液按給定的色譜條件測(cè)定吸收度，按照公式(2)計(jì)算單位面積累積滲透量Q[8]。

(2)

其中,Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度；V為接收池的體積;S為有效擴(kuò)散面積。

單位面積累計(jì)滲透率K=[Q/m]×100%

其中，m為1 g凝膠中歐前胡素的量。

1.4.3.4 含不同促滲劑的凝膠透皮吸收累積滲透量的測(cè)定

取含不同促滲劑(丙二醇、薄荷醇、月桂醇氮酮，濃度均為2%)的凝膠，以不含促滲劑的凝膠為對(duì)照，考察不同促滲劑對(duì)美白有效成分經(jīng)皮滲透的影響。

1.4.3.5 凝膠與乳膏體外透皮吸收累積滲透量比較

使用優(yōu)選的促滲劑分別制備凝膠和乳劑，按照體外透皮吸收試驗(yàn)方法對(duì)凝膠和乳劑在不同時(shí)間內(nèi)單位面積投皮吸收累積滲透量進(jìn)行比較。

1.4.3.6 曲線擬合

使用OriginPro 8.0軟件做Q-t的零級(jí)、一級(jí)、Higuchi模擬擬合，判斷體外透皮吸收是否符合釋藥規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按2.3.1之方法掃描得最大吸收波長(zhǎng)為304 nm；歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在5～25 μg/mL范圍內(nèi)，線性回歸方程為吸光度=0.043濃度+0.649 8，R2=0.999 1。

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。日內(nèi)RSD為0.27～0.48%，日間RSD為0.14%。

2.3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。平均回收率為100.66%～100.77%，RSD為0.06%～0.27%。

表2 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.4 歐前胡素的含量測(cè)定

歐前胡素的含量測(cè)定結(jié)果見表3。歐前胡素初提液的含量為13.02 μg/mL，RSD為1.30%。

表3 歐前胡素初提液的含量測(cè)定(n=3)

2.5 不同促滲劑對(duì)透皮吸收累積滲透量的影響

不同促滲劑對(duì)透皮吸收累積滲透量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同促滲劑單位面積體外透皮吸收累積滲透量比較

從圖1可知，3種促滲劑對(duì)凝膠均有不同程度的促滲作用，其中,2%月桂醇氮酮的促滲效果最佳。

2.6 白芷凝膠與乳膏體外透皮吸收累積滲透量比較

優(yōu)選2%的月桂醇氮酮作為凝膠與乳膏的促滲劑，并對(duì)凝膠與乳劑在不同時(shí)間內(nèi)單位面積透皮吸收累積滲透量進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2。

圖2 不同時(shí)間內(nèi)凝膠與乳膏單位面積透皮吸收累積滲透率

由圖2可知，凝膠與乳膏透皮吸收均良好；前8 h，乳膏單位面積累計(jì)滲透率與凝膠單位面積累計(jì)滲透率基本平行，凝膠略高，說明兩者的速釋性能相似。8 h之后凝膠單位面積累計(jì)滲透率仍然處于逐步上升的趨勢(shì)，凝膠單位面積累計(jì)滲透率由8 h處的55.83%逐步上升為36 h處的81.11%，36 h后沒有繼續(xù)考察，說明凝膠的緩釋功效明顯高于傳統(tǒng)劑型乳膏。

2.7 曲線擬合結(jié)果

白芷美白凝膠的體外透皮吸收符合零級(jí)、一級(jí)釋放規(guī)律，并與Higμchi方程高度擬合(表4)。

表4 白芷美白凝膠體外釋放方程擬合結(jié)果

3 討論

歐前胡素(C16H14O4)為線型呋喃香豆素類化合物，其結(jié)構(gòu)中含有不穩(wěn)定的雙鍵(美白的主要活性成分)和內(nèi)酯鍵，為熱不穩(wěn)定物質(zhì)。超聲輔助-乙醇提取的方法，由于提取時(shí)間短，最大程度地保護(hù)了化學(xué)物質(zhì)，提高了歐前胡素的收得率。

卡波姆是含羧基的高分子聚合物，其性質(zhì)不穩(wěn)定，使用三乙醇胺調(diào)整pH近中性，被中和成羧基離子化后，由于負(fù)電荷的相互排斥作用，使分子鏈彌散伸展，相互連接形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，藥物能填充在其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中[9]，通過形成的凝膠層(儲(chǔ)藥庫)控制藥物的緩慢釋放，起到延長(zhǎng)作用時(shí)間的緩釋效果。

經(jīng)皮制劑的透皮吸收受生物因素、藥物的理化因素、劑型因素的影響，使藥物呈現(xiàn)個(gè)體、劑型等差異[10]。白芷美白凝膠中使用2%月桂醇氮酮作為促滲劑能在皮膚角質(zhì)層與脂質(zhì)相互作用下，使藥物在角質(zhì)層中的擴(kuò)散阻力減少，流動(dòng)性增強(qiáng)，縮短藥物的起效時(shí)間，起到速效的作用。