高效液相色譜法在中藥成分定量分析中的研究進(jìn)展*

梁雨彤，戴臨風(fēng)，郭瑞怡，馬雪晴，鄭莘櫟，馮月男

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，黑龍江 哈爾濱 150040；

3.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱，150036）

前 言

高效液相色譜法（HPLC）是一種早在20世紀(jì)60年代末期被科學(xué)家們所研究發(fā)明，自1971年開(kāi)始崛起的分離分析技術(shù)[1]，近幾十年迅速發(fā)展。相比于經(jīng)典氣相色譜法與經(jīng)典液相色譜法，HPLC具有高效，高準(zhǔn)確度，高靈敏性的特征，可以大大縮短分析的周期?，F(xiàn)今，中藥作為現(xiàn)今中國(guó)的研究重點(diǎn)，不僅成分龐雜，而且多種成分作用機(jī)制與療效復(fù)雜。HPLC是中藥類(lèi)制劑在質(zhì)量檢驗(yàn)中常用的一種方法，能夠準(zhǔn)確判定中藥制劑質(zhì)量是否符合標(biāo)準(zhǔn)以及中藥穩(wěn)定性的高低，因此高效液相色譜法測(cè)定中藥制劑有效成分含量是確保中藥制劑質(zhì)量的重要方法之一，對(duì)于中藥成分的分析起到了重要的作用，并且HPLC被廣泛應(yīng)用于中藥分離、純化中。從最新頒布實(shí)施的《中國(guó)藥典》2020年版來(lái)看，一部、二部采用HPLC法的品種分別占總數(shù)的66%和72%。由此得出，當(dāng)前HPLC法已成為《中國(guó)藥典》中最常用的檢測(cè)方法[2]。而目前關(guān)于HPLC應(yīng)用于中藥的綜述卻很少。筆者通過(guò)查閱近十年的文獻(xiàn)對(duì)HPLC應(yīng)用于中藥領(lǐng)域進(jìn)行全面的綜述。

1 高效液相色譜法的原理

HPLC原理為通過(guò)高壓輸液系統(tǒng)將多種流動(dòng)相帶入到色譜柱中，因?yàn)闃悠分械牟煌煞衷诠潭ㄏ嘀芯哂胁煌姆峙湎禂?shù)，在流動(dòng)相與固定相中進(jìn)行多次的吸附與解吸歷程，以單個(gè)組分的形式通過(guò)不同類(lèi)型的檢測(cè)器和現(xiàn)代數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可視化地變?yōu)閳D譜數(shù)據(jù)供研究者們所參考。根據(jù)固定相和流動(dòng)相的不同特性可分為不同的分離模式。更需注意的是，選擇合適的分離模式和不同的檢測(cè)器是實(shí)驗(yàn)研究成功至關(guān)重要的一步。

1.1 高效液相色譜法的分類(lèi)及其原理

目前主流的高效液相色譜主要分為以下幾類(lèi)：液-液分配色譜法，液-固吸附色譜法，離子交換色譜法，離子色譜法，離子對(duì)色譜法和空間排阻色譜法。其中有四類(lèi)已被廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究中：液-液分配色譜法主要根據(jù)被分離物質(zhì)的溶解度不同，從而達(dá)到分離的目的；液-固吸附色譜是根據(jù)兩種不相溶的溶液之間的分配系數(shù)不同來(lái)進(jìn)行分離，是目前應(yīng)用最廣泛的分離模式；離子交換色譜法根據(jù)被分離組分離子交換能力的差別而實(shí)現(xiàn)分離的目的；空間排阻色譜法根據(jù)分子的大小進(jìn)行篩選分離。

1.2 高效液相色譜法在中藥中的應(yīng)用原理

由于中藥中的許多復(fù)雜的天然產(chǎn)物如生物堿、黃酮、香豆素、甾體、皂苷、蒽醌等成分，在中藥中含量很少且相對(duì)分子質(zhì)量較大，HPLC具有操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度、靈敏度和重現(xiàn)度高的優(yōu)點(diǎn)，可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，節(jié)約成本等目的。目前為止，在中藥的成分分析與分離中，應(yīng)用最廣泛的是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相（C18），以一定比例的甲醇-水或乙腈-水為流動(dòng)相的反向高效液相色譜法（RP-HPLC）。

2 高效液相色譜法在中藥成分中的應(yīng)用

中藥產(chǎn)品品種極為復(fù)雜，HPLC可通過(guò)分離對(duì)中藥有效成分進(jìn)行定量的分析。針對(duì)于中藥指紋圖譜的應(yīng)用、中藥成分的鑒定、測(cè)定等方面的應(yīng)用筆者進(jìn)行了綜述。與此同時(shí)，針對(duì)于不同的聯(lián)用手段，對(duì)于中藥的質(zhì)量控制與成分分析方面都做出了卓越的貢獻(xiàn)也進(jìn)行了分析。

2.1 HPLC在中藥指紋圖譜中的應(yīng)用

中藥指紋圖譜針對(duì)產(chǎn)地、種植條件等多種因素不同的同種中藥提供了很大的包含性，對(duì)不同影響因素提供了參考，為后續(xù)的中醫(yī)藥生產(chǎn)、質(zhì)量分析等方面有很大的實(shí)用意義。由于提取物質(zhì)量有所參差,缺乏規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，企業(yè)在使用時(shí)面臨較大的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，因此建立一種準(zhǔn)確、全面的內(nèi)控質(zhì)量評(píng)價(jià)方法尤為關(guān)鍵。可以通過(guò)已知的指紋圖譜，利用實(shí)驗(yàn)中有效成分的重現(xiàn)性對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。因此，HPLC在中藥成分分析中提供了重要依據(jù)。王書(shū)云[3]等建立了五味子的指紋圖譜，通過(guò)對(duì)中藥指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)，對(duì)五味子的15批樣品進(jìn)行了HPLC分析，質(zhì)量評(píng)測(cè)，并后續(xù)應(yīng)用于五味子藥材的成分鑒別和質(zhì)量控制。賈瑋娟[4]等對(duì)不同來(lái)源的豬苓藥材及飲片樣品進(jìn)行分析，首次將HPLC特征圖譜與指紋圖譜相結(jié)合，應(yīng)用于豬苓真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)控，為建立系統(tǒng)完善的豬苓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了新方法。郭秀潔[5]等通過(guò)酸棗仁水提物HPLC定量指紋圖譜方法,共標(biāo)定了8個(gè)共有峰，與此同時(shí)，運(yùn)用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析和超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜得到了10種成分的半定量與定量數(shù)據(jù)?，F(xiàn)今，關(guān)于復(fù)方中藥的指紋圖譜也開(kāi)始投入研究，為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制做出了貢獻(xiàn)。夏姍[6]等運(yùn)用HPLC建立了茵芪肝復(fù)顆粒的指紋圖譜，同時(shí)，利用其指紋圖譜可以針對(duì)關(guān)鍵成分進(jìn)行質(zhì)量控制。汪冰[7]等對(duì)小兒解表口服液建立了HPLC的特征圖譜，并著重進(jìn)行4種主要成分含量測(cè)定。

2.2 HPLC在中藥成分鑒定與測(cè)定中的應(yīng)用

2.2.1 中藥的某一成分進(jìn)行成分含量測(cè)定

HPLC通過(guò)中藥的色譜峰高或色譜面積的參考與對(duì)比，可以進(jìn)行含量的測(cè)定。某些藥材之間的成分間可進(jìn)行互相轉(zhuǎn)化，在不了解轉(zhuǎn)化率的情況下，可對(duì)其成分進(jìn)行鑒定并對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定；也可以用于區(qū)別不同產(chǎn)地或不同生產(chǎn)方式對(duì)藥材的質(zhì)量影響程度。根據(jù)2005年《中國(guó)藥典》中[8]以烏藥醚內(nèi)酯作為鑒定烏藥的有效成分并進(jìn)行了鑒定與測(cè)定。余翠琴[9]等人利用高效液相色譜法更加快速，簡(jiǎn)便地測(cè)定了烏藥醚內(nèi)酯成分在0.051～2.55μg時(shí)與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。HPLC可以放大某些特性的研究，宋艷秋[10]等人應(yīng)用HPLC研究中藥葛根的微生物轉(zhuǎn)化菌株，通過(guò)對(duì)比轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的圖譜，得出了菌株YM3207對(duì)中藥葛根發(fā)生了種類(lèi)和量的變化，并且葛根素含量有明顯的提高。Nguyen Huy Truong[11]等人運(yùn)用HPLC-UV/CAD測(cè)定越南人參中皂苷的含量，提供了目前缺少的人工養(yǎng)殖后的V G皂苷含量這一重要質(zhì)量指標(biāo)的資料。趙新紅[12]等對(duì)于不同中藥中的蛇床子素運(yùn)用水相為0.05%磷酸水溶液進(jìn)行了含量測(cè)定，相比于《中華人民共和國(guó)藥典》2015版（一部）運(yùn)用乙醇溶解、超聲處理的方法[13]更為節(jié)約時(shí)間，節(jié)省材料。

2.2.2 中藥中的多種成分進(jìn)行成分含量測(cè)定

余靜[14]等采用了HPLC-U V-M S聯(lián)用技術(shù)對(duì)刺五加藥材水溶性和脂溶性成分進(jìn)行了指紋圖譜的研究，在脂溶性成分指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)有10個(gè)峰是共有的，并很穩(wěn)定，為共有指紋峰。M S譜圖為HPLC補(bǔ)充了更多有關(guān)化合物的信息，擁有了更全面的參考。呂金麗[15]等運(yùn)用HPLC測(cè)定了不同產(chǎn)地銀杏葉中同種成分的含量測(cè)定，并證實(shí)黃酮醇苷與雙黃酮成分含量存在差異。Li Yanan[16]等運(yùn)用QuEChERS萃取-高效液相色譜法測(cè)定并分離出滑桃樹(shù)中三種美登素類(lèi)生物堿。Khan Javed[17]等運(yùn)用HPLC分離并測(cè)定出堿蓬植物中6種可能的化學(xué)成分并對(duì)不同部位的化學(xué)成分的抗氧化活性研究，得出了相關(guān)切實(shí)可靠的結(jié)果。肖丹[18]等運(yùn)用HPLC-DAD和《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）建立19批不同產(chǎn)地鐵線(xiàn)蕨藥材（S1～S19）的指紋圖譜，得出了有效成分的差異，為藥材的質(zhì)量控制方面提供了參考。由于2020年版《中國(guó)藥典》中尚未收載趕黃草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不具有專(zhuān)屬性，所以史鵬杰[19]等運(yùn)用HPLC針對(duì)趕黃草中四種有效成分進(jìn)行了鑒定，為此類(lèi)藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了參考。

2.2.3 應(yīng)用聯(lián)用技術(shù)對(duì)中藥進(jìn)行成分含量測(cè)定

盡管HPLC對(duì)于定量方面有極大的優(yōu)勢(shì)，其在定性領(lǐng)域的劣勢(shì)需被攻克，可通過(guò)與其他分析技術(shù)聯(lián)用，如飛行時(shí)間質(zhì)譜(T O F-M S)、核磁共振(NMR)等。其中與其它的采用分散液-液微萃取法（DLLME）與HPLC-UV聯(lián)用的分析方法，可用于同一植物中的同分異構(gòu)的同時(shí)測(cè)定與分離。Y.hao[20]等人通過(guò)此聯(lián)用技術(shù)已對(duì)白花蛇舌草與枇杷中兩種三萜酸進(jìn)行了富集與測(cè)定。其中高效液相色譜法可以通過(guò)選擇不同的檢測(cè)器，應(yīng)用于中藥植物中不同部位主要成分的測(cè)定、中藥相關(guān)成分的測(cè)定、中藥提取物成分的測(cè)定等等方面。如楊曉博[21]等測(cè)定了山楂葉中9種酚類(lèi)的成分在2～500μg/mL之間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系、羅珂[22]等人定量分析了銀杏中不同位置的單組份雙黃酮，并證實(shí)了4種成分在各自范圍內(nèi)均有良好的線(xiàn)性關(guān)系。張敏敏[23]等人使用離線(xiàn)2D-HPLC-DPPH-ESI-Q-TOF/M S聯(lián)用技術(shù)對(duì)金銀黃抗氧化成分進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選，并初步鑒定出了12種活性成分，且12種以有機(jī)酸類(lèi)為主，并含有部分黃酮類(lèi)成分等。Gao Dan[24]等對(duì)于廢棄的葛根根莖中的有效成分運(yùn)用HPLC-PDA-ESI-MS/MS方法測(cè)定了鑒定出12種化合物，電子分析表明，其主要成分葛根素和大豆苷元可作為抗色素制劑。

2.3 HPLC在中藥復(fù)方藥成分測(cè)定中的應(yīng)用

中藥的成分本就復(fù)雜多變，而復(fù)方藥的有效成分并不是中藥有效成分的簡(jiǎn)單疊加。不同的配伍規(guī)律對(duì)應(yīng)的是截然不同的成分變化。中藥方劑的復(fù)雜性取決于組成方劑的藥物的組分的復(fù)雜性及各成分相互關(guān)系的復(fù)雜性，也關(guān)于方劑與人體相互關(guān)系的復(fù)雜性[25]。其有效成分的變化與生物活性物質(zhì)的鑒定也是今后的研究方向之一。敖立實(shí)[26]等運(yùn)用高效液相法測(cè)定了黃芩、大黃的含量來(lái)控制黃連解毒丸的質(zhì)量。蘇園[27]等運(yùn)用了HPLC鑒定了雙腎活血膠囊中藥中丹參酮ⅡA的測(cè)定分析。谷娜[28]等運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)復(fù)方樟腦搽劑中苯酚的含量進(jìn)行了測(cè)定，并測(cè)定苯酚的線(xiàn)性范圍為4.51～112.8μg/mL；周媛[29]等對(duì)婦炎消顆粒中的中芍藥苷進(jìn)行了定量測(cè)定；劉養(yǎng)清[30]等運(yùn)用水提蒸干醇溶法和反高效液相色譜法（R P-HPLC）針對(duì)關(guān)木通與其不同的配伍中藥馬兜鈴酸A的含量進(jìn)行了測(cè)定，證明關(guān)木通與不同中藥配伍后馬兜鈴酸A含量均有著不同程度的降低，得到了趨利避害的研究目的。張俊杰等[31]運(yùn)用了HPLC法通過(guò)對(duì)比法測(cè)定肝膽消炎片和熱感顆粒中綠原酸、黃芩苷的含量，為制劑的質(zhì)量控制提供了幫助。

3 高效液相法在中藥研究中的應(yīng)用前景

隨著中醫(yī)藥科學(xué)在國(guó)內(nèi)及國(guó)際地位的提升與中藥的廣泛應(yīng)用，使得中藥有效成分的已知性和精準(zhǔn)用藥方面的研究有所突破。與此同時(shí)，在中藥的研究中，傳統(tǒng)方法與新方法的有機(jī)融合必須有所突破。近年來(lái)，高效液相色譜由于其靈敏度高和選擇性好及廣泛的適用性，可對(duì)提取物中的已知、未知結(jié)構(gòu)的成分及其代謝物進(jìn)行定量分析，因此與質(zhì)譜聯(lián)用可對(duì)中藥成分及其生物樣品進(jìn)行定量分析，使其在中藥的研究中得以更廣泛的應(yīng)用，為加快尋找先導(dǎo)化合物提供了一種高效、切實(shí)可行的分析方法。高效液相法在搭配不同的檢測(cè)器、不同的分離模式和運(yùn)用聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)均擴(kuò)大了HPLC在中藥分析方面的應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷更新，HPLC的適用范圍和分離程度、分析精度都會(huì)有提升，在中藥指紋圖譜的建立，中藥成分的鑒定與測(cè)定，中藥及其復(fù)方藥的質(zhì)量檢驗(yàn)，中藥新型成分的發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域均擁有廣泛的應(yīng)用前景。