Mdm2過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)ALK陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌克唑替尼耐藥的實(shí)驗(yàn)研究

劉嘉欣，李?yuàn)檴?，?棟，呂鏜烽，印 潔，宋 勇，葉明翔

210002 南京，東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

2007年日本科學(xué)家Hiroyuki Mano從1例晚期肺腺癌患者腫瘤組織中克隆出EML4-ALK融合基因，該融合基因包含了間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)結(jié)構(gòu)域，可持續(xù)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，具有使細(xì)胞惡變的能力[1]。除了EML4-ALK，從肺癌組織中還鑒定出KIF5B-ALK、TFG-ALK、NPM3-ALK等融合形式，但不論是何種融合類型，這些肺癌組織都高表達(dá)ALK且ALK蛋白發(fā)生自動(dòng)磷酸化(auto-phosphorylation)，使用特異性抗體可檢出ALK融合蛋白[2-3]。3%～5% 非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)發(fā)生ALK基因融合，稱為ALK陽(yáng)性NSCLC，這部分患者對(duì)ALK靶向治療藥物(例如克唑替尼，阿來(lái)替尼，布加替尼等)敏感。研究表明克唑替尼(Crizotinib)一線治療ALK陽(yáng)性NSCLC的有效率達(dá)74%，顯著優(yōu)于含鉑兩藥方案靜脈化療(45%)，疾病無(wú)進(jìn)展期(progression-free survival，PFS)明顯延長(zhǎng)(10.9個(gè)月vs.7.0個(gè)月)，克唑替尼組患者1年生存率高達(dá)84%[4]。因此ALK靶向藥物推薦用于ALK陽(yáng)性NSCLC標(biāo)準(zhǔn)一線治療。

不幸的是大部分ALK陽(yáng)性NSCLC患者在克唑替尼靶向治療10個(gè)月后產(chǎn)生獲得性耐藥(acquired resistance)，相關(guān)耐藥機(jī)制包括ALK激酶結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變(C1156Y，L1196M)，ALK擴(kuò)增，EGFR和c-kit旁路活化等[5-6]，前者可以通過(guò)升級(jí)ALK靶向藥物(色瑞替尼，阿來(lái)替尼，勞拉替尼)進(jìn)而克服耐藥，聯(lián)合EGFR和c-kit靶向藥物則可逆轉(zhuǎn)旁路途徑引起的耐藥。然而，仍有30%患者耐藥機(jī)制尚未明確，這些患者缺少有效的治療方案，生活質(zhì)量迅速惡化，預(yù)后較差。故探究未知的ALK靶向耐藥機(jī)制一直是基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

鼠雙微體基因2(murine double minute 2，Mdm2)定位于12q13-14，編碼分子量90kD的Mdm2蛋白。Mdm2蛋白主要在胞漿和細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，通過(guò)降解p53等細(xì)胞周期蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。骨肉瘤、軟組織肉瘤、卵巢癌、淋巴瘤、胃癌、NSCLC等實(shí)體瘤中通?？梢詸z出Mdm2高表達(dá)，并且Mdm2表達(dá)水平和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力正相關(guān)，Mdm2高表達(dá)的腫瘤患者生存期短，提示Mdm2是驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞惡性表型的重要因子，目前亦開(kāi)發(fā)出處于臨床研究階段的Mdm2抑制劑Nutlin-3，與化療聯(lián)合用于治療晚期惡性腫瘤患者[8-9]。然而Mdm2對(duì)ALK靶向治療敏感性的調(diào)控作用仍不甚清楚，Mdm2過(guò)表達(dá)能否導(dǎo)致耐藥表型亟待明確。因此，本研究擬使用MTT、平板克隆、TUNEL染色等多種實(shí)驗(yàn)方法，探究Mdm2 過(guò)表達(dá)在H3122細(xì)胞中對(duì)ALK靶向治療敏感性的影響，采用Western blot實(shí)驗(yàn)初步探究其導(dǎo)致耐藥的分子機(jī)制，以期為ALK靶向治療耐藥后藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640、胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，克唑替尼購(gòu)自Selleck公司，MTT、DMSO購(gòu)自Sigma 公司，吉姆薩染液購(gòu)自碧云天公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自諾唯贊公司， p-ALK、ALK、p-Akt、Akt、pErk、Erk、E-cadherin、Vimentin、Snail、Slug抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司，Mdm2抗體購(gòu)自Santa Cruz公司， GAPDH 抗體購(gòu)自Proteintech 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

ALK陽(yáng)性NSCLC H3122細(xì)胞由麻省總醫(yī)院胸部腫瘤中心Jeffrey Engelman教授惠贈(zèng)，用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染前1天，將H3122細(xì)胞接種到6 cm 培養(yǎng)皿中，次日使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染空載體(empty vector，EV)或Mdm2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h后用于功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后，將空載或Mdm2 過(guò)表達(dá)的H3122細(xì)胞以3 000/孔密度接種到96孔板中，次日加入梯度克唑替尼(0、1、10、100、1 000 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后向各孔加入5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h后吸棄上清，DMSO溶解甲瓚結(jié)晶，酶標(biāo)儀讀取各孔490 nm處吸光度值[D(490)]。

1.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后，將空載或Mdm2 過(guò)表達(dá)的H3122細(xì)胞以1 000/孔密度接種到3.5 cm培養(yǎng)皿中，次日待細(xì)胞貼壁后加入終濃度為20 nmol/L 克唑替尼，每3天換液一次，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)約2周有肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆時(shí)停止培養(yǎng)，甲醇—冰醋酸固定細(xì)胞克隆，1% 吉姆薩染液對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行染色。

1.5 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)

常規(guī)制備細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定30 min，Proteinase K溶液室溫孵育5 min，每個(gè)樣本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer室溫孵育30 min，50 μL TdT孵育緩沖液室溫孵育1 h，PBS漂洗后DAPI室溫染色5 min。在熒光顯微鏡下分析各組細(xì)胞爬片，620 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)Alexa Fluor 640紅色熒光，460 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)DAPI藍(lán)色熒光。

A：熒光顯微鏡下檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率；B：Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Mdm2蛋白表達(dá)情況

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞經(jīng)過(guò)藥物處理后使用RIPA裂解液冰上裂解，BCA法檢測(cè)細(xì)胞蛋白樣品濃度，SDS-PAGE凝膠電泳后濕法轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗4 ℃冰箱過(guò)夜孵育后HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8.0繪制統(tǒng)計(jì)圖。兩組比較采用Student’st檢驗(yàn)，以P<0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)Mdm2誘導(dǎo)H3122細(xì)胞克唑替尼耐藥

H3122細(xì)胞為EML4-ALK陽(yáng)性NSCLC，該細(xì)胞對(duì)ALK靶向治療敏感，故本研究主要在H3122細(xì)胞中評(píng)估Mdm2表達(dá)狀態(tài)與克唑替尼敏感性的關(guān)系。在pEGFP-N3表達(dá)載體中插入Mdm2 cDNA序列，構(gòu)建了Mdm2表達(dá)載體，該載體在N端有EGFP序列，可在熒光顯微鏡下觀察目的基因表達(dá)情況。H3122細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-Mdm2編碼質(zhì)?；騪EGFP-N3空載體(EV)質(zhì)粒后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)明亮的綠色熒光，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功(圖1A)，將空載組或Mdm2過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞提取蛋白后，經(jīng)Western blot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Mdm2過(guò)表達(dá)組H3122細(xì)胞Mdm2蛋白表達(dá)量明顯增加，說(shuō)明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖1B)。

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估Mdm2表達(dá)狀態(tài)對(duì)克唑替尼敏感性的影響。結(jié)果顯示：克唑替尼能有效抑制H3122 空載組細(xì)胞增殖，藥物處理48 h估算IC50值約189.5 nmol/L；相反，H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞對(duì)克唑替尼處理不敏感，細(xì)胞可以在低濃度克唑替尼條件下繼續(xù)增殖，估算克唑替尼 IC50值約674.3 nmol/L。加入不同濃度的克唑替尼后，Mdm2 過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞存活率均高于空載組細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。因此，過(guò)表達(dá)Mdm2可以誘導(dǎo)H3122細(xì)胞對(duì)克唑替尼的耐藥性。

a：P<0.05，b：P<0.01，與空載組比較

2.2 Mdm2促進(jìn)H3122細(xì)胞克隆性增殖

MTT實(shí)驗(yàn)僅能反應(yīng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的短期殺傷作用，為了評(píng)估Mdm2誘導(dǎo)克唑替尼耐藥性的作用是否持久穩(wěn)定，將H3122 空載組細(xì)胞和H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞接種培養(yǎng)皿后在低濃度克唑替尼(20 nmol/L)刺激下長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn)DMSO溶劑組H3122 空載組細(xì)胞和H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞均出現(xiàn)克隆性增殖，培養(yǎng)皿中可見(jiàn)大量細(xì)胞克隆(圖3)；經(jīng)克唑替尼處理后H3122 空載組細(xì)胞的增殖被顯著抑制，培養(yǎng)皿中很少形成細(xì)胞克隆，而H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞在克唑替尼存在條件下仍能繼續(xù)生長(zhǎng)，培養(yǎng)2周后仍有較多細(xì)胞克隆形成，說(shuō)明Mdm2過(guò)表達(dá)可以穩(wěn)定持久地誘導(dǎo)H3122細(xì)胞ALK靶向治療耐藥表型。

圖3 平板克隆實(shí)驗(yàn)評(píng)估Mdm2過(guò)表達(dá)對(duì)H3122細(xì)胞克

2.3 過(guò)表達(dá)Mdm2導(dǎo)致H3122細(xì)胞凋亡抵抗

本研究探究了Mdm2誘導(dǎo)的H3122細(xì)胞克唑替尼耐藥是否與凋亡減少有關(guān)。細(xì)胞凋亡過(guò)程通常伴隨DNA斷裂，使用熒光素標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)催化下可連接到凋亡細(xì)胞斷裂DNA 的3’-OH末端，原位顯示發(fā)生凋亡的細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)溶劑DMSO處理組H3122 空載組和H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞幾乎不發(fā)生凋亡，視野下幾乎看不到提示凋亡的紅色熒光(圖4)；1 μmol/L 克唑替尼處理6 h后H3122 空載組細(xì)胞視野下可見(jiàn)大片紅色熒光，說(shuō)明克唑替尼誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，而H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞經(jīng)克唑替尼處理后并未發(fā)生凋亡。故過(guò)表達(dá)Mdm2可以導(dǎo)致H3122細(xì)胞對(duì)克唑替尼耐受，并且對(duì)抗克唑替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖4 TUNEL染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克唑替尼誘導(dǎo)H3122 空載組細(xì)胞和H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡情況

2.4 過(guò)表達(dá)Mdm2誘導(dǎo)H3122細(xì)胞克唑替尼耐藥的機(jī)制探究

上述結(jié)果證實(shí)過(guò)表達(dá)Mdm2可以誘導(dǎo)ALK靶向治療耐藥，那么導(dǎo)致耐藥的具體機(jī)制如何？本研究首先探究了過(guò)表達(dá)Mdm2是否對(duì)PI3K/Akt和MAPK/Erk信號(hào)活化狀態(tài)造成影響。本研究發(fā)現(xiàn)克唑替尼可以有效抑制對(duì)照組H3122 空載細(xì)胞ALK磷酸化，隨著pALK表達(dá)量減少，PI3K/Akt和MAPK/Erk信號(hào)通路也被阻斷，Akt和Erk磷酸化水平被完全抑制(圖5A)；Mdm2過(guò)表達(dá)后PI3K/Akt和MAPK/Erk信號(hào)仍然能被克唑替尼抑制，如圖5A所示，克唑替尼能夠完全抑制H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞ALK、Akt和Erk磷酸化水平，說(shuō)明Mdm2并不是通過(guò)激活PI3K/Akt和MAPK/Erk信號(hào)導(dǎo)致H3122細(xì)胞對(duì)克唑替尼耐藥。

本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Mdm2后H3122細(xì)胞形態(tài)上出現(xiàn)改變：H3122 空載組細(xì)胞大多呈圓形，細(xì)胞間縫隙小，細(xì)胞黏附力強(qiáng)，細(xì)胞聚集成團(tuán)、成片生長(zhǎng)；H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞形態(tài)上呈扁圓形或梭形，細(xì)胞表面有偽足突起樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間粘附不再緊密，細(xì)胞間有縫隙(圖5B)。上述形態(tài)學(xué)特征讓我們聯(lián)想到與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)。

因此，通過(guò)Western blot檢測(cè)了H3122 空載組細(xì)胞和H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞EMT標(biāo)記物的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)H3122 空載組細(xì)胞主要表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-鈣粘素 (E-cadherin)，而轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug處于低表達(dá)狀態(tài)，H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞主要表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白 (Vimentin)，Snail和Slug表達(dá)量明顯增加(圖5C)。因此，過(guò)表達(dá)Mdm2可以誘導(dǎo)H3122細(xì)胞EMT過(guò)程的產(chǎn)生，后者可能促進(jìn)克唑替尼耐藥和凋亡抵抗。

3 討論

越來(lái)越多的ALK陽(yáng)性NSCLC患者從靶向治療中獲益，患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間得到了極大提高，且隨著二代和三代ALK靶向藥物的問(wèn)世，患者的獲益得到進(jìn)一步提高，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間帶瘤生存已成為現(xiàn)實(shí)[10-11]。但是ALK靶向治療的獲得性耐藥不可避免，耐藥機(jī)制尚未完全解析。本研究發(fā)現(xiàn)Mdm2過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)H3122細(xì)胞克唑替尼耐藥表型，并且H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞抵抗克唑替尼誘導(dǎo)的凋亡，過(guò)表達(dá)Mdm2后細(xì)胞發(fā)生EMT，因此認(rèn)為Mdm2有可能通過(guò)改變細(xì)胞上皮細(xì)胞表型促進(jìn)克唑替尼耐藥。

既往對(duì)Mdm2的研究主要關(guān)注它在細(xì)胞周期調(diào)控方面的作用：Mdm2通過(guò)降解p53，減少p21、p16INK4a、p14ARF等下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，增加細(xì)胞周期蛋白cyclin E活性，最終加速細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞分裂[12]。真實(shí)世界研究中Mdm2基因擴(kuò)增在NSCLC發(fā)生率約21%，與年齡、性別、疾病分期和組織學(xué)分級(jí)等臨床病理特征無(wú)明確相關(guān)性，Mdm2擴(kuò)增組患者中位無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS) 3個(gè)月，中位總生存期(overall survival，OS)9個(gè)月，而非擴(kuò)增組中位PFS長(zhǎng)達(dá)31個(gè)月，中位OS 33個(gè)月，說(shuō)明Mdm2表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差[13]。體外研究還發(fā)現(xiàn)Mdm2高表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑等化療藥物的敏感性，可能機(jī)制為Mdm2與胞內(nèi)Topo Ⅱ相結(jié)合下調(diào)其含量，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥敏感性下降，使用RNAi降低胞內(nèi)Mdm2表達(dá)可穩(wěn)定Topo Ⅱ表達(dá)，緩解化療藥物耐受[14]。上述結(jié)果均提示Mdm2參與了腫瘤細(xì)胞分裂、增殖、耐藥等惡性生物學(xué)過(guò)程，因此靶向Mdm2可能作為腫瘤治療的新思路。目前在研的Mdm2抑制劑有Nutlin-3、RG7112、MI-77301、MI-888等，這些小分子抑制劑阻斷Mdm2-p53相互作用從而阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在腫瘤動(dòng)物模型中甚至實(shí)現(xiàn)了腫瘤的完全消退，在人體內(nèi)初步藥代動(dòng)力學(xué)和藥理活性研究亦顯示較好的抗腫瘤活性，主要不良反應(yīng)包括中性粒細(xì)胞減少和腹瀉，后續(xù)可能通過(guò)優(yōu)化藥物劑量來(lái)緩解[15-16]。本研究重點(diǎn)關(guān)注了Mdm2表達(dá)狀態(tài)與ALK靶向治療敏感性之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)Mdm2過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致H3122細(xì)胞克唑替尼耐藥，這與目前已知的ALK靶向治療耐藥機(jī)制不盡相同：①M(fèi)dm2不直接引起ALK磷酸化和ALK總蛋白表達(dá)水平變化，且H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的ALK磷酸化水平能夠有效地被克唑替尼抑制，說(shuō)明Mdm2并不通過(guò)影響ALK信號(hào)通路誘導(dǎo)耐藥；②Mdm2沒(méi)有激酶活性，不能夠像EGFR、c-kit等激酶那樣旁路激活下游PI3K/Akt和MAPK/Erk信號(hào)通路，在Western blot實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)Mdm2過(guò)表達(dá)不能維持Akt和Erk磷酸化。因此，Mdm2過(guò)表達(dá)是誘導(dǎo)克唑替尼耐藥的新機(jī)制。

A：H3122 空載組細(xì)胞和H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞經(jīng)梯度克唑替尼(0、200、500、1 000 nmol/L)處理6 h，Western blot檢測(cè)ALK及下游信號(hào)通路；B：H3122 空載組細(xì)胞和H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；C：Western blot檢測(cè)H3122 空載組細(xì)胞和H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞EMT標(biāo)記物和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況

因此，本研究對(duì)Mdm2誘導(dǎo)的耐藥機(jī)制進(jìn)行了初步探究，特別是H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的改變引起了我們的注意，通過(guò)形態(tài)學(xué)對(duì)比和Western blot，本研究認(rèn)為Mdm2過(guò)表達(dá)的Crizotinib耐藥細(xì)胞發(fā)生了EMT。EMT不僅是細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變，還伴有細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)、細(xì)胞極性改變等，細(xì)胞發(fā)生EMT后細(xì)胞間粘附減弱，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，且表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞特征，對(duì)抗腫瘤治療敏感性下降。而在分子水平，其發(fā)生過(guò)程是上皮細(xì)胞標(biāo)記E-cadherin表達(dá)減少，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記Vimentin表達(dá)增加，細(xì)胞間粘附變?nèi)?，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，逐步浸潤(rùn)周圍組織，并導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在這個(gè)過(guò)程中Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子活性增強(qiáng)，與E-cadherin上游啟動(dòng)子結(jié)合后抑制其轉(zhuǎn)錄[17-18]。在研究中，H3122 Mdm2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Snail和Slug等調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平增加，使E-cadherin轉(zhuǎn)錄受到抑制，細(xì)胞獲得間質(zhì)表型，進(jìn)而對(duì)克唑替尼敏感性下降，出現(xiàn)凋亡抵抗，最終導(dǎo)致克唑替尼耐藥。因此，在靶向治療前評(píng)估Mdm2表達(dá)水平有可能預(yù)測(cè)患者靶向治療效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Mdm2過(guò)表達(dá)有可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞EMT促進(jìn)克唑替尼耐藥，這種全新的耐藥機(jī)制提示臨床上通過(guò)可以檢測(cè)基線狀態(tài)下Mdm2表達(dá)水平預(yù)測(cè)患者后續(xù)出現(xiàn)耐藥的風(fēng)險(xiǎn)，聯(lián)合Mdm2抑制劑有可能逆轉(zhuǎn)ALK靶向治療耐藥。