雞新城疫微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不確定度評(píng)定

張 寧，宋善道，王書麗，李志娟

（1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450003；2.河南國(guó)康檢測(cè)技術(shù)有限公司）

測(cè)量不確定度，簡(jiǎn)稱不確定度，是指根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)（JJF 1059.1-2012）或表示與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性。其結(jié)果為表征結(jié)果的分散性，根據(jù)計(jì)算結(jié)果，其結(jié)果必然為非負(fù)數(shù)。具體而言，不確定度包括由系統(tǒng)影響引起的若干分量。測(cè)量結(jié)果包括估計(jì)值和測(cè)量不確定度，而不確定度反映了測(cè)量結(jié)果的可信程度。

本研究利用HI 試驗(yàn)測(cè)定雞新城疫病毒（NDV）抗體，并對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行了評(píng)定和計(jì)算，提供了測(cè)量過(guò)程中各分量的組成和計(jì)算方法，科學(xué)評(píng)定了此方法的準(zhǔn)確性，以期為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量不確定度評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 8份待檢雞血清，均來(lái)自河南省獸藥飼料監(jiān)察所，均為留樣樣品。

1.1.2 試劑 PBS（0.1mol/L，pH 7.0～7.2），自配；1%雞紅細(xì)胞懸液，采自河南省獸藥飼料監(jiān)察所飼養(yǎng)的無(wú)新城疫SPF 雞血清配制；新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原，購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司，批號(hào)：20210412；新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照，購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司，批號(hào)：20210412；新城疫標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照，購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司，批號(hào)：20210412。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH-420AB），購(gòu)自北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（TGL-16MC），購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器有限公司；移液器（八通道），5～50 μL，購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；移液器，10～100 μL、100～1 000 μL，購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 血凝素工作液配制

血凝素凝集價(jià)測(cè)定：按照表1，對(duì)96孔微量板法布局，用PBS（0.1 mol/L，pH7.0～7.2，下同）將血凝素稀釋成不同倍數(shù)，加入與抑制試驗(yàn)中血清量等量的PBS，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液。將96 孔微量板在振搖器上搖勻，置室溫20～40 min 或置2～8℃40～60 min，當(dāng)對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。以使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

表1 96孔微量板法測(cè)定凝集價(jià) （單位：mL）

1.3.2 血凝素工作液配制及檢測(cè)

1.3.2.1 四單位HAU血凝素的配制

如果血凝素凝集價(jià)測(cè)定結(jié)果為1：1024（舉例），4個(gè)血凝單位（即4HAU）=1024/4=256（即1：256）。取PBS 9.0 mL，加血凝素1.0 mL，即成1：10稀釋，將1：10稀釋液1.0 mL加入24.6 mLPBS中，使最終濃度為1：256。

1.3.2.2 檢測(cè)

檢查4HAU 的血凝價(jià)是否準(zhǔn)確，應(yīng)將配制的1：256 稀釋液分別以1.0 mL 的量加入PBS 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 和6.0 mL 中，使最終稀釋度為1：2、1：3、1：4、1：5、1：6 和1：7。然后，從每一稀釋度中取0.25 mL，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液0.25 mL，混勻。

如果用微量板，方式相同。即從每一稀釋度中取0.025 mL，加入PBS 0.025 mL，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液0.025 mL，混勻。

將血凝板置室溫40 min 或置2～8℃60 min，如果配制的抗原液為4 HAU，則1：4 稀釋度將給出凝集終點(diǎn)；如果4 HAU 高于4 個(gè)單位，可能1：5 或1：6 為終點(diǎn)；如果較低，可能1：2或1：3為終點(diǎn)。應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果將血凝素稀釋度做適當(dāng)調(diào)整，使工作液確定為4 HAU。

1.3.3 血凝抑制試驗(yàn)（HI）

按照表2，對(duì)96孔微量板法布局，PBS將本血清做2倍系列稀釋，加入含4 HAU 的血凝素液，并設(shè)PBS 和血凝素對(duì)照，充分振搖后，置室溫下至少20 min 或在2～8℃下至少60 min，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液，置室溫20～40 min 或置2～8℃40～60 min，當(dāng)對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。以使紅細(xì)胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

表2 96孔微量血凝抑制試驗(yàn) （單位：mL）

2 結(jié)果及分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

式中， Xi—同一血清樣本單次檢測(cè)的新城疫抗體HI效價(jià)（log2）；

n—平行樣數(shù)量；

2.2 測(cè)量結(jié)果

對(duì)8份雞血清進(jìn)行HI重復(fù)性測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 8份雞血清HI重復(fù)測(cè)定結(jié)果表

2.3 不確定度評(píng)定

2.3.1 測(cè)定方法重復(fù)性導(dǎo)致的不確定度ua

對(duì)血清樣品新城疫HI抗體效價(jià)進(jìn)行8次重復(fù)測(cè)定，平均HI效價(jià)為：

實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)差為

2.3.2 由測(cè)量?jī)x器和測(cè)定過(guò)程導(dǎo)致的不確定度ub1

測(cè)定一個(gè)血清樣本需采用200 μl 移液槍進(jìn)行多次操作，其中在96 孔V 型板中加入25 μl PBS 需重復(fù)操作10次，血清的稀釋需用移液器進(jìn)行10 次重復(fù)操作，添加4 HAU抗原需移液槍進(jìn)行10次重復(fù)操作，添加1%雞紅血球移液槍進(jìn)行10次重復(fù)操作。主要考慮以下分量：200 ul移液槍經(jīng)檢定合格，按照《JJG 646-2006移液器檢定規(guī)程》吸取25 μl液體，允許最大誤差為±1 μl，該量為均勻分布，包含因子k=

移液器重復(fù)帶來(lái)的不確定度ub2，取移液槍，精密量取水200 uL，稱重，重復(fù)10次，結(jié)果見表4。

表4 移液器重復(fù)10次檢測(cè)結(jié)果

稱重的標(biāo)準(zhǔn)偏差為Sm=0.7559 g，故S移=0.7559 mL。

溫度效應(yīng)引入的不確定度ub3，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境溫度變化2℃，考慮其對(duì)體積的影響。

整個(gè)過(guò)程需進(jìn)行40 次移液器的重復(fù)操作，所以由測(cè)量?jī)x器和測(cè)定過(guò)程導(dǎo)致的不確定度ub。

2.3.3 人員讀數(shù)導(dǎo)致的不確定度uc

檢測(cè)人員在觀察讀數(shù)時(shí)，因受觀察時(shí)間、操作經(jīng)驗(yàn)以及1%紅血球溶血度等因素的影響，會(huì)產(chǎn)生讀數(shù)誤差。估計(jì)該差a=0.1（log2），為均勻分布，包含因子k=

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

計(jì)算雞新城疫微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)測(cè)定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.5 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=k×u=0.27×2=0.54≈0.6，新城疫微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)HI 效價(jià)為（7.0±0.6）log2，（k=2）。

3 討論

通過(guò)對(duì)構(gòu)成不確定度的各分量進(jìn)行詳細(xì)分析，并分析各分量在整體不確定度值中所占的比例，可直觀了解對(duì)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量影響最大的因素，在對(duì)這些因素針對(duì)性地改進(jìn)后，可以有效提高檢測(cè)質(zhì)量。

本研究評(píng)估結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.27，擴(kuò)展不確定度為0.6，置信水平P=95%，k=2。試驗(yàn)表明，該檢測(cè)不確定度的主要來(lái)源為測(cè)定方法重復(fù)性、移液器、溫度環(huán)境、人員讀數(shù)帶來(lái)的不確定度。在樣品測(cè)量值處于陽(yáng)性判定值附近時(shí)，需要考慮不確定度的存在。該方法可有效評(píng)定雞血清中雞新城疫病毒抗體檢測(cè)結(jié)果的不確定度，可為實(shí)驗(yàn)室在今后的血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)中提供參考?！?/p>